Articolo metodologico

Preparazione di proteine che producono cellule sintetiche utilizzando estratti batterici cell free, liposomi e trasferimento di emulsione

DOI:

10.3791/60829

⸱

27 aprile 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Targeted Drug Delivery and Personalized Medicine Technologies, Department of Chemical Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Norman Seiden Multidisciplinary Program for Nanoscience and Nanotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Interdisciplinary Program for Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive il metodo, i materiali, le attrezzature e i passaggi per la preparazione bottom-up di RNA e proteine che producono cellule sintetiche. Il compartimento acquoso interno delle cellule sintetiche conteneva il lisato batterico S30 incapsulato all'interno di un bistrato lipidico (cioè liposomi stabili), utilizzando un metodo di trasferimento dell'emulsione dell'acqua-in-olio.

Abstract

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L'approccio di assemblaggio bottom-up per la costruzione di cellule sintetiche è uno strumento efficace per isolare e studiare i processi cellulari in un ambiente di imitazione cellulare. Inoltre, lo sviluppo di sistemi di espressione senza cellule ha dimostrato la capacità di ricostituire i processi di produzione, trascrizione e traduzione delle proteine (DNA-RNA-proteina) in modo controllato, sfruttando la biologia sintetica. Qui descriviamo un protocollo per la preparazione di un sistema di espressione privo di cellule, compresa la produzione di un potente lisato batterico e incapsulando questo lisato all'interno di vescicle giganti di unilamellar a base di lipidi a base di colesterolo (GUV) (cioè liposomi stabili), per formare cellule sintetiche. Il protocollo descrive i metodi per preparare i componenti delle cellule sintetiche, compresa la produzione di lismi batterici attivi, seguiti da una preparazione dettagliata passo-passo delle cellule sintetiche sulla base di un metodo di trasferimento dell'emulsione acqua-in-olio. Questi facilitano la produzione di milioni di cellule sintetiche in modo semplice e conveniente con un'elevata versatilità per la produzione di diversi tipi di proteine. Le cellule sintetiche ottenute possono essere utilizzate per studiare la produzione e l'attività di proteine/RNA in un ambiente isolato, in evoluzione diretta, e anche come piattaforma di somministrazione controllata di farmaci per la produzione on demand di proteine terapeutiche all'interno del corpo.

Introduzione

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Le cellule sintetiche sono particelle artificiali simili a cellule, che imitano una o più funzioni di una cellula vivente, come la capacità di dividere, formare interazioni di membrana e sintetizzare proteine basate su un codice genetico1,2,3. Le cellule sintetiche che racchiudono sistemi di sintesi proteica priva di cellule (CFPS) possiedono un'elevata modularità grazie alla loro capacità di produrre varie proteine e sequenze di RNA dopo alterazioni nel modello di DNA. Presentando un'alternativa interessante agli attuali approcci di produzione di proteine, i sistemi CFPS si basano su lisa cellule, componenti purificati o componenti sintetici e comprendono tutti i meccanismi di trascrizione e traduzione necessari per la sintesi proteica come ribosomi, RNA polymerasi, aminoacidi e fonti energetiche (ad esempio, 3-fosforocifo e tripofosfato adenina)4,5,6,7,,8,. L'incapsulamento di un sistema CFPS all'interno di vescicoli lipidi consente la produzione semplice ed efficiente di proteine senza dipendere da una cellula vivente10. Inoltre, questa piattaforma permette la sintesi di peptidi che possono degradare all'interno delle cellule naturali, produzione di proteine tossiche per le cellule viventi, e modificare le proteine con aminoacidi non naturali11,12. Le cellule sintetiche sono state utilizzate come modello per scopi di ricerca studiando i componenti cellulari minimi necessari per consentire la vita cellulare da una prospettiva evolutiva1,13. Le cellule sintetiche sono state utilizzate anche per costruire e implementare circuiti genetici e come modelli per l'evoluzione diretta14,15,16. Altri studi si sono concentrati sulla capacità delle cellule sintetiche di imitare l'attività biologica delle cellule naturali, con l'obiettivo di sostituire le cellule naturali danneggiate, come le cellule beta in pazienti con diabete17. Inoltre, la capacità di questi CFPS che incapsulano le cellule sintetiche di produrre una varietà di proteine terapeutiche illustra il suo potenziale per essere incorporato nell'uso clinico18.

Qui descriviamo un protocollo di laboratorio-scala dal basso verso l'alto (Figura 1) per la produzione di RNA e cellule sintetiche che producono proteine sulla base di un sistema CFPS incapsulato in una vescicola lipidica. Questo dimostra il potenziale uso di piattaforme di cellule sintetiche come nuovi sistemi di somministrazione di farmaci per la produzione in loco di un farmaco terapeutico proteico in vivo19. Studi precedenti hanno studiato l'ottimizzazione della reazione CFPS e i processi di preparazione del lisato cellulare4,8,20. Inoltre, sono state applicate diverse tecniche per la preparazione del liposoma di dimensioni cellulari, come i metodi di stabilizzazione delle goccioline microfluidiche e polimeriche21,22,23, che differiscono anche nella composizione lipida dei liposomi24,25,26. Nel protocollo presentato, le cellule sintetiche vengono prodotte utilizzando un metodo di trasferimento dell'emulsione dell'acqua e dell'olio e il processo di incapsulamento viene eseguito a basse temperature (<4 ))5,10,24,27,28. Queste condizioni lievi sono state trovate per essere favorevoli per mantenere l'integrità bio-funzionale del macchinario molecolare, vale a dire ribosomi e proteine27,29,30. La composizione lipidica delle particelle è costituita sia da colesterolo che da 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC). Il primo si trova in tutte le membrane cellulari dei mammiferi ed è essenziale per la stabilità, rigidità e riduzione della permeabilità della membrana, e quest'ultimo imita la composizione fosforlipide mammifera11,13. La trascrizione cellulare e la macchina molecolare di traslazione vengono estratte dal ceppo BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), che viene trasformato con pAR1219 plasmide sovraesprimendo la polimerasi dell'RNA T7 per aumentare la potenza CFPS e la sintesi proteica. Questo sistema è stato utilizzato per produrre proteine diagnostiche e terapeutiche, con pesi molecolari fino a 66 kDa in vitro e in vivo19,31. Il seguente protocollo fornisce un metodo semplice ed efficace per la produzione del sistema di cellule sintetiche, che può affrontare una vasta gamma di questioni fondamentali associate alla sintesi proteica in natura e può essere utilizzato anche per applicazioni di somministrazione di farmaci.

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Protocollo

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NOTA: l'illustrazione del protocollo di produzione completo delle cellule sintetiche è illustrata nella Figura 1. In base alle esigenze dell'utente, l'espressione proteica (sezione 3.2) e le parti di formazione di cellule sintetiche (sezione 4) del protocollo possono anche essere eseguite in modo indipendente (con alcuni adattamenti).

1. Preparazione di LisaS30-T7

  1. Streak placcare i batteri E. coli BL21(DE3) trasformati con la polimerasi T7 RNA che esprime pAR1219 plasmide su una piastra LB-agar integrata con 50 ampicillina di 50 g/mL per ottenere colonie singole.
  2. Preparare una soluzione di avviamento: inoculare una singola colonia in 5 mL di LB-media integrata con 50 g/mL di ampicillina in un flaastre Erlenmeyer da 100 ml e crescere durante la notte con un frullato di incubazione del pavimento a 250 rpm e 37 . Preparare i duplicati.
  3. Inoculare ogni antipasto da 5 mL separatamente in 500 mL di file multimediali di TB integrati con 50 g/mL di ampicillina in un pallone da 2 L Erlenmeyer con deflettori e coltivarlo con un frullatore da incubatore a 250 giri/m e 37 gradi centigradi fino a raggiungere OD600 di 0,8-1. Monitorare periodicamente utilizzando uno spettrofotometro.
  4. Aggiungere 2-3 mL di 100 mM di riserva IPTG (per raggiungere 0,4 - 0,6 mM) per l'induzione dell'espressione della polimerasi dell'RNA T7 e continuare a far crescere la coltura fino a raggiungere OD600.
  5. Trasferire la soluzione da ogni fiaschetta Erlenmeyer in due tubi di centrifuga sterilizzati da 250 mL.
  6. Centrifugare ciascuno a 7.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.
    NOTA: In questa fase, il pellet batterico può essere conservato a -20 gradi centigradi per alcuni giorni prima di passare ai passi successivi.
  7. Sospendere nuovamente ogni pellet in 250 mL di freddo (4 gradi centigradi) S30 lisato tampone e centrifugare a 7.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
    NOTA: Il buffer lisato S30 viene utilizzato per mantenere la stabilità delle proteine dopo l'esecuzione della lisi cellulare utilizzando l'omogenizzatore nel passaggio 1.9. Da questo passo in avanti, tutte le fasi fino al 1.12 devono essere effettuate consecutivamente e rapidamente.
    NOTA: Prima di procedere al passaggio successivo, pre-raffreddare le punte e le fiale da 1,5 millilitri che saranno necessarie per conservare il lisato
  8. Eliminare il supernatante e sospendere nuovamente tutti i pellet insieme in 15 mL di freddo S30 lysate buffer. Filtrare la sospensione utilizzando il tampone di garza.
    NOTA: 15ml di soluzione è dovuto al volume omogeneo min. Va notato che la concentrazione di batteri è anche importante.
  9. Omogeneizzare a una pressione di lavoro di 15.000 psi, con una pressione dell'aria di 4 bar (due passaggi) per la rottura cellulare. Evitare la diluizione della soluzione per un lisato più concentrato e attivo.
  10. Aggiungere 100 L di 0,1 M DTT (CAUTION) per 10 mL della sospensione omogeneizzata.
  11. Centrifugare la sospensione a 24.700 x g per 30 min a 4 gradi centigradi.
  12. Eseguire rapidamente il seguente passaggio per preservare l'attività del lisa: dividere il supernatale uno ad uno in 200 aliquote in fiale preraffreddate da 1,5 mL e immediatamente bloccare congelarle con azoto liquido. Conservare a -80 gradi centigradi per un ulteriore utilizzo.
    AVVISO: Il DTT è classificato come irritante e dannoso e deve quindi essere trattato con attenzione.

2. Preparazione dei lipidi in una soluzione di olio

  1. Sciogliere POPC e colesterolo nel cloroformio (CAUTION) separatamente, ciascuno ad una concentrazione finale di 100 mg/mL. Vorticare ogni fiala separatamente.
    1. Unire i componenti in una fiala di vetro da 2 mL: aggiungere 50 gradi di POPC in cloroformio, 50 -L di colesterolo nel cloroformio e 500 l'l di olio minerale. Per 100 ll l di cellule sintetiche, sono necessari 2 fiale di lipidi nell'olio.
    2. Vortice, e poi riscaldare per circa 1 h a 80 gradi centigradi in un cappuccio chimico per far evaporare il cloroformio. Assicurarsi che si sia verificata l'evaporazione completa seguendo il tempo/condizioni specificato e monitorando il volume della soluzione.
      NOTA: la soluzione lipidi-in-olio risultante può essere conservata a temperatura ambiente per un massimo di due settimane. Per migliorare i risultati, si consiglia di utilizzare una preparazione fresca prima di ogni esperimento. I rapporti di lipidi e colesterolo possono essere alterati in base alla composizione della membrana desiderata. Un'alta concentrazione di colesterolo può portare alla formazione di aggregati nella soluzione finale delle cellule sintetiche.
      AVVISO: il cloroformio è classificato come irritante e dannoso e deve quindi essere trattato con cura e in aree con estrazione dei fumi.

3. Preparativi di soluzioni esterne, pre-interne e di alimentazione

  1. Preparazione di soluzioni azionarie
    1. Preparare le soluzioni azionarie elencate nella tabella 2 utilizzando acqua ultrapura (UPW).
      NOTA: Le soluzioni stock devono essere preparate in anticipo e conservate a -20 gradi centigradi fino a un ulteriore utilizzo. Il reagente 7 tende a formare aggregati. Il riscaldamento a 37 gradi centigradi ridurrà l'aggregazione. Una leggera aggregazione non influenzerà in modo significativo la reazione. Reagent 8 soluzione è lattiginoso e torbido.
  2. Soluzione esterna
    1. Sciogliere il glucosio in DNase/RNase-free H2O ad una concentrazione finale di 200 mM.
    2. Per 100 l di soluzione interna, preparare 1,6 mL di soluzione esterna.
  3. Soluzione pre-interna
    1. Aggiungere i reagenti 1-14 in base agli importi e alla concentrazione elencati nella tabella 2. Ad esempio, per un volume finale di cellule sintetiche di 100 l, preparare 100 l di soluzione interna.
      NOTA: UPW deve essere aggiunto per completare il volume finale richiesto. In questa fase, la miscela può essere conservata a 4 gradi centigradi per alcune ore.
  4. Soluzione di alimentazione
    1. Aggiungere tutti i reagenti in base agli importi e alla concentrazione elencati nella tabella 3.
      NOTA: utilizzare il rapporto 1:1 della soluzione di alimentazione: soluzione interna. Per un volume finale di cellule sintetiche di 100 l, preparare 100 l di soluzione di alimentazione. Si raccomanda di preparare un piccolo volume in eccesso di soluzione esterna, interna e di alimentazione.

4. Preparazione di cellule sintetiche

NOTA: I seguenti volumi sono regolati per la preparazione di 100 l di cellule sintetiche.

  1. Cellule sintetiche che producono proteine
    1. In un tubo da 15 mL, mettere 12 mL della soluzione esterna e aggiungere lentamente, sopra uno strato, di 500 l di lipidi in soluzione di olio. Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
    2. Per finalizzare la preparazione interna della soluzione: mescolare gli ingredienti interni della soluzione sul ghiaccio tritato fino a un volume finale di 100 gradi l scongelando e aggiungendo S30-T7 Lysate (reagente 15) e plasmide di DNA (reagente 16) alla miscela immagazzinata.
    3. Alla seconda fiala di vetro da 2 mL con 500 litri di lipidi in soluzione ad olio, aggiungere 100 l della soluzione interna. Pipette su e giù vigorosamente per 1 minuto e vortice per un altro minuto al livello cinque.
      1. Incubare per 10 min di ghiaccio tritato e aggiungere lentamente l'emulsione risultante sopra la fase dell'olio nel tubo da 15 mL (da 4.1.1).
    4. Centrifuga per 10 min a 100 x g e 4 gradi centigradi e poi centrifuga per 10 min a 400 x g e 4 gradi centigradi. Alla fine della centrifuga, deve essere osservato un pellet nella parte inferiore del tubo.
      NOTA: L'utilizzo di un rotore di centrifuga a benna oscillante è preferito qui per acquisire una migliore copertura di un secondo strato di lipidi durante il passaggio delle goccioline di acqua-in-olio attraverso l'interfase. Nel caso in cui non ci sia un pellet osservabile, la velocità di centrifugazione può essere aumentata a 1000 x g. In caso contrario, vedere la sezione Discussione che fa riferimento alla gravità specifica della soluzione esterna.
    5. Estrarre il pellet.
      1. Rimuovere lo strato di olio in eccesso.
      2. Utilizzare una punta di pipetta tagliata con circa 400 ll di soluzione esterna per estrarre il pellet. Rilasciare la soluzione esterna passando attraverso la fase dell'olio per raccogliere solo il pellet nella fase acquosa.
        1. Pulire la punta dopo l'estrazione del pellet per evitare il trasferimento di resti di olio e trasferire il pellet in un tubo pulito da 1,5 mL.
    6. Centrifuga per 10 min a 1.000 x g e 4 gradi C, rimuovere il supernatante e sospendere nuovamente il pellet in 100 gradi di soluzione di alimentazione (1:1 rapporto di soluzioni interne:alimentazione).
      NOTA: Anche qui può essere utilizzato un rotore di centrifuga ad angolo fisso.
    7. Per l'espressione proteica, incubare per 2 ore a 37 gradi centigradi senza agitare.
      NOTA: il tempo di incubazione ottimale varia tra le diverse proteine.
    8. Valutare la quantità di proteine prodotta utilizzando un metodo adatto in base alle proprietà della proteina bersaglio.
  2. Gruppi di controllo consigliati
    1. Soluzione interna e conferma dell'attività lysate
      1. Preparare una soluzione interna completa (con DNA e lisato S30-T7).
      2. Immediatamente incubare la reazione di cui sopra utilizzando uno shaker incubatore pavimento a 250 rpm o un termomixer a 1200 rpm, ad una temperatura costante di 37 gradi centigradi per 2 h.
        NOTA: Regolare il tempo di incubazione in modo che corrisponda al tempo di incubazione delle cellule sintetiche.
    2. Cellule sintetiche
      1. Gruppo di controllo negativo: Preparare il protocollo presentato in 4.1 con soluzione interna senza DNA.
      2. Controllo positivo: Preparare il protocollo presentato in 4.1 con soluzione interna contenente una codifica plasmid T7 per un gene reporter.
        NOTA: aggiungere un gruppo di controllo positivo composto da un gene reporter, ad esempio sfGFP, accanto ai gruppi di test per garantire la fase di efficienza di incapsulamento.

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Risultati

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Presentiamo un protocollo per la preparazione di cellule sintetiche incapsulando un sistema S30-T7 CFPS basato su BL21 E. coli all'interno di vescicle lipidiche. Nella figura 2viene presentata una descrizione schematica del processo di preparazione che include un'immagine di ogni fase. Il successo del processo di preparazione delle cellule sintetiche dipende dalle prestazioni appropriate di ogni fase ed eseguito da diversi parametri. Il protocollo deve essere regolato per accogliere...

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Discussione

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Questo protocollo introduce un metodo semplice e conveniente per la produzione di grandi quantità di cellule sintetiche che producono proteine. La resa delle cellule attive dipende da un'attenta e accurata esecuzione del protocollo con particolare attenzione a diversi passaggi critici. Nella sezione di preparazione del lisa di questo metodo, è essenziale raggiungere la densità di batteri appropriata prima della lisi cellulare per ottenere una quantità sufficiente di proteine nel lisato batterico. In secondo luogo, il pro...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da ERC-STG-2015-680242.

Gli autori riconoscono anche il sostegno del Technion Integrated Cancer Center (TICC); il Russell Berrie Nanotechnology Institute; il Lorry I. Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences & Engineering; il Ministero dell'Economia di Israele per una borsa di studio Kamin (52752); Il Ministero israeliano della tecnologia scientifica e dello spazio – Ufficio del Capo Scienziato (3-1878); la Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); l'Associazione europea contro il cancro (2015-0116); la Fondazione tedesco-israeliana per la ricerca scientifica e lo sviluppo di una borsa di studio GIF Young (I-2328-1139.10/2012); il programma IRG FP-7 dell'Unione europea per una sovvenzione per l'integrazione di carriera (908049); il Phospholipid Research Center Grant; una Rosenblatt Foundation for cancer research, una Sovvenzione della Mallat Family Foundation; e la Fondazione unger Family. A. Schroeder riconosce alon e alle borse di studio Taub. O. Adir riconosce le borse di studio Sherman e Gutwirth. G. Chen riconosce la Compagnia Sherman. N. Krinsky riconosce la baronessa Ariane de Rothschild Women Doctoral Program dalla Fondazione Rothschild Caesarea.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
A. Reagenti necessari per la fase 1 (preparazione del lisato S30-T7)
E.coli BL21 (DE3) NEBC2527E.coli BL21 (DE3).
pAR1219SigmaT2076TargeTron vettore per la trasformazione.
Soluzione madre di 50 mg/mL di AmpicillinaSigmaA9518Conservato a -20 °C.
10 g/L di Bacto-triptoneBD Bioscience 211705Per la preparazione della piastra di agar Luria Bertani (LB) (1,5%).
10 g/L di cloruro di sodio (NaCl)Bio-Lab19030591
5 g/L di estratto di Bacto-lievitoBD Bioscience 212750
15 g/L Agar agar purificatoMerck1.01614.5007
50 µ g/mL AmpicillinaSigmaA9518
10 g/L Bacto-triptoneBD Bioscience 211705Per la preparazione di terreni Luria Bertani (LB) (20 mL).
10 g/L di cloruro di sodio (NaCl)Bio-Lab19030591
5 g/L di estratto di Bacto-lievitoBD Bioscience 212750
50 µ g/mL AmpicillinaSigmaA9518
12 g/L Bacto-triptoneBD Bioscience 211705Per la preparazione di terrific broth (TB) (1 L).
24 g/L di estratto di Bacto-LievitoBD Bioscience 212750
4% (v/v) Glicerolo anidroBio-Lab7120501
2,32 g/L K2HPO4Spettro chimicoP1383
12,54 g/L KH2PO4Spettro chimicoP1380
  50 µ g/mL AmpicillinaSigmaA9518
Soluzione madre di 100 mM di isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) INALCOINA-1758-1400Filtrato utilizzando 0,2 µ m filtro per siringa in PVDF idrofilo.
Soluzione madre di 0,1 M di ditiotreitolo (DTT) TCID1071Filtrato utilizzando 0,2 µ m filtro per siringa in PVDF idrofilo.
10 mM di tris-acetato a pH = 7,4SigmaT1503S30 tampone lisato (1,5 L)
14 mM di acetato di magnesioMerck1,05819.0250
60 mM di acetato di potassioCarlo Erba470147
1 mM DTTTCID1071
0,5 mL/L 2-mercaptoetanoloSigmaM6250
Attrezzatura necessaria per la fase 1
100 mL sterilizzati Palloni di ErlenmeyerThermo Scientific50-154-28462 palloni
2 L sterilizzati Palloni di Erlenmeyer con deflettoriKIMAX-KIMBLE256302 palloni
Agitatore per incubatore da pavimentoMRCTOU-120-2Incubatore per agitatore da laboratorio 450x450mm, 400 giri/min, 70 ° C
CentrifugaThermo Scientific75004270(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Rotore ad angolo fisso.
Dovrebbe consentire almeno 13.000 x g.        * Pre-raffreddato a 4 °C.
Omogeneizzatore ad alta pressioneAVESTINEmulsiFlex-C3Pre-raffreddato a 4 °C.
-80oC congelatoreSO-LOWU85-18
Provette di plastica sterilizzate da 1,5 mLEppendorf30120086Preferibilmente pre-raffreddato a -20 °C.
SpettrofotometroTECANIN-MNANOInfinite M200 pro
piastra trasparente a 96 pozzettiThermo Scientific167008
Cilindro graduatosterilizzato Corning
Provette da centrifuga sterilizzateEppendorf30120086Preferibilmente pre-raffreddato a -20 °C.
Puntali per pipette sterilizzatiCorningPreferibilmente pre-raffreddati a -20 °C.
Secchiello per ghiaccio tritatoBel-ArtM18848-4001
Piccolo serbatoio di azoto liquidoNALGENE4150-4000
B. Reagenti necessari per la fase 3 (lipidi nella preparazione della soluzione oleosa):
1-palmitoil-2-oleyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)Lipoid556400
Powder CholesterolSigmaC8667Polvere
CloroformioBio-Lab3082301
Olio mineraleSigmaM5904Olio leggero
Attrezzatura necessaria per il passaggio 2
Vortex mixerIndustrie scientificheSI-0256
Blocco riscaldanteTECHNEFDB03ADPreriscaldato a 80 °C.
Dovrebbe consentire la temperatura controllata.
Fiale di vetro con collo a vite da 2 mLInnovazioni analitiche CSIVT009M-1232Per una scala più ampia, utilizzare falcon da 50 mL ed evaporare il cloroformio utilizzando l'evaporatore rotante.
Tappo a vite da 9 mmCSI Analytical InnovationsC395R-09LC
strong>C. Reagenti necessari per la fase 3 (miscele interne e di reazione di alimentazione):
HEPESSpectrumH10891 M HEPES-KOH (pH = 8) - tampone pH
Idrossido di potassio (KOH)Frutarom55290
1 M Acetato di magnesioMerck1.05819.0250Cofattore e stabilizzatore di carica negativa.
1 M Acetato di potassioCarlo Erba470147Stabilizzatore a carica negativa.
5.2 M Acetato di ammonioMerck1.01116.1000Stabilizza la carica negativa.
50% (p/v) Polietilenglicole 6000 (PEG)Merck8.07491.1000Aumenta la concentrazione delle macromolecole.
0,5 M 3-fosfoglicerato (3-PGA)SigmaP8877Fonte di energia secondaria.
50 mM Miscela di aminoacidi ISigmaLAA21-1KTAdditivo di aminoacidi.
Contiene: 50 mM di ciascuno dei seguenti 17  aminoacidi naturali - alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cisteina, glutammina, acido glutammico, glicina, istidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina e valina.
50 mM Miscela di aminoacidi IISigmaLAA21-1KTAdditivo di aminoacidi.
Contiene: 50 mM di ciascuno dei seguenti 3 aminoacidi naturali: triptofano, fenilalanina e tirosina.
100 mM Adenina trifosfato (ATP)SigmaA3377Nucleotidi e fonte di energia.
50 mM Guanidina trifosfato (GTP)SigmaG8877Nucleotidi e fonte di energia.
100 mM di uridina trifosfato (UTP)ACROS ORGANICS226310010additivo per nucleotidi.
100 mM Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)INALCOINA-1758-1400Induzione dell'espressione genica.
2 M SaccarosioJ.T. Baker1933078Generazione di un gradiente di densità.
2 M GlucosioSigma16301Generazione di un gradiente di densità.
H2O Acqua UltraPura (UPW)Bio-Lab2321777500DNasi &
Lisato S30-T7__Preparato al passaggio 1.                                                                                                                                             Fonte di trascrizione & translation components.
Memorizza a -80 ° c, scongelare sul ghiaccio schiantato appena prima dell'uso.
Stock di plasmidi di DNA a scelta__Contiene la sequenza per la proteina richiesta.
Sotto T7 promotore
D. Attrezzatura necessaria per la fase 4 (preparazione di cellule sintetiche)
Agitatore per incubatore da pavimento o ThermomixerMRCTOU-120-2Incubatore per agitatore da laboratorio 450x450mm, 400rpm, 70 gradi; C
PHMT Grant Bio PSC18Thermomixer
CentrifugaThermo Scientific75004270(75003629) - TX-400 4 x 400mL Rotore a secchio oscillante.
Adatto per provette da 15 mL.
Preferibilmente secchi oscillanti.
Dovrebbe consentire almeno 1000 x g.
Pre-raffreddato a 4 °C.
Centrifuga da tavoloThermo Scientific75002420(75003424) - 24 x 1,5/2,0mL rotore con ClickSeal.
Adatto per fiale Eppendorf.
Pre-raffreddato a 4 °C.
Miscelatore a vorticeScientific industriesSI-0256
Secchiello per ghiaccio tritatoBel-ArtM18848-4001
Fiale di vetro con collo a vite da 2 mLInnovazioni analitiche CSIVT009M-1232
Provette di plastica sterili da 15 mLThermo Scientific339651
Provette di plastica sterilizzate da 1,5 mLEppendorf30120086
Puntali per pipette sterilizzatiCorningSterilizzato in autoclave.
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Riferimenti

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