L'obiettivo è frazionare e isolare piccole molecole bioattive, peptidi da un complesso estratto vegetale e proteine da microbi patogeni utilizzando il metodo di messa a fuoco isoelettrica a fase liquida (IEF). Inoltre, sono state identificate le molecole separate e la loro bioattività è stata confermata.
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Articolo metodologico
Separazione delle piccole molecole bioattive, Peptidi da fonti naturali e proteine dai microbi di Preparative Isoelectric Focusing (IEF) Metodo
In questo articolo
Sommario
Abstract
I prodotti naturali derivati da piante e microbi sono una ricca fonte di molecole bioattive. Prima del loro utilizzo, le molecole attive da estratti complessi devono essere purificate per applicazioni a valle. Ci sono vari metodi cromatografici disponibili per questo scopo, ma non tutti i laboratori possono permettersi metodi ad alte prestazioni e l'isolamento da campioni biologici complessi può essere difficile. Qui dimostriamo che la messa a fuoco isoelettrica in fase liquida preparata (IEF) può separare le molecole, tra cui piccole molecole e peptidi da complessi estratti vegetali, in base ai loro punti isoelettrici (pI). Abbiamo usato il metodo per la frazionamento e la caratterizzazione complesse dei campioni biologici. Come prova di concetto, abbiamo frazionato un estratto di pianta di Gymnema sylvestre, isolando una famiglia di salonina terpenoide piccole molecole e un peptide. Abbiamo anche dimostrato un'efficace separazione delle proteine microbiche usando il fungo Candida albicans come sistema modello.
Introduzione
La purificazione delle biomolecole da complessi campioni biologici è un passo essenziale e spesso difficile negli esperimenti biologici1. La messa a fuoco isoelettrica (IEF) è adatta per la separazione ad alta risoluzione di biomolecole complesse in cui gli amplificatori portante viaggiano secondo la loro carica e stabiliscono il gradiente di pH in un campo elettrico3. Il primo amplificatore commerciale per IEF è stato sviluppato da Olof Vesterberg nel 1964 e brevettato4,5. Gli ampifiti portatrici sono molecole di acido oligo-amino-amino-carboxylicia alatoriche a....
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Protocollo
1. Configurazione e pre-esecuzione dell'unità IEF standard in fase liquida
- Assemblare gli elettrodi IEF a fase liquida (pulsante anodo-rosso e pulsante catodo-nero) con le rispettive membrane di scambio secondo il manuale di istruzioni (vedere Tabella dei materiali). E' necessario scambiare le membrane di scambio dell'anione con 0,1 M NaOH e le membrane di scambio di 0,1 M H34 almeno per 16 h quando vengono utilizzate nuove membrane.
- Conservare le membrane negli elettroliti (0,1 M NaOH o 0,1 M H3PO4) tra le rampe e non lasciare asciugare.
- Assemblare la parte interna e....
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Risultati
Separazione e purificazione di piccole molecole e peptidi dall'estratto vegetale di Gymnema sylvestre
Utilizzando il metodo iEF preparativo in fase liquida, abbiamo frazionato estratti vegetali medicinali e proteine della superficie cellulare da un fungo patogeno umano, C. albicans. Uno schema di questi protocolli di frazionamento è illustrato nella Figura 1.
Da 20 frazioni di G. sylvestre estratto ottenuto da Liquid-.......
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Discussione
Le piccole molecole provenienti da fonti di prodotti naturali (ad esempio, piante) includono metaboliti secondari complessi che sono altamente diversificati nella struttura chimica. Si ritiene che siano coinvolti nei meccanismi di difesa delle piante. Inoltre, i polipeptidi sono presenti anche nei tessuti vegetali22. Questi piccoli molecole di prodotto naturale sono ricche fonti di molecole di prova per la scoperta e lo sviluppo di farmaci. Tuttavia, i metodi difficili e noiosi necessari per il lo.......
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Dichiarazioni
Gli autori vorrebbero dichiarare interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Siamo grati per le fonti di finanziamento della Divisionof Biology e Johnson Cancer Research Center per i premi BRIEF e IRA, rispettivamente a GV. Ringraziamo anche il premio post-dottorato K-INBRE al camper. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dall'Institutional Development Award (IDeA) dell'Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Sanità con il numero di sovvenzione P20 GM103418. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dell'Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali o degli Istituti Nazionali di Sanità. Ringraziamo i revisori anonimi per i loro commenti....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,45 & micro; m filtro per siringhe | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoetanolo | Sigma | M3148 | |
| Carbonato di ammonio | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Termostato compatto a bassa temperatura | Lauda - Brinkmann | RM 6T | Imposta il raffreddamento ad acqua a 4 oC e può funzionare anche a 0 oC poiché quando passa attraverso il nucleo di raffreddamento Rotofor, la temperatura dell'acqua circolante sarà di circa 5 o più a seconda della tensione. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Tubo per dialisi (3.500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Estratto di foglie di piante Gymnema in polvere (>25% di acidi gimnemici) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubatore | Compagno di laboratorio | SI 300R | |
| Microscopio | Leica | DM 6B | |
| Mini proteiforme elettroforesi | PHmetro Bio-Rad | ||
| Mettler Toledo | S20 | Utile per determinare il pH delle frazioni Rotofor (IEF in fase liquida) | |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Manuale di istruzioni per il montaggio dell'unità) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Nastro sigillante | Bio-Rad | 170-2960 | È possibile utilizzare anche lo scotch. |
| Sorvall legend micro 17 centrifuga | Thermo scientific | 75002432 | |
| piastra per coltura tissutale TPP -96 pozzetti fondo piatto | TPP | TP92696 |
Riferimenti
- Jankowska, U., et al. Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).
- Pergande, M. R., Cologna, S. M. Isoelectric Poin....
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Ristampe e permessi
