Articolo metodologico

Un modello epiteliale bronchiale interfaccia aria-liquido per un'esposizione realistica e ripetuta all'inalazione alle particelle trasportate dall'aria per i test di tossicità

DOI:

10.3791/61210

⸱

13 maggio 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Institute for Public Health and the Environment (RIVM), 2Institute for Risk Assessment Sciences (IRAS)

In questo articolo

Sommario

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Descritto è il metodo di coltura cellulare e di esposizione di un modello bronchiale in vitro per un'esposizione realistica e ripetuta all'inalazione alle particelle per le prove di tossicità.

Abstract

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Per le prove di tossicità delle particelle trasportate dall'aria, sono stati sviluppati sistemi di esposizione aria-liquido (ALI) per test in vitro al fine di imitare condizioni di esposizione realistiche. Ciò pone esigenze specifiche ai modelli di coltura cellulare. Molti tipi di cellule sono influenzati negativamente dall'esposizione all'aria (ad esempio, essiccazione) e rimangono vitali solo per pochi giorni. Questo limita le condizioni di esposizione che possono essere utilizzate in questi modelli: di solito concentrazioni relativamente elevate vengono applicate come una nuvola (cioè goccioline contenenti particelle, che si depositano rapidamente) in un breve periodo di tempo. Tali condizioni sperimentali non riflettono un'esposizione realistica a lungo termine a basse concentrazioni di particelle. Per superare questi limiti è stato studiato l'uso di una linea cellulare epiteliale bronchiale umana, Calu-3. Queste cellule possono essere coltivate in condizioni ALI per diverse settimane pur mantenendo una morfologia sana e un monostrato stabile con giunzioni strette. Inoltre, questo modello bronchiale è adatto per testare gli effetti di esposizioni ripetute a basse concentrazioni realistiche di particelle trasportate dall'aria utilizzando un sistema di esposizione ALI. Questo sistema utilizza un flusso d'aria continuo in contrasto con altri sistemi di esposizione ALI che utilizzano una singola nebulizzazione che produce una nuvola. Pertanto, il sistema di flusso continuo è adatto per l'esposizione ripetuta e prolungata alle particelle trasportate dall'aria, monitorando continuamente le caratteristiche delle particelle, la concentrazione di esposizione e la dose erogata. Nel complesso, questo modello bronchiale, in combinazione con il sistema di esposizione continua al flusso, è in grado di imitare condizioni realistiche e ripetute di esposizione all'inalazione che possono essere utilizzate per i test di tossicità.

Introduzione

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I polmoni sono vulnerabili all'esposizione all'inalazione di particelle trasportate dall'aria. Per valutare la potenziale tossicità delle particelle trasportate dall'aria, sono stati compiuti progressi per sviluppare sistemi di esposizione all'interfaccia aria-liquido (ALI)1,2,3,4,5. I sistemi di esposizione ALI consentono modelli di esposizione più pertinenti e realistici rispetto all'esposizione sommersa tradizionale tramite mezzo di coltura che altera le caratteristiche e la cinetica delle particelle6. I sistemi di esposizione ALI vengono richiesti in modo specifico ai modelli di coltura cellulare, in quanto i modelli mancano di mezzi di coltura e quindi di nutrienti sul lato apicale. Molti modelli cellulari sono influenzati negativamente dall'essere coltivati ed esposti all'aria (ad esempio, essiccazione) e rimangono vitali solo per pochi giorni. Questo limita le condizioni di esposizione che possono essere utilizzate in questi modelli: di solito concentrazioni relativamente elevate vengono applicate in un breve periodo di tempo come nuvola (cioè goccioline contenenti particelle, che si depositano rapidamente). Tali condizioni sperimentali non riflettono un'esposizione realistica a lungo termine a basse concentrazioni di particelle; pertanto, la pertinenza dei risultati può essere messa in discussione. Per superare questi limiti, è stato ottimizzato il protocollo di coltura ed esposizione per un modello bronchiale costituito dalla linea cellulare epiteliale bronchiale umana Calu-37.

La maggior parte dei modelli polmonari in vitro utilizzati per l'esposizione all'ALI contiene altre linee cellulari come A549, BEAS-2B e 16HBE14o- (16HBE) o cellule primarie come base8. Queste linee cellulari hanno lo svantaggio di rimanere vitali solo per pochi giorni quando coltivate all'ALI. Inoltre, alcune di queste linee cellulari vengono sovrascritte quando coltivate per un periodo superiore a 5 giorni. Infine, le cellule A549 mancano di giunzioni funzionali strette e quindi non possono formare una barriera stretta necessaria perimitare i polmoni 9,10. Le cellule epiteliali primarie potrebbero essere una buona opzione per l'esposizione all'ALI in quanto possono essere coltivate all'ALI per settimane. Tuttavia, le cellule primarie differiscono da lotto a lotto, sono più difficili da mantenere e sono più costose rispetto alle linee cellulari, il che le rende meno adatte per i test di tossicità e lo screening. Quando si confrontano diverse linee cellulari epiteliali bronchiali umane (16HBE, Calu-3, H292 e BEAS-2B), solo le cellule Calu-3 soddisfano tutti i criteri necessari per un'esposizione ali realistica e ripetuta: rimangono vitali per settimane mentre coltivate all'ALI, forniscono un'elevata integrità barriera, non fanno crescita eccessiva e sono facili da coltura e mantenere. Le cellule calu-3 provengono da un adenocarcinoma e sono in grado di produrre muco11,12. Ci sono incongruenze sul fatto che le cellule possano sviluppare ciglia11,13. Le cellule Calu-3 sono anche un modello adatto per studiare le infezioni da virus respiratorio sinciziale (RSV) che infettano le cellule epiteliali delle vie aeree ciliate14.

Oltre al modello cellulare, viene utilizzato un sistema di esposizione automatizzato (AES) per l'esposizione aria-liquido agli aerosol15,16. L'AES ha il vantaggio di utilizzare un flusso d'aria continuo per esporre il modello cellulare agli aerosol. Questo è in contrasto con altri sistemi di esposizione aria-liquido che di solito usano concentrazioni relativamente elevate in un breve periodo di tempo come nube (cioè goccioline contenenti particelle che si depositano rapidamente)17,18,19. Questi sistemi cloud non riflettono un'esposizione realistica a lungo termine a basse concentrazioni di particelle. Applicando un flusso d'aria continuo utilizzando l'AES, il modello cellulare può essere esposto a una bassa concentrazione di particelle per un periodo di tempo più lungo, riflettendo condizioni di esposizione realistiche. Un altro vantaggio rispetto ai sistemi cloud è che l'AES ha la possibilità di collegare strumenti di caratterizzazione delle particelle, consentendo la misurazione delle dimensioni delle particelle, della concentrazione dei numeri e della massa nel tempo. Una limitazione dell'AES è che utilizza flussi d'aria relativamente elevati tra 10 mL/min e 100 mL/min.

Protocollo

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1. Preparazione del supporto di coltura cellulare (CCM)

  1. Preparare una bottiglia da 500 ml di mezzo essenziale minimo (MEM) integrata con glutammina.
  2. Aggiungere 5 mL di penicillina-streptomicina (cioè 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina).
  3. Aggiungere 5 mL di soluzione di amminoacidi non essenziali (NEAA).
  4. Aggiungere 10 mL di ampotericina B (opzionale).
  5. Aggiungere 50 mL di FBS (inattivato dal calore, seguire il protocollo ATCC per l'inattivazione del calore; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guide/AnimCellCulture_Guide.ashx, pagina 19)).

2. Sottocultura delle cellule calu-3

NOTA: Le cellule Calu-3 sono coltivate in contenitori di coltura cellulare T75 o T175 a 37 °C e al 5% di CO2. Le cellule vengono passaggio al 60-80% di confluenza ogni 7 giorni con rinnovo ccm ogni 2-3 giorni. CCM viene versato e CCM fresco (T25 = 5 mL, T75 = 15 mL e T175 = 25 mL) viene pipettato nel pallone e il pallone viene riposto nell'incubatore. Le cellule devono essere passaggio almeno 2 volte dopo lo scongelamento, prima dell'uso negli esperimenti o prima del congelamento, e devono essere passaggio non più di 25 volte in totale.

  1. Verificare se il pallone è confluente al 60-80% controllando al microscopio luminoso.
  2. Versare il CCM dal pallone.
  3. Lavare le cellule 2 volte con 5 mL di 1x Hanks's Balanced Salt Solution (HBSS) senza calcio e senza magnesio. Scartare l'HBSS dopo ogni lavaggio. HBSS rimuove il siero, che inibisce la tripside.
  4. Aggiungere 3 ml di tripside-EDTA per un T75 (4 mL per un T175) e riposizionare il pallone nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2 per 10-15 min. Controllare dopo 10 minuti, assicurandosi che le cellule si siano staccate dalla superficie del pallone. Nel caso in cui le cellule siano coltivate fino a >80% di confluenza, non si staccano usando tripina 0,05% e potrebbe essere utilizzata tripina 0,25%.
  5. Aggiungere 6 mL (cioè raddoppiare il volume trypsin-EDTA originariamente aggiunto) di CCM al pallone e scuotere delicatamente i contenitori per garantire una corretta miscelazione. Questo per garantire che la tripina sia stata neutralizzata dall'FBS nel CCM e la sua attività sulle cellule si sia fermata. Se la tripina può rimanere a contatto con le cellule per troppo tempo, non si riattaccano quando vengono messe in un nuovo pallone di coltura cellulare.
  6. Versare il contenuto completo del pallone in un tubo di centrifuga da 50 ml.
  7. Centrifugare le cellule per 5 min a 130 x g,assicurando che la centrifuga sia correttamente bilanciata.
  8. Riportare la fiala contenente le cellule in condizioni asettiche e rimuovere delicatamente il supernatante, senza disturbare il pellet. Il supernatante può essere versato e il resto è stato sganciato, assicurando che il pellet non sia disturbato.
  9. Rimescolare il pellet cellulare in 1 mL di MCC tubazione su e giù fino a quando tutte le cellule non sono sospese (cioè non si osservano agglomerati di pellet o cellule). È possibile aggiungere CCM aggiuntivo per diluire la sospensione cellulare.
  10. Contare le cellule, sia morte che vive, in 1 mL di MCC usando un emocitometro. Se necessario per un corretto conteggio, diluire le cellule in 3 o 4 mL.
  11. Sospendere le celle nel volume CCM richiesto e aggiungere la sospensione cellulare in ogni pallone. Per ottenere circa l'80% di confluenza in una settimana, seminare 2 x 106 cellule in un T75 o 6 x 106 cellule in un T175.
  12. Dondolare delicatamente il pallone e quindi riposizionare nell'incubatrice a 37 °C e 5% CO2.
  13. Sostituire con CCM fresco ogni 2-3 giorni e sottocultura quando le cellule raggiungono la confluenza del 60-80%.

3. Semina di celle Calu-3 su inserti di coltura

NOTA: Gli inserti sono disponibili con diverse dimensioni dei pori. Le piccole dimensioni dei pori (ad esempio, 0,4 μm) hanno il vantaggio che le cellule crescono più facilmente e possono raggiungere una buona barriera già dopo 5 giorni di coltivazione in condizioni sommerse, come misurato dalla resistenza elettrica epiteliale trans (TEER). Tuttavia, quando sono interessati alla traslocazione delle particelle, questi pori sono troppo piccoli e intrappolano le particelle. Pertanto, le dimensioni dei pori più grandi (ad esempio, 3 μm) sono solitamente scelte per testare le particelle. Quando si utilizza una dimensione dei pori più grande, le cellule hanno bisogno di periodi di tempo più lunghi (ad esempio, 7-10 giorni di coltivazione in condizioni sommerse) per ottenere un buon TEER.

  1. Preparare la sospensione cellulare con concentrazione nota seguendo i passaggi 2.1–2.10.
  2. Diluire le cellule a una concentrazione di 5 x 105 celle/mL in CCM prebellico per 6 inserti di pozzi o 2,5 x 105 celle/mL per 12 inserti di pozzi.
  3. Prendere una piastra di coltura cellulare con inserti e posizionare in condizioni asettiche.
  4. Riempire il lato basolaterale con 2 mL di CCM prebellico per 6 inserti di pozzo, o 1 mL per 12 inserti di pozzo. Durante l'aggiunta del supporto di coltura, esettare l'inserto utilizzando una pinzetta.
  5. Mescolare con cura la sospensione cellulare pipettando su e giù. Pipetta 1,0 mL per 6 inserti di pozzo e 500 μL per 12 inserti di pozzi (equivalenti a 100.000 celle/cm2)sulla parte superiore dellamembrana nell'inserto di coltura cellulare con pori da 0,4 μm. Per i pori da 3,0 μm, aumentare la densità cellulare a 128.000 cellule/cm2.
  6. Coprire la piastra di coltura cellulare e incubare a 37 °C e 5% CO2.
  7. Modificare il CCM ogni 2-3 giorni.
  8. Lasciare che le cellule diventino confluenti per 7 giorni in condizioni sommerse prima di continuare a coltura all'ALI.
  9. Misurare TEER.
    1. Prendi un voltohmmetro epiteliale integrato con il set di elettrodi a bacchetta e carica il sistema di batterie durante la notte.
    2. Scollegare il Voltohmmeter dal caricabatterie e collegare l'elettrodo della bacchetta.
    3. Pulire l'elettrodo con il 70% di etanolo.
    4. Posizionare l'elettrodo nel CCM inserendo l'elettrodo più lungo nel supporto di coltura esterno fino a quando non tocca il fondo del piatto e mettendo l'elettrodo più corto nel supporto senza toccare la membrana.
    5. Iniziare con un inserto vuoto senza celle. Attendere che la misurazione si stabilizzi e annotare la resistenza in Ohm. Questa misurazione è la resistenza della membrana dell'inserto senza cellule (cioè resistenza al vuoto).
    6. Ripetere la misurazione per ogni inserto e sottrarre la resistenza del vuoto per ottenere la vera resistenza.
    7. Per l'analisi dei dati, moltiplicare i valori di resistenza per la superficie dell'inserto Ω x cm2. Per un inserto di 6 po', la superficie è di 4,67 cm2. Pertanto, se viene misurata una resistenza di 600 Ohm e lo sfondo è 120 Ohm, la resistenza è di 480 Ohm, che viene quindi moltiplicata per la superficie di 4,67 cm2 per un totale di 2.241,6 Ohm x cm2. Il TEER deve essere >1.000 Ω x cm2 per continuare.
  10. Rimuovere il CCM dal lato apicico degli inserti.
  11. Aggiungere 2 mL di CCM prebellico per 6 pozza e 1 mL per 12 inserti di pozzo sul lato basolaterale del pozzo (cioè sotto l'inserto di coltura cellulare). Il CCM deve toccare la membrana dal basso, ma non perdere sulla parte superiore dell'inserto.
  12. A questo punto le cellule sono apicalmente esposte all'aria, che viene definita ristrutturazione all'ALI.
  13. Cellule di coltura presso l'ALI nell'incubatore a 37 °C e 5% CO2 per 7 giorni prima dell'esposizione.
  14. Cambiare il CCM basolaterale ogni 2-3 giorni. Le cellule possono essere utilizzate presso l'ALI per 6 settimane.

4. Preparazione dell'impostazione dell'esposizione

NOTA: Le sezioni da 5 a 7 descrivono i preparati per l'esposizione alle particelle mediante una stazione di esposizione automatizzata (AES, vedi Tabella dei materiali). La configurazione per la nebulizzazione e la caratterizzazione delle particelle è anche compatibile con altri sistemi di esposizione ALI di altri produttori. Ad esempio, l'esposizione alle particelle è descritta di seguito. Tali sistemi possono anche essere utilizzati per altre esposizioni, come sensibilizzanti, fumo di sigaretta e scarico diesel. La figura 1 mostra l'AES e un modulo di esposizione. La figura 2 mostra una rappresentazione schematica dell'impostazione dell'esposizione, compresi tutti gli altri strumenti.

  1. Prima di iniziare un'esposizione utilizzando l'AES, collegare il sistema a diversi strumenti per misurare le caratteristiche dell'aerosol; questi vengono misurati in un flusso laterale poco prima che gli aerosol entrino nell'armadio.
    NOTA: uno splitter di flusso viene utilizzato per collegare il flusso laterale all'apparecchiatura di caratterizzazione dell'esposizione. Generalmente, vengono utilizzate le seguenti apparecchiature: scanning mobility particle sizer (SMPS), optical particle sizer (OPS), condensation particle counter (CPC), tapered element oscillante microbalance (TEOM). Le misurazioni SMPS e OPS vengono eseguite 1 volte all'ora e utilizzano gli stessi tubi dello splitter di flusso. CPC e TEOM eseguono misurazioni continue e i dati di entrambi sono registrati su un data logger Squirrel model 2020. Inoltre, la concentrazione di massa gravimetrica viene determinata utilizzando un microbilanciamento nell'umidità relativa controllata (40-70%) temperatura (21-23 °C). I filtri in teflon vengono pesati prima e dopo ogni esposizione per confermare la concentrazione di esposizione. Per catturare lo scarico, viene utilizzato un filtro HEPA. La configurazione, comprese le sospensioni e il nebulizzatore in nanomateriale ingegnerizzati (ENM), è tutta posizionata in un armadio di flusso per prevenire qualsiasi esposizione alle persone. L'AES può essere utilizzato per testare molti tipi diversi di ENM, tra cui metalli e ossidi metallici.
  2. Preparare una sospensione di nanomateriali poco prima dell'esposizione. Di solito una sospensione dell'1% viene preparata come soluzione stock. Ad esempio, sospendere 100 mg di nanomateriale in 10 mL di acqua pura.
    NOTA: Per l'esposizione al DQ12, 300 mg vengono utilizzati per raggiungere circa 2 μg/cm2. Questa quantità può essere utilizzata in una singola esposizione o divisa su esposizioni ripetute (ad esempio, 300 mg sono sospesi in 30 mL per una singola esposizione o 21,5 mg sono sospesi in 2,15 mL appena al giorno per 3 settimane di esposizione ripetuta). La sospensione viene preparata al momento in ogni giorno di esposizione. La sospensione delle particelle viene sonicata per 16 minuti utilizzando la sonicazione della sonda. Il volume della soluzione stock dell'1% viene regolato in un volume totale di 100 mL aggiungendo acqua pura.
  3. Mettere la sospensione ENM in una piccola bottiglia con un tappo e un agitatore magnetico per evitare la sedimentazione delle particelle. Collegare il flacone a una pompa peristaltica tramite un piccolo tubo e regolare il flusso a 25 mL/h.
  4. Collegare la pompa peristaltica a un ugello di spruzzatura e regolare le impostazioni per consentire l'aerosolizzazione continua.
  5. L'ugello di spruzzatura è montato su un tubo di alluminio lungo 60 cm (camera di miscelazione, diametro 15 cm, riscaldato a 60 °C). La configurazione è collegata all'AES tramite un tubo di rame lungo 1,5 metri (diametro 15 cm). Sopra l'AES un impactor rimuove tutti gli aerosol più grandi di 2,5 μm.
  6. Collegare l'ugello di spruzzatura all'aria compressa a 3 barre attraverso due controller di flusso di massa (MFC) per consentire la nebulizzazione delle sospensioni. Un flusso di 14 L/min viene utilizzato per l'ugello di spruzzatura, l'altro MFC per la miscelazione dell'aria nel tubo.
  7. Il giorno prima dell'inizio dell'esposizione, accendere l'AES per consentire all'armadio di raggiungere una temperatura di 37 °C.
  8. Accendere il flusso d'aria e l'umidità nell'armadio 2 ore prima dell'inizio dell'esposizione, per raggiungere l'85% di umidità. Accendere il riscaldamento delle camere di esposizione in cui verranno posizionati gli inserti con le celle.
  9. Accendere il microbilanciamento al quarzo (QCM) e impostare il valore iniziale su 0 utilizzando il software. Avviare la registrazione. Ogni 10 s la massa viene misurata ed espressa come ng/cm2.
  10. Riscaldare il supporto di coltura cellulare a 37 °C in un bagno d'acqua (~ 20-30 minuti).

5. Preparazione delle cellule Calu-3 per l'esposizione

NOTA: Per una tipica esposizione ALI utilizzando l'AES, sono necessari 15-20 inserti con uno strato di cella confluente. Si tratta di 3 controlli dell'aria pulita, 3 comandi dell'incubatore che verranno gestiti in modo simile agli altri inserti senza esposizione nell'AES, 6-8 inserti per l'esposizione all'aerosol (a seconda dell'uso di 0, 1 o 2 microbilanciamenti), 1-3 inserti per le misurazioni di controllo (come il massimo rilascio di LDH) e 3 inserti di ricambio nel caso in cui il TEER di alcuni degli inserti non sia sufficiente. Le celle devono avere un TEER di >1.000 Ω x cm2 per continuare.

  1. Il primo giorno di esposizione, lavare le celle 1x con CCM, controllare la morfologia delle cellule e misurare il TEER del modello cellulare utilizzando un Voltohmmeter. Le cellule dovrebbero formare un monostrato stretto senza spazi vuoti.
  2. Mettere 2 mL/1 mL di CCM tamponato HEPES senza FCS sul lato basolaterale di 6 piastre di pozzo ben/12 e trasferire gli inserti di coltura con le celle alle nuove piastre.
    NOTA: Durante l'esposizione non è presente alcuna CO2 nell'AES. Pertanto, il mezzo di coltura tamponato HEPES (25 mM HEPES) viene utilizzato durante il trasporto e l'esposizione. Questo mezzo viene utilizzato sia per le cellule esposte nell'AES che per le celle di controllo dell'incubatore.
  3. Nel caso in cui il tempo di trasporto delle colture cellulari nell'AES sia superiore a 5 minuti, mettere le celle in un incubatore portatile di 37 °C durante il trasporto.

6. Gestione dell'AES durante un'esposizione

  1. All'AES, riempire i moduli di esposizione con CCM tamponato con HEPES senza siero fetale di vitello (FCS). La quantità di CCM dipende dall'unità utilizzata e dal tipo di inserimento delle impostazioni cultura delle celle. Tieni presente che per mantenere le cellule all'ALI, il mezzo dovrebbe raggiungere il fondo della membrana, ma non dovrebbe fuoriuscire sulla parte superiore della membrana. Quando si utilizzano 6 inserti di pozzo, aggiungere 6 mL di CCM tamponato da HEPES ai moduli di esposizione.
  2. Trasferire gli inserti con le celle dalle piastre ai moduli di esposizione utilizzando pinzette sterili. Verificare che non vi siano bolle d'aria sul lato basolaterale delle cellule e rimuovere qualsiasi CCM sul lato apicali degli inserti. Nel caso in cui ci siano alcune bolle d'aria sul lato basolaterale, ruotare delicatamente gli inserti usando le pinzette sterili fino a quando non vengono rimosse. Conservare le piastre contenenti CCM in un'incubatrice per il trasferimento dopo un'esposizione.
  3. Usa il display touchscreen per scegliere la durata dell'esposizione, la portata d'aria e il miglioramento della deposizione elettrostatica. Il display può essere utilizzato anche per controllare l'umidità e la temperatura. Di solito si preleva una durata di esposizione di 4 ore, con una portata di 50 mL/min sugli inserti a 37 °C e umidità dell'85%.
    NOTA: I moduli di primo livello (figura1) sono utilizzati perl'esposizione all'aria pulita; gli inserti in questo livello vengono utilizzati come controlli di esposizione all'aria pulita. Gli altri moduli del secondo e terzo livello possono essere utilizzati per l'esposizione all'aerosol, inclusi due moduli per microbilanciamenti di cristallo di quarzo (QCM) per misurare la deposizione online.
  4. La prova di tenuta deve essere effettuata prima di iniziare l'esposizione. La perdita deve essere inferiore a 5 mL/min. Seguire le istruzioni sul display AES. Al termine del test di tenuta, è possibile iniziare l'esposizione. In caso di perdita, il tubo deve essere controllato.
  5. Al termine dell'esposizione, aprire la porta di un modulo AES, aprire i moduli di esposizione, posizionare gli inserti di coltura cellulare nelle piastre di coltura cellulare e trasferire le piastre all'incubatore portatile.
  6. Raccogliere il supporto dai moduli (cioè campioni esposti) e dalle piastre (cioè i controlli dell'incubatore) per un'analisi successiva, come la misurazione della lattato deidrogenasi (LDH).
  7. Di nuovo al laboratorio di coltura cellulare, trasferire gli inserti di coltura cellulare su lastre riempite con CCM standard fresco. Mettere le piastre di coltura cellulare nell'incubatore fino alla successiva esposizione o fino all'analisi.
  8. Dopo il giorno finale dell'esposizione, mettere gli inserti nell'incubatore fino al giorno successivo.
  9. Il giorno dopo l'esposizione finale, aggiungere CCM al lato apicico per misurare TEER utilizzando un Voltohmmeter. Raccogliere separatamente sia la CCM apicale che la CCM basolaterale per l'analisi delle citochine.
  10. Rimuovere tutti i CCM ed eseguire un saggio di vitalità cellulare aggiungendo, ad esempio, un reagente di proliferazione sul lato apicale.

7. Pulizia dell'AES

  1. Riempire i moduli di esposizione con acqua, attendere 1 minuto e rimuovere l'acqua. Quindi, riempire i moduli con il 70% di etanolo, lasciarlo per 10 minuti e rimuovere l'etanolo. Pulire le trombe di esposizione anche con il 70% di etanolo.
  2. Interrompere il controllo dell'umidità dell'85%, ma lasciare la temperatura dell'armadio a 37 °C per l'esperimento successivo.

Risultati

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Questo articolo fornisce un metodo per coltivare ed esporre le cellule epiteliali bronchiali umane all'ALI che imita condizioni realistiche e ripetute di esposizione all'inalazione che possono essere utilizzate per i test di tossicità. Le caratteristiche sia del modello cellulare che del sistema di esposizione sono essenziali per ottenere un modello realistico di esposizione all'inalazione che può essere utilizzato per esposizioni ripetute. Di seguito sono riportati i risultati di queste caratteristiche.

Requisiti e selezione del modello di cella

Quando si seleziona un modello di cella adatto, si devono prendere in considerazione le seguenti caratteristiche:

  1. Il modello cellulare dovrebbe essere in grado di formare un monostrato confluente con giunzioni strette funzionanti per imitare la barriera polmonare.
  2. Il modello di cella deve mostrare prestazioni ottimali se esposto ripetutamente all'aria condizionata (temperatura e umidità).
  3. Il modello cellulare deve rispondere a un'esposizione.

Questo studio è iniziato con quattro diverse linee cellulari epiteliali bronchiali umane: 16HBE, Calu-3, H292 e BEAS-2B. Questi sono tutti ampiamente utilizzati per i test di tossicità di nanomateriali e sostanze chimiche. Delle quattro linee cellulari, solo le celle Calu-3 soddisfacevano tutti i requisiti di cui sopra. Le celle formavano un monostrato con giunzioni strette (Figura 3) che rimaneva una barriera stabile nel tempo misurata dal TEER, mentre le altre linee cellulari non formavano una barriera o mostravano una caduta della funzione barriera quando coltivate all'ALI(Figura 4). Inoltre, H292 e BEAS-2B tendevano a sovraboscorsi in più strati cellulari quando coltivati per un periodo di tempo più lungo. La tradizionale coltivazione cellulare sommersa e la ristrutturazione ALI differivano notevolmente, perché al ALI i nutrienti erano disponibili solo dal lato basolaterale e le cellule erano esposte a condizioni asciutte sul lato apicale. Queste condizioni possono causare stress ai modelli cellulari, che potrebbero essere osservati misurando la vitalità cellulare nel tempo. Le linee cellulari 16HBE, H292 e BEAS-2B hanno mostrato un aumento del rilascio di LDH quando coltivate all'ALI, mentre le celle Calu-3 hanno mostrato solo un leggero rilascio di LDH (Figura 5).

Successivamente, è stata testata la risposta del modello Calu-3 alle sostanze. Come sostanza di controllo positiva, l'LPS è stato somministrato tramite nebulizzazione sul lato apicale del modello. La dose depositata era di 0,25 μg/cm2. Le cellule calu-3 hanno mostrato una reazione al lipolisaccaride (LPS) da un aumento del rilascio di LDH e del rilascio del fattore alfa della necrosi tumorale (TNF-α) (Figura 6).

Infine, il monostrato Calu-3 è stato esposto a nanomateriali di silice di quarzo (DQ12) (IOM, Edimburgo). La silice cristallina può indurre silicosi e può anche causare tumori polmonari. Pertanto, l'Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro (IARC) ha classificato la silice cristallina come cancerogena umana del Gruppo I20. Si pensa che il meccanismo d'azione della silice cristallina sia attraverso l'induzione di infiammazione persistente causata dalla sua superficiereattiva 21,22,23. Diversi studi in vivo su ratti e topi riportano l'induzione di infiammazioni e cambiamenti istopatologia, tra cui tumori e fibrosi, dopo l'esposizione per inalazione alla silicecristallina 24,25,26,27,28,29. Questi effetti sono tutti osservati dopo ripetute esposizioni e/o follow-up a lungo termine. Il modello Calu-3 è stato utilizzato per studiare se le osservazioni degli studi in vivo potessero essere mimickate utilizzando un modello in vitro che potesse essere esposto ripetutamente all'ALI.

Le cellule Calu-3 sono state esposte per 3 settimane consecutive, 5 giorni alla settimana, 4 ore al giorno al DQ12. La dose depositata è stata misurata utilizzando un QCM. La dose media depositata era di 120 ng/cm2 al giorno, con una dose cumulativa di 1,6 μg/cm2, simile alle dosi che inducono un effetto in vivo. Altre caratteristiche delle particelle sono indicate nella tabella 1. Dopo 3 settimane di esposizione, DQ12 non ha indotto effetti significativi nel rilascio di TEER, vitalità cellulare e proteina chemioattrice monocita 1 (MCP-1), rispetto ai controlli dell'aria pulita(Figura 7). Poiché era prevista una maggiore tossicità del DQ12 sulla base dei dati in vivo, la reattività delle particelle è stata controllata utilizzando un saggio cellulare secondo il protocollo ottimizzato all'interno del progetto UE GRACIOUS (risultato finale 5.3). La reattività del lotto DQ12 è stata inferiore al previsto (Figura 8), ordini di grandezza inferiori rispetto alle particelle di controllo positive carbon black (CB). Questa mancanza di reattività potrebbe spiegare l'assenza di una risposta di tossicità nel modello Calu-3.

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Figura 1: Stazione di esposizione automatizzata (AES).
La figura sinistra mostra l'esterno dell'armadio con il pannello a sfiorare. L'AES ha tre livelli con moduli di esposizione: il livello superiore per le esposizioni all'aria pulita e il livello medio e inferiore per le esposizioni aerosol. La figura giusta mostra il modulo di esposizione in cui sono posizionati gli inserti con le celle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Rappresentazione schematica dell'impostazione dell'esposizione.
Da sinistra a destra: 1) la sospensione ENM collegata all'ugello di spruzzatura tramite una pompa peristaltica; 2) Utilizzando aria compressa l'ugello di spruzzatura nebulizza la sospensione ENM e tramite una camera di miscelazione gli aerosol vengono portati all'AES; 3) Poco prima di entrare nell'AES, sono collegati strumenti di caratterizzazione aerosol: SMPS, OPS, CPC e TEOM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Immagine rappresentativa delle cellule Calu-3 dopo la coltivazione all'interfaccia aria-liquido (ALI) per 10 giorni.
Immagine di microscopia a fluorescenza delle cellule Calu-3 dopo la coltivazione all'ALI per 10 giorni. La proteina di giunzione stretta ZO-1 è macchiata di verde, i nuclei delle cellule sono macchiati di blu. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Resistenza elettrica transepiteliale (TEER) di quattro diverse linee cellulari durante un periodo di coltura di 21 giorni.
Valori TEER di 16HBE, Calu-3, H292 e BEAS-2B se coltivati per 21 giorni: primi 7 giorni sommersi, seguiti da 14 giorni all'ALI. I valori TEER sono stati corretti per la resistenza di fondo dell'inserto e moltiplicati per l'area di superficie dell'inserto. I simboli e le barre di errore rappresentano il valore medio e la deviazione standard di sei inserti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Rilascio LDH di quattro diverse linee cellulari durante un periodo di coltura di 21 giorni.
Rilascio LDH di 16HBE, Calu-3, H292 e BEAS-2B se coltivato per 21 giorni: 7 giorni sommersi, seguito da 14 giorni all'ALI. I valori LDH visualizzati sono relativi alla versione massima di LDH per tipo di cella. I simboli e le barre di errore rappresentano il valore medio e la deviazione standard di cinque inserti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-6
Figura 6: Effetti cellulari nelle cellule Calu-3 esposte a LPS.
Le cellule Calu-3 sono state esposte tramite nebulizzazione delle nubi a 0,25 μg/cm2 LPS. (A) Conversione WST-1. (B) Rilascio LDH. (C) Rilascio di TNF-α dopo l'esposizione all'LPS. I simboli e le barre di errore rappresentano valori medi e deviazioni standard di tre inserti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-7
Figura 7: Effetti cellulari nelle cellule Calu-3 esposte ai nanomateriali DQ12.
Le cellule calu-3 sono state esposte per 3 settimane (4 ore al giorno, 5 giorni alla settimana) a nanomateriali DQ12, circa 120 ng/cm2 al giorno, dose cumulativa di 1,6 μg/cm2. (A) Valori TEER. (B) Rilascio LDH. (C) rilascio MCP-1 dopo l'esposizione a DQ12. Tutti i simboli e le barre di errore rappresentano valori medi e deviazioni standard di tre inserti per i controlli e sei inserti per l'esposizione al DQ12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-8
Figura 8: Reattività cellulare di DQ12.
DQ12 è stato incubato con una sonda 2ʹ,7ʹ-Diclorofluoresceina Diacetato (DCFH-DA) per rilevare la sua reattività superficiale. Come controllo positivo, sono state incluse particelle di nero fumo (CB). Rispetto a CB, DQ12 ha una reattività superficiale molto bassa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Massa particellare (μg/m3)Numero di particelle (#/cm3)Dimensione delle particelle di mobilità (nm)Deviazione standard geometricaDimensione ottica delle particelle (μm)
2969 (418)83983 (10215)66.62.51.1 (1.3)

Tabella 1: Caratteristiche di esposizione al DQ12. I valori sono indicati come media con deviazione standard tra parentesi quadre.

Discussione

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Questo articolo descrive un metodo per coltivare cellule epiteliali bronchiali umane sotto ALI ed esporre questo modello bronchiale ad aerosol o gas. Il vantaggio dell'uso delle cellule Calu-3 è che formano giunzioni strette, rimangono un monostrato, sono in grado di resistere al flusso d'aria e possono essere coltivate per settimane all'ALI, a differenza di molti altri tipi di cellule (ad esempio, 16HBE, H292 e BEAS-2B). L'utilizzo dellastazione ® esposizione automatizzata vitrocell (AES) ha il vantaggio che le cellule possono essere esposte in condizioni realistiche e rilevanti in quanto basse concentrazioni possono essere applicate utilizzando un flusso d'aria continuo.

I sistemi a flusso continuo, come l'AES, hanno vantaggi rispetto all'utilizzo di sistemi cloud3,32, che utilizzano un'unica nebulizzazione di una sospensione. Il flusso continuo è più realistico e molte variabili come portata, umidità e temperatura sono controllate. Inoltre, la deposizione può essere migliorata utilizzando un campo elettrico. Infine, le caratteristiche dell'aerosol come dimensioni, concentrazione del numero e massa vengono monitorate online. Uno svantaggio è che i sistemi di flusso continuo sono più complessi rispetto ai sistemi cloud. Pertanto, è importante eseguire esperimenti preparatori che si concentrano sulle caratteristiche delle particelle dell'aerosol e sulla dose erogata sull'inserto. La concentrazione iniziale iniziale delle particelle e le impostazioni AES possono quindi essere regolate per ottenere la dose desiderata sulle cellule33. A seconda del tipo di particelle testate, il metodo di generazione dell'aerosol può differire. L'uso della deposizione elettrostatica dipende dal tipo di particella e funziona meglio per le particelle metalliche. Per le particelle con una carica superficiale positiva deve essere applicato un campo elettrostatico negativo e viceversa.

La selezione delle concentrazioni di esposizione può essere difficile per qualsiasi esperimento di esposizione aria-liquido. Per le esposizioni al DQ12, l'obiettivo era quello di raggiungere una dose cumulativa totale di 1 μg/cm2 dopo 3 settimane di esposizione, 5 giorni alla settimana, 4 ore al giorno. Questa dose è simile alle dosi che hanno indotto un effetto in vivo21,25,27,32,33. Durante l'esecuzione delle esposizioni, c'è stata una certa variazione tra i diversi giorni di esposizione. Sebbene la dose effettiva depositata di 1,6 μg/cm2 sia superiore a quella di 1 μg/cm2 che era stata mirata, la dose potrebbe essere stata troppo bassa per osservare gli effetti nel modello Calu-3. Sono state osservate solo piccole differenze nella risposta al TEER, alla vitalità e alla citochina tra l'esposizione all'aria pulita e l'esposizione al DQ12, e queste differenze non erano statisticamente significative. Una spiegazione per l'osservazione che l'esposizione al DQ12 per 3 settimane non ha prodotto effetti significativi nelle cellule Calu-3 è che i macrofagi mancavano dal modello Calu-3. Probabilmente, dopo l'assorbimento del DQ12, i macrofagi producono citochine proinfiammatorie che possono influenzare le cellule calu-3. Un'altra spiegazione è che il batch DQ12 utilizzato per gli esperimenti non era reattivo come previsto. Quando si utilizza LPS come sostanza di controllo positiva, Calu-3 mostra una risposta, misurata da un aumento del rilascio di LDH e da un aumento del rilascio di TNF-α. Ciò indica che il modello è in grado di rilevare la tossicità.

Il modello di cella Calu-3 presenta molti vantaggi, come discusso nella sezione risultati. Inoltre, se coltivate più a lungo all'ALI, le cellule calu-3 possono coltivare strutture simili a ciglia /ciglia13 e produrre muco11,12,13. Nonostante questi vantaggi, il modello ha dei limiti rispetto alla sua rilevanza fisiologica. Le linee cellulari Calu-3 provengono da un adenocarcinoma, mentre 16HBE e BEAS-2B provengono da tessuti sani. Sfortunatamente, questi ultimi due non sono adatti per l'esposizione ripetuta all'ALI in quanto non rimangono un monostrato stabile nel tempo. Un'altra limitazione del modello Calu-3 è che rappresenta solo un singolo tipo di cella. Nel polmone umano sono presenti più tipi di cellule che interagiscono e rispondono in modo diverso all'esposizione. Le particelle inalato si depositeranno in diverse regioni dei polmoni a seconda delle loro dimensioni aerodinamiche. È qui che le particelle contattano la barriera cellulare epiteliale, come minato dal modello Calu-3. Nel polmone umano, i macrofagi alveolari sono attratti dalle particelle, le inghiottiscono e le liberano dai polmoni. I macrofagi svolgono anche un ruolo essenziale nella risposta infiammatoria all'esposizione alle particelle. Pertanto, si stanno compiendo sforzi per estendere il modello Calu-3 aggiungendo macrofagi primari per imitare più da vicino la barriera polmonare. Lo svantaggio dei macrofagi è che rimangono vitali solo per circa 7 giorni quando coltivati sopra le cellule Calu-3 dell'ALI. Pertanto, i macrofagi devono essere letti settimanalmente per trasformare l'attuale modello Calu-3 in un modello di cocultura. L'ottimizzazione del protocollo di cocultura è attualmente in corso.

Dato quanto sopra, il modello bronchiale Calu-3 è un modello adatto per l'esposizione ripetuta ad aerosol di sostanze parzialmente solubili come sostanze chimiche dal fumo di sigaretta e LPS. Queste sostanze solubili inducono aumenti significativi delle risposte delle citochine nelle cellule calu-3. Per testare particelle insolubili come lo scarico diesel e il DQ12, è necessario un modello di cocoltura, perché i macrofagi svolgono un ruolo cruciale nell'induzione degli effetti dall'esposizione alle particelle.

Per le esposizioni descritte, sono state utilizzate membrane inserte con pori da 3,0 μm. Il motivo principale per scegliere questo tipo di inserto è che è possibile testare la traslocazione dei nanomateriali. Quando si utilizza una dimensione dei pori di 0,4 μm più piccola, gli agglomerati di particelle non saranno in grado di attraversare la membrana dell'inserto. Lo svantaggio dell'uso di una grande dimensione dei pori è che le cellule hanno bisogno di un tempo più lungo per diventare confluenti e che è più difficile visualizzare la morfologia delle cellule usando la microscopia ottica. Per verificare che le celle formino un monostrato confluente, il TEER deve essere >1.000 Ω x cm2 prima di iniziare un'esposizione.

Nel complesso, il modello bronchiale Calu-3 qui presentato è adatto all'uso per l'esposizione ripetuta agli aerosol, almeno fino a 3 settimane. Il modello può resistere alla coltura e all'esposizione attraverso un flusso d'aria continuo ed è in grado di rilevare la tossicità per l'epitelio bronchiale.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è finanziato dal progetto DELL'UE PATROLS (Physiologically Anchored Tools for Realistic nanomaterial hazard aSsessment) e dal Ministero olandese della Salute, del Benessere e dello Sport (progetto V/050012). Vorremmo ringraziare la Dott.ssa Yvonne Staal e il Dr. Jan van Benthem per aver esaminato criticamente il manoscritto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0.01 M NaOHSigma AldrichS5881
0.1M (x10) PBSGibco14200-059
2',7'-diclorodiidrofluoresina diacetato (DCFH2-DA)Sigma AldrichD6883
3-Morpholinosydnonimine cloridrato (SIN-1 cloridrato)Abcamab141525
Amfotericina BThermo Fisher Scientific Inc.15290
Stazione di esposizione automatizzataVitrocell
Reagente per la proliferazione cellulare WST-1Roche11644807001
CentrifugeEppendorf
CPCTSI inc., St Paul MN, USA3022
Kit di rilevamento di citotossicità LDHRoche11644793001
DQ12IOMnanomateriali
ELISA Ready-SET-GoFischer Scientific88-8086-86, 88-7399-88
EVOM2World Precision Instruments Inc., FL, USAEVOM2-STX2
FBSGreiner bio-one758093
Separatore di flussoTSI inc., St Paul MN, USAmodello 3708
Diacetato di fluoresceina (F-DA)Sigma AldrichF7378
HBSSThermo Fisher Scientific Inc.14175
Microscopio otticoOlympusCKX41
Regolatori di flusso di massaMFC, Bronkhorst, Paesi Bassi
Metanolo (grado analitico)Sigma Aldrich34860
MicrobalanceSartorius, Goettingen, GermaniaME-5
Mezzo minimo essenziale (MEM) + GlutaMAXThermo Fisher Scientific Inc. 41090
NEAAThermo Fisher Scientific Inc.11140
OPSTSI inc., St Paul MN, USA3339
Pen/StrepThermo Fisher Scientific Inc.15140
Senza rosso fenolo MEMGibco10500-064
Acqua puraMerckMilliQ
SMPSTSI inc., St Paul MN, USA3936
Ugello di spruzzaturaSchlick, Coburgo, Germania
Filtri in teflonPallR2PJ46
TEOMRupprecht & Patashnick NY, USAserie 1400
Pallone per coltura tissutaleThermo Fisher Scientific Inc.690175, 658175, 660175
Inserti TranswellCorning3460, 3462
Tripsina-EDTAThermo Fisher Scientific Inc.25300
Tryptan BluSigma AldrichT8154

Riferimenti

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