Il saggio opsono-aderenza è un metodo alternativo al saggio di uccisione opsono-fagocitica per valutare le funzioni opsoniche degli anticorpi nello sviluppo del vaccino.
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Articolo metodologico
Test opsono-aderenza per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo del vaccino contro bacillus anthracis e altri agenti patogeni incapsulati
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il saggio opsono-aderenza è un saggio funzionale che enumera l'attaccamento di agenti patogeni batterici ai fagociti professionisti. Poiché l'aderenza è necessaria per la fagocitosi e l'uccisione, il saggio è un metodo alternativo ai test di uccisione opsono-fagocitica. Un vantaggio del saggio opsono-aderenza è la possibilità di utilizzare agenti patogeni inattivati e linee cellulari di mammiferi, che consente la standardizzazione in più esperimenti. L'uso di un agente patogeno inattivato nel saggio facilita anche il lavoro con agenti infettivi di livello di biosicurezza 3 e altri agenti patogeni virulenti. Nel nostro lavoro, il saggio opsono-aderenza è stato utilizzato per valutare la capacità funzionale degli anticorpi, dai sieri di animali immunizzati con un vaccino a base di capsula di antrace, per indurre l'aderenza del Bacillus anthracis fisso a una linea cellulare di macrofagi del topo, RAW 264.7. La microscopia a fluorescenza automatizzata è stata utilizzata per catturare immagini di bacilli che aderiscono ai macrofagi. L'aumento dell'aderenza è stato correlato con la presenza di anticorpi anti-capsula nel siero. I primati non umani che mostravano alte concentrazioni di anticorpi anti-capsula sierati erano protetti dalla sfida dell'antrace. Pertanto, il saggio opsono-aderenza può essere usato per chiarire le funzioni biologiche degli anticorpi specifici dell'antigene nei sieri, per valutare l'efficacia dei candidati al vaccino e di altre terapie e per servire come possibile correlato dell'immunità.
Introduzione
Riconoscimento, aderenza, internalizzazione e degradazione di un agente patogeno sono parte integrante della fagocitosi1, una via saliente nella risposta immunitaria innata dell'ospite descritta per la prima volta da Ilya Metchnikoff nel 18832,3. I leucociti fagocitici, così come altre cellule del sistema immunitario, sono altamente discriminatori nella loro selezione di bersagli; sono in grado di distinguere tra "non-sé infettivo" e "sé non infettivo" attraverso modelli molecolari associati agli agenti patogeni per il loro repertorio di recettori di riconoscimento dei modelli (PRR)
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Protocollo
In conformità con la legge sul benessere degli animali, la politica del servizio sanitario pubblico e altri statuti e regolamenti federali relativi agli animali e agli esperimenti che coinvolgono animali, la ricerca qui descritta è stata condotta nell'ambito di un protocollo approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. La struttura in cui è stata condotta questa ricerca è accreditata dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali di laboratorio, internazionale e aderisce ai principi indicati nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, Consiglio Nazionale delle Ricerche, 2011
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Risultati
Questa sezione mostra le micrografie rappresentative raccolte durante un esperimento OAA insieme ai risultati che mostrano che l'OAA può essere utilizzato per esaminare la funzione biologica degli anticorpi. Qui, il test è stato utilizzato con successo per valutare l'efficacia di un candidato al vaccino contro l'antrace. È fondamentale verificare lo stato di incapsulamento sui bacilli poiché il poco o nessun incapsulamento li fa aderire alle cellule ospiti, producendo uno sfondo elevato. La figura 1<.......
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Discussione
I vaccini a base di capsule hanno dimostrato di essere efficaci contro numerosi agenti patogeni batterici e molti sono autorizzati perl'uso nell'uomo 25,26,27. Questi vaccini funzionano generando anticorpi mirati alla capsula e molti di questi studi utilizzano l'OPKA per mostrare le funzioni opsono-fagocitichedegli anticorpi 13,14,16,
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno un'associazione commerciale o di altro tipo che potrebbe rappresentare un conflitto di interessi.
Ringraziamenti
J. Chua, D. Chabot e A. Friedlander disegnano le procedure descritte nel manoscritto. J. Chua e T. Putmon-Taylor eseguirono gli esperimenti. D. Chabot ha eseguito l'analisi dei dati. J. Chua scrisse il manoscritto.
Gli autori ringraziano Kyle J. Fitts per l'eccellente assistenza tecnica.
Il lavoro è stato supportato dalla concessione della Defense Threat Reduction Agency CBM. VAXBT.03.10.RD.015, piano numero 921175.
Opinioni, interpretazioni, conclusioni e raccomandazioni sono quelle degli autori e non sono necessariamente approvate dall'esercito degli Stati Uniti. Il contenuto di ques....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,20 & micro; m filtro per siringa (25 mm, cellulosa rigenerata) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 ml (punta Luer-Lok) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 pozzetti piastre nere (piastra #1 per imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldeide | Microscopia elettronica, Hatfield, PA | 15710 | |
| Pallone trattato con coltura tissutale di 75 cm | quadrati Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (polvere) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Estratto di lievito Bacto | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Piastre Blood Agar (TSA con sangue di pecora) | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Raschietto cellulare | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar Piastre per colture cellulari a 96 pozzetti (piastre #2 e 3 per diluizioni) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Vetro di copertura | Microscopia elettronica Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Brodo nutriente | Difco BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alto glucosio | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contiene 4500 mg/L di glucosio, 4 mM di L-glutammina, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (microscopio a fluorescenza) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Siero | fetale bovinoHyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | non irradiato con raggi gamma, non inattivato dal calore |
| Isotiocianato di fluoresceina | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Emocitometro H32713 | |
| (Neubauer migliorato) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| Soluzione di inchiostro di china | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L-glutammina (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | integrare il terreno con 2 mM di L-glutammina aggiuntiva |
| Nikon Eclipse TE2000-U (microscopio composto invertito) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS senza calcio o magnesio | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| piastre di Petri (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | per piastre di agar |
| RAW 264.7 linea cellulare di macrofagi (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Vetrini | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Soluzione di blu di tripano (0,4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Microscopia a scansione laser Zeiss 700 (microscopio confocale) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
Riferimenti
- Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
- Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoolo....
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Ristampe e permessi
