Preparazione di proteine che producono cellule sintetiche utilizzando estratti batterici cell free, liposomi e trasferimento di emulsione

Sommario

Questo protocollo descrive il metodo, i materiali, le attrezzature e i passaggi per la preparazione bottom-up di RNA e proteine che producono cellule sintetiche. Il compartimento acquoso interno delle cellule sintetiche conteneva il lisato batterico S30 incapsulato all'interno di un bistrato lipidico (cioè liposomi stabili), utilizzando un metodo di trasferimento dell'emulsione dell'acqua-in-olio.

Abstract

L'approccio di assemblaggio bottom-up per la costruzione di cellule sintetiche è uno strumento efficace per isolare e studiare i processi cellulari in un ambiente di imitazione cellulare. Inoltre, lo sviluppo di sistemi di espressione senza cellule ha dimostrato la capacità di ricostituire i processi di produzione, trascrizione e traduzione delle proteine (DNA-RNA-proteina) in modo controllato, sfruttando la biologia sintetica. Qui descriviamo un protocollo per la preparazione di un sistema di espressione privo di cellule, compresa la produzione di un potente lisato batterico e incapsulando questo lisato all'interno di vescicle giganti di unilamellar a base di lipidi a base di colesterolo (GUV) (cioè liposomi stabili), per formare cellule sintetiche. Il protocollo descrive i metodi per preparare i componenti delle cellule sintetiche, compresa la produzione di lismi batterici attivi, seguiti da una preparazione dettagliata passo-passo delle cellule sintetiche sulla base di un metodo di trasferimento dell'emulsione acqua-in-olio. Questi facilitano la produzione di milioni di cellule sintetiche in modo semplice e conveniente con un'elevata versatilità per la produzione di diversi tipi di proteine. Le cellule sintetiche ottenute possono essere utilizzate per studiare la produzione e l'attività di proteine/RNA in un ambiente isolato, in evoluzione diretta, e anche come piattaforma di somministrazione controllata di farmaci per la produzione on demand di proteine terapeutiche all'interno del corpo.

Introduzione

Le cellule sintetiche sono particelle artificiali simili a cellule, che imitano una o più funzioni di una cellula vivente, come la capacità di dividere, formare interazioni di membrana e sintetizzare proteine basate su un codice genetico^1,2,3. Le cellule sintetiche che racchiudono sistemi di sintesi proteica priva di cellule (CFPS) possiedono un'elevata modularità grazie alla loro capacità di produrre varie proteine e sequenze di RNA dopo alterazioni nel modello di DNA. Presentando un'alternativa interessante agli attuali approcci di produzione di proteine, i sistemi CFPS si ....

Protocollo

NOTA: l'illustrazione del protocollo di produzione completo delle cellule sintetiche è illustrata nella Figura 1. In base alle esigenze dell'utente, l'espressione proteica (sezione 3.2) e le parti di formazione di cellule sintetiche (sezione 4) del protocollo possono anche essere eseguite in modo indipendente (con alcuni adattamenti).

1. Preparazione di LisaS30-T7

1. Streak placcare i batteri E. coli BL21(DE3) trasformati con la polimerasi T7 RNA che esprime pAR1219 plasmide su una piastra LB-agar integrata con 50 ampicillina di 50 g/mL per ottenere colonie singole.
2. Preparare una soluz....

Risultati

Presentiamo un protocollo per la preparazione di cellule sintetiche incapsulando un sistema S30-T7 CFPS basato su BL21 E. coli all'interno di vescicle lipidiche. Nella figura 2viene presentata una descrizione schematica del processo di preparazione che include un'immagine di ogni fase. Il successo del processo di preparazione delle cellule sintetiche dipende dalle prestazioni appropriate di ogni fase ed eseguito da diversi parametri. Il protocollo deve essere regolato per accogliere.......

Discussione

Questo protocollo introduce un metodo semplice e conveniente per la produzione di grandi quantità di cellule sintetiche che producono proteine. La resa delle cellule attive dipende da un'attenta e accurata esecuzione del protocollo con particolare attenzione a diversi passaggi critici. Nella sezione di preparazione del lisa di questo metodo, è essenziale raggiungere la densità di batteri appropriata prima della lisi cellulare per ottenere una quantità sufficiente di proteine nel lisato batterico. In secondo luogo, il pro.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
A. Reagenti necessari per la fase 1 (preparazione del lisato S30-T7)
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3).
pAR1219	Sigma	T2076	TargeTron vettore per la trasformazione.
Soluzione madre di 50 mg/mL di Ampicillina	Sigma	A9518	Conservato a -20 °C.
10 g/L di Bacto-triptone	BD Bioscience	211705	Per la preparazione della piastra di agar Luria Bertani (LB) (1,5%).
10 g/L di cloruro di sodio (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L di estratto di Bacto-lievito	BD Bioscience	212750
15 g/L Agar agar purificato	Merck	1.01614.5007
50 µ g/mL Ampicillina	Sigma	A9518
10 g/L Bacto-triptone	BD Bioscience	211705	Per la preparazione di terreni Luria Bertani (LB) (20 mL).
10 g/L di cloruro di sodio (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L di estratto di Bacto-lievito	BD Bioscience	212750
50 µ g/mL Ampicillina	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-triptone	BD Bioscience	211705	Per la preparazione di terrific broth (TB) (1 L).
24 g/L di estratto di Bacto-Lievito	BD Bioscience	212750
4% (v/v) Glicerolo anidro	Bio-Lab	7120501
2,32 g/L K2HPO4	Spettro chimico	P1383
12,54 g/L KH2PO4	Spettro chimico	P1380
50 µ g/mL Ampicillina	Sigma	A9518
Soluzione madre di 100 mM di isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Filtrato utilizzando 0,2 µ m filtro per siringa in PVDF idrofilo.
Soluzione madre di 0,1 M di ditiotreitolo (DTT)	TCI	D1071	Filtrato utilizzando 0,2 µ m filtro per siringa in PVDF idrofilo.
10 mM di tris-acetato a pH = 7,4	Sigma	T1503	S30 tampone lisato (1,5 L)
14 mM di acetato di magnesio	Merck	1,05819.0250
60 mM di acetato di potassio	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0,5 mL/L 2-mercaptoetanolo	Sigma	M6250
Attrezzatura necessaria per la fase 1
100 mL sterilizzati Palloni di Erlenmeyer	Thermo Scientific	50-154-2846	2 palloni
2 L sterilizzati Palloni di Erlenmeyer con deflettori	KIMAX-KIMBLE	25630	2 palloni
Agitatore per incubatore da pavimento	MRC	TOU-120-2	Incubatore per agitatore da laboratorio 450x450mm, 400 giri/min, 70 ° C
Centrifuga	Thermo Scientific	75004270	(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Rotore ad angolo fisso. Dovrebbe consentire almeno 13.000 x g.        * Pre-raffreddato a 4 °C.
Omogeneizzatore ad alta pressione	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	Pre-raffreddato a 4 °C.
-80oC congelatore	SO-LOW	U85-18
Provette di plastica sterilizzate da 1,5 mL	Eppendorf	30120086	Preferibilmente pre-raffreddato a -20 °C.
Spettrofotometro	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
piastra trasparente a 96 pozzetti	Thermo Scientific	167008
Cilindro graduato	sterilizzato Corning
Provette da centrifuga sterilizzate	Eppendorf	30120086	Preferibilmente pre-raffreddato a -20 °C.
Puntali per pipette sterilizzati	Corning		Preferibilmente pre-raffreddati a -20 °C.
Secchiello per ghiaccio tritato	Bel-Art	M18848-4001
Piccolo serbatoio di azoto liquido	NALGENE	4150-4000
B. Reagenti necessari per la fase 3 (lipidi nella preparazione della soluzione oleosa):
1-palmitoil-2-oleyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Lipoid	556400
Powder Cholesterol	Sigma	C8667	Polvere
Cloroformio	Bio-Lab	3082301
Olio minerale	Sigma	M5904	Olio leggero
Attrezzatura necessaria per il passaggio 2
Vortex mixer	Industrie scientifiche	SI-0256
Blocco riscaldante	TECHNE	FDB03AD	Preriscaldato a 80 °C. Dovrebbe consentire la temperatura controllata.
Fiale di vetro con collo a vite da 2 mL	Innovazioni analitiche CSI	VT009M-1232	Per una scala più ampia, utilizzare falcon da 50 mL ed evaporare il cloroformio utilizzando l'evaporatore rotante.
Tappo a vite da 9 mm	CSI Analytical Innovations	C395R-09LC
strong>C. Reagenti necessari per la fase 3 (miscele interne e di reazione di alimentazione):
HEPES	Spectrum	H1089	1 M HEPES-KOH (pH = 8) - tampone pH
Idrossido di potassio (KOH)	Frutarom	55290
1 M Acetato di magnesio	Merck	1.05819.0250	Cofattore e stabilizzatore di carica negativa.
1 M Acetato di potassio	Carlo Erba	470147	Stabilizzatore a carica negativa.
5.2 M Acetato di ammonio	Merck	1.01116.1000	Stabilizza la carica negativa.
50% (p/v) Polietilenglicole 6000 (PEG)	Merck	8.07491.1000	Aumenta la concentrazione delle macromolecole.
0,5 M 3-fosfoglicerato (3-PGA)	Sigma	P8877	Fonte di energia secondaria.
50 mM Miscela di aminoacidi I	Sigma	LAA21-1KT	Additivo di aminoacidi. Contiene: 50 mM di ciascuno dei seguenti 17  aminoacidi naturali - alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cisteina, glutammina, acido glutammico, glicina, istidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina e valina.
50 mM Miscela di aminoacidi II	Sigma	LAA21-1KT	Additivo di aminoacidi. Contiene: 50 mM di ciascuno dei seguenti 3 aminoacidi naturali: triptofano, fenilalanina e tirosina.
100 mM Adenina trifosfato (ATP)	Sigma	A3377	Nucleotidi e fonte di energia.
50 mM Guanidina trifosfato (GTP)	Sigma	G8877	Nucleotidi e fonte di energia.
100 mM di uridina trifosfato (UTP)	ACROS ORGANICS	226310010	additivo per nucleotidi.
100 mM Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Induzione dell'espressione genica.
2 M Saccarosio	J.T. Baker	1933078	Generazione di un gradiente di densità.
2 M Glucosio	Sigma	16301	Generazione di un gradiente di densità.
H2O Acqua UltraPura (UPW)	Bio-Lab	2321777500	DNasi &
Lisato S30-T7	_	_	Preparato al passaggio 1.                                                                                                                                             Fonte di trascrizione & translation components. Memorizza a -80 ° c, scongelare sul ghiaccio schiantato appena prima dell'uso.
Stock di plasmidi di DNA a scelta	_	_	Contiene la sequenza per la proteina richiesta. Sotto T7 promotore
D. Attrezzatura necessaria per la fase 4 (preparazione di cellule sintetiche)
Agitatore per incubatore da pavimento o Thermomixer	MRC	TOU-120-2	Incubatore per agitatore da laboratorio 450x450mm, 400rpm, 70 gradi; C
PHMT Grant Bio	PSC18	Thermomixer
Centrifuga	Thermo Scientific	75004270	(75003629) - TX-400 4 x 400mL Rotore a secchio oscillante. Adatto per provette da 15 mL. Preferibilmente secchi oscillanti. Dovrebbe consentire almeno 1000 x g. Pre-raffreddato a 4 °C.
Centrifuga da tavolo	Thermo Scientific	75002420	(75003424) - 24 x 1,5/2,0mL rotore con ClickSeal. Adatto per fiale Eppendorf. Pre-raffreddato a 4 °C.
Miscelatore a vortice	Scientific industries	SI-0256
Secchiello per ghiaccio tritato	Bel-Art	M18848-4001
Fiale di vetro con collo a vite da 2 mL	Innovazioni analitiche CSI	VT009M-1232
Provette di plastica sterili da 15 mL	Thermo Scientific	339651
Provette di plastica sterilizzate da 1,5 mL	Eppendorf	30120086
Puntali per pipette sterilizzati	Corning		Sterilizzato in autoclave.

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