Le ciglia primarie sono strutture extracellulari associate al centriole. Il rilevamento delle ciglia primarie mediante colorazione immunofluorescente è una procedura relativamente semplice che si traduce in immagini di altissima qualità. In questo protocollo, i fibroblasti che esprimevano ciglia primarie sono stati fissati, immunizzati e immagini in un microscopio fluorescente o confocale.
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Articolo metodologico
Semplice rilevamento delle ciglia primarie per immunofluorescenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le ciglia primarie sono regolate dinamicamente durante la progressione del ciclo cellulare, in particolare durante le fasi G0/G1 del ciclo cellulare, che vengono riassorbite prima della mitosi. Le ciglia primarie possono essere visualizzate con metodi altamente sofisticati, tra cui la microscopia elettronica a trasmissione, l'imaging 3D o l'utilizzo di un software per il rilevamento automatico delle ciglia primarie. Tuttavia, per eseguire questi metodi è necessaria una colorazione immunofluorescente delle ciglia primarie. Questa pubblicazione descrive un protocollo per la facile rilevazione delle ciglia primarie in vitro colorando la tubulina alfa acetilatata (axoneme) e la tubulina gamma (corpo basale). Questo protocollo di colorazione immunofluorescente è relativamente semplice e si traduce in immagini di alta qualità. Il presente protocollo descrive come quattro linee cellulari (C2C12, MEF, NHLF e fibroblasti cutanei) che esprimono ciglia primarie sono state fissate, immunizzate e immagini con un microscopio fluorescente o confocale.
Introduzione
Le ciglia primarie sono strutture sensoriali, solitarie, legate alla membrana e nonmotile associate alla centriola madre della cellula. Le ciglia primarie si trovano sulla maggior parte delle cellule vertebrate, ad eccezione dei globuli rossi, degli adidociti1e degli epariti2. Le ciglia primarie sono formate come un asceone allungato composto da microtubuli, il cui componente principale è la tubulina. L'ascia cresce dal corpo basale, strutturato γ-tubulina. La lunghezza delle ciglia primarie varia tra 2 e 10 m; tuttavia, le sue dimensioni possono cambiare durante la glicilazione, la fame, l'ipossia, lo stress citotossico....
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Protocollo
1. Preparazione di mezzi di coltura, soluzioni e piatti
- Autoclave le copertine (22 x 22 mm). Preparare 6 piastre di pozzo. Scongelare il siero bovino fetale (FBS) e la penicillina/streptomicina antibiotica e riscaldare la temperatura ambiente media e ambiente di coltura (RT). Utilizzare trypsin-EDTA (0,25%) e 1x PBS (fosfato tamponato salino con calcio e magnesio) per passare le cellule.
- Preparare la paraformaldeide fresca del 4% (PFA) in dH2O (800 mg di PFA in 20 mL di dH2O). Il PFA deve essere preparato per ogni esperimento. Mescolare e riscaldare la soluzione a 55 gradi centigradi per 30 minuti nel cofano. Raffreddare a RT.....
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Risultati
La colorazione immunofluorescente delle ciglia primarie è una procedura relativamente semplice che si traduce in immagini di alta qualità. In questi esperimenti, i fibroblasti che esprimevano ciglia primarie erano fissati, immunosorizzati e ritrattati in un microscopio fluorescente o confocale seguendo il protocollo sopra descritto. Il cilium primario è stato rilevato utilizzando l'acetilata tubulina e γ-tubulina. La valutazione delle ciglia primarie può essere eseguita su vari livelli e qualsiasi cambiamento in questo s.......
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Discussione
Diversi autori hanno descritto diversi metodi per il rilevamento delle ciglia primarie, a volte anche descrivendo vari metodi di fissazione che possono influenzare il lororilevamento 6,20,21,22. Indipendentemente da ciò, è difficile trovare un protocollo completo e diretto per il rilevamento. La disponibilità di tale metodo sarebbe indubbiamente di grande aiuto per lo studio dell'indagine prima.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Difesa della Repubblica Ceca - Piano di sviluppo dell'organizzazione a lungo termine Aspetti medici delle armi di distruzione di massa della Facoltà di Scienze della salute militare, Università della Difesa; il Ministero dell'Istruzione, della Gioventù e dello Sport, repubblica Ceca (Progetto di Ricerca Specifico n. Grazie anche a Daniel Diaz per la sua gentile assistenza nella revisione in lingua inglese.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra a 6 pozzetti | TPP | 92406 | Dimensioni 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')? Frammento di capra anti-coniglio IgG |
| anti-tubulina &; gamma; | Sigma-Aldrich | T5192 | Coniglio policlonale anti-topo IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (topo) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-topo IgG (molecola intera) F(ab′)2 frammento– Anticorpo Cy3 prodotto negli ovini |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´ s Aquila modificata&acuto; s medium | Thermo Scientific | 11960044 | Glicemia alta, Senza glutammina, Gibco |
| Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato | Sigma-Aldrich | D8662 | con MgCl2 e CaCl2, filtrato in modo sterile, adatto per colture cellulari |
| Siero fetale bovino | Thermo Scientific | 16000044 | filtrato in modo sterile, Gibco |
| L-Glutammina | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Fibroblasto embrionale di topo |
| Tubulina monoclonale anti-acetilata | Sigma-Aldrich | T7451 | Anticorpo monoclonale anti-tubulina acetilata prodotto in topo |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Fibroblasti polmonari primari (umani) |
| Siero di capra normale | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Polvere |
| Penicillina-Streptomicina | Sigma-Aldrich | P0781 | 10.000 unità di penicillina e 10 mg di streptomicina per mL in 0,9% NaCl, Shortly-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Fibroblasti cutanei | Gentilmente donato dall'Università Carolina, Facoltà di Medicina di Hradec Krá amorevole. | ||
| Slip di copertura quadrati | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Vetro borosilicato, 22x22mm, Quadrato |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Tripsina-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Filtrato Sterile, Gibco |
Riferimenti
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
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Ristampe e permessi
