Attivazione optogenetica delle vie afferenti nelle fette cerebrali e modulazione delle risposte mediante anestetici volatili

Summary

Le fette di cervello ex vivo possono essere utilizzate per studiare gli effetti degli anestetici volatili sulle risposte evocate agli input afferenti. L'optogenetica è impiegata per attivare indipendentemente afferenze talamocorticali e corticocorticali alla neocorteccia non primaria, e le risposte sinaptiche e di rete sono modulate con isoflurano.

Abstract

Gli anestetici influenzano la coscienza in parte attraverso le loro azioni sui circuiti talamocorticali. Tuttavia, la misura in cui gli anestetici volatili influenzano i componenti cellulari e di rete distinti di questi circuiti rimane poco chiara. Le fette di cervello ex vivo forniscono un mezzo attraverso il quale i ricercatori possono sondare componenti discreti di reti complesse e districare potenziali meccanismi alla base degli effetti degli anestetici volatili sulle risposte evocate. Per isolare potenziali effetti farmacologici specifici del tipo di cellula e del percorso nelle fette di cervello, i ricercatori devono essere in grado di attivare in modo indipendente le vie delle fibre afferenti, identificare popolazioni di cellule non sovrapposte e applicare anestetici volatili al tessuto in soluzione acquosa. In questo protocollo, vengono descritti metodi per misurare le risposte optogeneticamente evocate a due vie afferenti indipendenti alla neocorteccia in fette di cervello ex vivo. Le risposte extracellulari vengono registrate per l'attività della rete di test e le registrazioni mirate del patch clamp dell'intera cellula sono condotte in interneuroni positivi alla somatostatina e alla parvalbumina. Viene descritto il rilascio di concentrazioni fisiologicamente rilevanti di isoflurano attraverso il liquido cerebrospinale artificiale per modulare le risposte cellulari e di rete.

Introduction

Gli anestetici volatili sono stati utilizzati ovunque in una varietà di contesti clinici e accademici per più di un secolo. Classi distinte di anestetici hanno bersagli molecolari unici, spesso non sovrapposti, ^1,2,3, ma quasi tutti producono incoscienza. Mentre i loro effetti comportamentali sono abbastanza prevedibili, i meccanismi con cui gli anestetici inducono la perdita di coscienza sono in gran parte sconosciuti. Gli anestetici possono infine influenzare sia il livello che il contenuto della coscienza attraverso azioni sui circuiti corticotalamici, interrompendo l'integrazione delle informazioni in tutta la gerarchia corticale 4,5,6,7,8,9. Più in generale, la modulazione dei circuiti corticotalamici può svolgere un ruolo negli stati sperimentali¹⁰ o farmacologicamente 11 alterati di coscienza, e può anche essere implicata nel sonno 12 e nei disturbi fisiopatologici della coscienza^13,14.

L'elusività dei meccanismi alla base della perdita e del ritorno della coscienza durante l'anestesia può essere attribuita in parte ad azioni non lineari e sinergiche degli anestetici a livello cellulare, di rete e di sistema¹⁵. L'isoflurano, ad esempio, sopprime l'attività all'interno delle regioni cerebrali selezionate 16,17,18, altera la connettività tra regioni cerebrali distanti ^{19,20,21,22,23} e diminuisce le risposte sinaptiche in modo specifico del percorso ^24,25 . Quali effetti degli anestetici, dal livello molecolare a quello sistemico, siano necessari o sufficienti per effettuare la perdita di coscienza rimane poco chiaro. Oltre alle indagini cliniche sostanziali della coscienza utilizzando tecniche non invasive 19,20,26^, è importante che gli sperimentatori cerchino di districare le distinte interazioni cellulari e di rete che servono l'esperienza cosciente.

Semplificando le complesse interazioni presenti nel cervello intatto, le fette di cervello ex vivo consentono lo studio di componenti isolati dei sistemi dinamici del cervello⁹. Una preparazione ridotta delle fette combina i vantaggi delle strutture anatomiche relativamente intatte dei circuiti neurali locali con la versatilità delle manipolazioni in vitro. Tuttavia, fino a poco tempo fa, vincoli metodologici hanno precluso lo studio delle proprietà sinaptiche e circuitali degli input a lungo raggio nelle fette cerebrali^27,28; Il percorso tortuoso dei tratti di fibre corticotalamici rendeva quasi impossibile l'attivazione di vie afferenti indipendenti mediante stimolazione elettrica.

Studiare gli effetti degli agenti anestetici sui preparati delle fette di cervello presenta ulteriori sfide. In assenza di un sistema respiratorio e circolatorio intatto, gli agenti anestetici devono essere applicati in bagno e le concentrazioni devono essere accuratamente abbinate alle concentrazioni stimate nel sito di effetto. Per molti anestetici per via endovenosa, il lento tasso di equilibrio nel tessuto rende laboriose le indagini farmacologiche tradizionali^29,30. Studiare gli effetti degli anestetici gassosi volatili nei preparati ex vivo è più trattabile, ma presenta anche delle sfide. Questi includono la conversione di dosi a pressione parziale inalate in concentrazioni acquose e la necessità di un sistema di consegna modificato del farmaco al tessuto attraverso il liquido spinale cerebrale artificiale³¹.

Qui, vengono descritti metodi con cui i ricercatori possono sfruttare le proprietà fisico-chimiche ben documentate dell'isoflurano anestetico volatile per la somministrazione di farmaci a fette di cervello ex vivo, attivare input specifici del percorso e dello strato in un'area corticale di interesse con elevata risoluzione spaziotemporale e condurre registrazioni laminari simultanee e registrazioni mirate di patch clamp da popolazioni selezionate di neuroni. Combinate, queste procedure consentono ai ricercatori di misurare i cambiamenti indotti dall'anestetico volatile in diverse proprietà di risposta elettrofisiologica osservabili, dal livello sinaptico a quello locale.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali descritte in questo protocollo sono state approvate dalla University of Wisconsin-Madison School of Medicine e dal Public Health Animal Care and Use Committee.

1. Topi da riproduzione per esprimere la proteina reporter fluorescente in sottopopolazioni di interneuroni

1. Accoppia il topo maschio tdTomato omoziogo e Cre-dipendente con il topo femmina omozigote SOM-Cre o il topo femmina omozigote PV-Cre.
   NOTA: Altre popolazioni neuronali specifiche possono essere prese di mira utilizzando le linee Cre appropriate.
2. Consentire alla prole eterozigote di maturare fino ad almeno 3 settimane di età prima di procedere. Per gli esperimenti qui descritti, la genotipizzazione non è necessaria, poiché i genitori omozigoti producono prole che è tutta eterozigote sia per la Cre ricombinasi specifica del tipo di cellula che per gli alleli reporter Cre-dipendenti.

2. Esecuzione di iniezione stereotassica unilaterale di costrutto virale

1. Regolare le impostazioni dell'estrattore di micropipette per pipette a iniezione come indicato nel manuale utente dello strumento (vedere Tabella 1 per le impostazioni consigliate). Tirare la micropipetta di vetro.
2. Rompere la punta dell'estremità affilata della pipetta in modo che il diametro della punta sia di circa 30 μm con una conicità minima su diversi millimetri.
3. Utilizzando procedure precedentemente documentate, decidere il titolo appropriato e il volume del virus da iniettare. Negli esperimenti qui descritti, 1,0 μL (titolo: 3,1-5,7 TU/ml) iniettati unilateralmente hanno prodotto buoni risultati.
4. Riempire l'intero volume della pipetta con olio minerale. Caricare la pipetta sulla microsiringa e far scorrere una piccola quantità di olio minerale attraverso la punta per assicurarsi che la punta non sia intasata.
5. Frontfill almeno 1,0 μL di costrutto virale. Il vettore virale adeno-associato ricombinante utilizzato in questi esperimenti era AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP.
6. Disporre un drappo sterile in un'area chirurgica. Sterilizzare gli strumenti per la procedura stereotassica e posizionarlo sul drappo.
7. Anestetizzare SOM-tdTomato o PV-tdAnimale eterozigote usando isoflurano (3% per induzione, 1,5-2% per mantenimento) e miscela di ossigeno. Confermare periodicamente il livello chirurgico di anestesia con pizzico della punta durante l'intervento chirurgico. Assicurarsi che l'animale non vada oltre il piano chirurgico di anestesia monitorando la respirazione ogni 10-15 minuti.
8. Radere la parte superiore della testa dell'animale. Applicare alcol isopropilico al 70% e soluzione a base di iodio liberamente sulla zona chirurgica e unguento oftalmico sulle orbite oculari per prevenire l'essiccazione della membrana. Somministrare bupivacaina/lidocaina (rapporto 1:1, 1,0 mg/kg) per via sottocutanea al sito chirurgico per anestetico locale.
9. Adatta l'animale alla cornice stereotassica.
10. Utilizzare bisturi per fare incisione lungo l'asse sagittale della pelle sovrastante la superficie dorsale del cranio. Ritrarre la pelle usando una pinza. Idratare il cranio con lo 0,9% di soluzione salina secondo necessità.
11. Sulla superficie del cranio, segnare leggermente l'intersezione delle coordinate anteriori e laterali con una croce a matita. Praticare un foro alle coordinate appropriate nel piano trasversale (in mm rispetto a Bregma, per iniezione di corteccia cingolata (Cg): anteriore 0,2, laterale 0,3; per iniezione posteriore del talamo (Po): posteriore 2,25, laterale 3,4).
    NOTA: le marcature devono estendersi oltre i bordi del foro di bava per fornire indicazioni per il posizionamento accurato della pipetta.
12. Accendere e bilanciare la tabella dell'aria.
13. Riposizionare il manipolatore dell'elettrodo del frame stereotassico a 0° per le iniezioni in Cg, o 45° nel piano coronale per iniezioni in Po.
14. Collegare la pompa della siringa al manipolatore di elettrodi. Collegare il controller della pompa della microsiringa alla pompa della siringa.
15. Navigare la punta della pipetta vicino (ma senza toccare) la superficie del cervello, all'intersezione dei segni creati nel passaggio 2.11. Far avanzare la pipetta a circa 1 mm/s lungo il suo asse longitudinale nel cervello 0,9 mm (iniezione in Cg) o 3,1 mm (iniezione in Po). Attendere 10 minuti prima di procedere.
16. Iniettare 1,0 μL di costrutto virale per un periodo di 10 minuti (100 nL/min). Se si osserva la fuoriuscita di virus dal sito di inserimento della pipetta, rallentare la velocità di iniezione a 50 nL/min.
17. Dopo l'iniezione, attendere 10 minuti prima di ritrarre lentamente la pipetta per iniezione.
18. Sutura per chiudere l'incisione del cuoio capelluto e somministrare 2-5 mg/kg di meloxicam per via sottocutanea.
19. Interrompere l'isoflurano e monitorare l'animale durante l'emergenza dall'anestesia. Consentire il recupero secondo le procedure descritte dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'istituzione, compresa l'ulteriore somministrazione di analgesici.

3. Preparazione di fette di cervello acute

1. Attendere almeno 3 settimane per l'espressione del costrutto virale prima di raccogliere il tessuto.
2. Preparare 1 L di liquido spinale cerebrale artificiale per la procedura di affettamento (affettare il liquido spinale cerebrale artificiale, sACSF). Vedere la tabella 2 per gli ingredienti.
3. Durante tutta la procedura di affettatura, fornire sACSF con miscela disciolta al 95% di O 2/5% di CO₂, erogata tramite tubo di dispersione del gas.
4. Preparare il bagno ghiacciato per il microtomo a lama vibrante. Montare il palcoscenico del campione ghiacciato sul microtomo e fissare la lama di zaffiro in posizione per il sezionamento del tessuto.
5. Anestetizzare il topo con isoflurano al 3% e ossigeno fino alla perdita del riflesso raddrizzante.
6. Decapitare il topo con la ghigliottina e immergere immediatamente la testa in 4°C sACSF. Per preservare la salute del tessuto, completare i seguenti passaggi il più rapidamente possibile.
7. Aprire la cavità cranica praticando una piccola incisione alla base del cranio e rimuovendo delicatamente ogni piastra cranica. Rimuovere delicatamente la dura madre sottostante.
8. Mentre il cervello è ancora nella cavità del cranio, usa la lama del rasoio per rimuovere il cervelletto. Fai un secondo taglio verticale lungo il piano sagittale nell'emisfero sinistro, appena laterale alla linea mediana.
9. Preparare il blocco di tessuto per il sezionamento.
   1. Sollevare delicatamente il cervello dalla cavità cranica. Posiziona il cervello sulla carta da filtro con il piano piatto e sagittale verso il basso. Guida la carta da filtro sul modello di blocco e allinea il cervello alla struttura del modello sottostante (Figura supplementare 1).
   2. Esegui due tagli paralleli nel piano coronale come indicato dalle linee sul modello. Aggiungere una piccola goccia di sACSF per mantenere la carta da filtro bagnata, se necessario.
   3. Posizionare brevemente il blocco di tessuto in 4°C sACSF durante il passaggio 3.8.4.
   4. Applicare una piccola quantità di super colla allo stadio del campione ghiacciato.
   5. Sollevare il blocco di tessuto dal freddo sACSF. Utilizzare l'angolo di un asciugamano assorbente per allontanare l'eccesso di sACSF. Incollare il piano coronale posteriore del blocco di tessuto allo stadio del campione, con la superficie dorsale del cervello rivolta verso la lama di zaffiro.
10. Raccogliere fette di cervello coronale spesse 500 μm. Posizionare le fette di interesse su rete di nylon (figura supplementare 2) in 34 °C sACSF e lasciare che il contenitore raggiunga la temperatura ambiente.
    NOTA: Per gli esperimenti qui descritti, sono state raccolte registrazioni elettrofisiologiche da una sezione coronale centrata a circa 2,25 mm posteriormente al bregma per studiare un'area sensoriale non primaria, la corteccia visiva secondaria mediale (V2MM).

4. Preparazione di sacche sperimentali di liquido cerebrospinale artificiale (eACSF) contenenti isoflurano anestetico volatile disciolto

1. Preparare 300 ml di una miscela madre di isoflurano al 3,0%.
   1. In una sacca di gas di politetrafluoroetilene sigillata, aggiungere ~ 100 ml di miscela di gas al 95% O 2/5% CO₂ a 20-30 ml di isoflurano liquido e una piccola quantità di soluzione salina allo 0,9%. Attendere almeno 30 minuti per consentire l'equilibrio dell'isoflurano tra le fasi liquida e gassosa.
   2. Determinare la quantità di gas isoflurano saturo, V_sat, da aggiungere al sacchetto di riserva utilizzando la seguente equazione:
      
      dove P%stock è la composizione target del gas di riserva (3% in questo caso), V stock è il volume finale del sacco di gas _stock, P isoflurano è la pressione parziale_{dell'isoflurano} a temperatura ambiente (~240 mmHg) e P_totale è la pressione atmosferica (~760 mmHg).
   3. Aggiungere la quantità calcolata di gas saturo in un sacchetto di gas vuoto e riempire il sacchetto con un volume di miscela di gas O₂/5% CO₂ al 95% per portare il volume totale del sacchetto di riserva a 300 ml.
2. Preparare 2 L di liquido spinale cerebrale artificiale per la perfusione della fetta durante l'esperimento (ACSF sperimentale, eACSF). Vedere la tabella 2 per gli ingredienti. Sciogliere la miscela di gas O₂/5% CO₂ al 95% in soluzione.
3. Preparare due sacchetti separati di soluzioni di controllo e isoflurano.
   1. In una sacca vuota di gas in politetrafluoroetilene, aggiungere 600 mL di eACSF e 600 mL di miscela di gas O₂/5% CO₂ al 95%. Etichetta questo sacchetto come Control.
   2. In un altro sacchetto di gas di politetrafluoroetilene vuoto, aggiungere 300 ml di eACSF. Etichetta questo sacchetto come isoflurano.
   3. Scegliere una concentrazione equilibrata in fase gassosa fisiologicamente rilevante dell'isoflurano. Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando concentrazioni di gas equivalenti all'1,3% di isoflurano. I topi perdono il riflesso raddrizzante, e presumibilmente la coscienza, allo 0,9% di isoflurano inalatorio.
   4. Utilizzare la seguente equazione per calcolare la concentrazione equivalente in fase gassosa a temperatura ambiente, P%(T_room)³¹:
      
      dove P%(corpo T) è la concentrazione fisiologicamente rilevante in fase gassosa scelta nella fase 4.3.3,_{la camera} T è 25 °C e il_{corpo T è} 37 °C.
   5. Utilizzare la seguente equazione per determinare il volume di gas dal sacco di gas di riserva, V_stock, da aggiungere alla soluzione di isoflurano.
      
      dove la_soluzione V è il volume di eACSF nel sacchetto di isoflurano (300 ml), P%_{(stanza T}) è inserito dall'equazione (2), λ è il coefficiente di ripartizione di Ostwald salino/gas dell'isoflurano (λ = 1,2³²) e P%stock è la concentrazione in fase gassosa del sacco di gas stock (P%_stock = 3,0%).
   6. Al sacchetto della soluzione di isoflurano, aggiungere il volume di gas dal sacco di gas di riserva, V_stock, calcolato al punto 4.3.5.
   7. Alla sacca della soluzione di isoflurano, aggiungere un volume di miscela di gas O₂/5% di CO₂ al 95% per portare il volume totale di gas nella sacca della soluzione di isoflurano a 300 ml.
4. Agitare entrambe le sacche Control e Isoflurane sullo shaker per almeno 1 ora per consentire l'equilibrio della fase isoflurano.
5. Dopo aver raccolto tutti i dati, la concentrazione corretta può essere verificata utilizzando un monitor di gas anestetico per misurare la concentrazione di gas equilibrato di isoflurano al di sopra della soluzione rimanente in sacchetto.
6. Riportare le concentrazioni sperimentali di gas volatili in unità acquose, poiché le concentrazioni millimolari sono più robuste alle variazioni di temperatura. Utilizzare la seguente equazione per convertire la concentrazione in fase gas a temperatura ambiente, P%_{(stanza T}), in concentrazione acquosa equivalente (C_acquosa, in mM)³¹:
   
   dove α è il coefficiente di ripartizione Bunsen salino/gas per l'isoflurano a 25°C³².

5. Preparazione di hardware e software per registrazioni multicanale

1. Impostare il sistema di acquisizione dati a 16 canali in base alle istruzioni del produttore.
   NOTA: Diversi amplificatori e sistemi di acquisizione dati disponibili in commercio possono essere utilizzati per raccogliere registrazioni multicanale. Negli esperimenti qui descritti, i segnali analogici vengono inviati tramite un pannello di riferimento dell'elettrodo a due amplificatori, dove vengono amplificati (2000x) e filtrati (0,1-10 kHz). Gli ingressi analogici al sistema di acquisizione dati sono digitalizzati a 40kHz.
2. Fissare l'adattatore per headstage a 16 canali appropriato a un micromanipolatore per microscopio. Orientare l'adattatore in modo che le porte del connettore femmina siano rivolte verso il basso.
3. Regolare l'angolo di funzionamento di questo micromanipolatore in modo che sia orientato verso il basso verso la camera di registrazione, con un angolo di circa 70° rispetto all'orizzontale.
4. Collegare l'ingresso headstage a una sonda 16 x 1 per l'elettrofisiologia in vitro tramite l'adattatore headstage ancorato al micromanipolatore.
5. Collegare il connettore di uscita headstage al sistema di acquisizione dati.
6. Installare il software appropriato per l'acquisizione dei dati. Configurare 15 canali di ingresso in modo che corrispondano ai segnali di ingresso dei primi 15 contatti sonda multicanale. Configurare il canale rimanente per ricevere input dall'elettrodo intracellulare.
   NOTA: Prestare attenzione a considerare le mappe degli elettrodi e degli adattatori durante la raccolta e l'analisi dei dati, per garantire che il segnale appropriato corrisponda al contatto dell'elettrodo da cui è stato raccolto.

6. Configurazione dei protocolli di stimolazione luminosa

1. Configurare il sistema di erogazione della luce e installare il software di accompagnamento.
2. Aprire il software. Scegliere la configurazione di cablaggio hardware in cui una sorgente di trigger (uscita digitale/TTL) fornisce un segnale di ingresso trigger al sistema di erogazione della luce e il sistema di erogazione della luce fornisce il segnale di uscita del trigger a un LED da 470 nm.
3. Montare obiettivi ad alta potenza. Utilizzando la fotocamera digitale, calibrare l'obiettivo ad alta potenza per l'uso con il sistema di erogazione della luce.
4. Creare una nuova sequenza di profili di stimolazione luminosa.
   1. Creare un modello di scelta. Negli esperimenti qui descritti, viene utilizzato un cerchio di diametro 150 μm per consentire l'attivazione specifica dello strato dei terminali assonici.
   2. Per creare una sequenza di profili, copiare e incollare questo profilo per ciascuna delle numerose versioni di prova.
   3. Creare un elenco di forme d'onda contenente forme d'onda di qualsiasi intensità luminosa, durata dell'impulso o numero di impulso.
   4. Assegna in modo casuale forme d'onda a ciascun profilo. Ogni profilo con la sua forma d'onda assegnata corrisponde a un impulso di trigger da un ingresso TTL digitale o a una prova.
   5. Salvare la sequenza del profilo.
5. Nel software di acquisizione dati, creare un nuovo protocollo.
   1. Impostare il numero di versioni di prova in modo che corrisponda al numero di profili nella sequenza di profili appena creata.
   2. Scegliere gli ingressi del segnale in modo che corrispondano a quelli configurati nel passaggio 5.6. Configurare un protocollo che fornisca una singola uscita TTL digitale, registrando da questi 16 canali di input per un periodo di tempo appropriato prima e dopo il trigger digitale.

7. Posizionamento della sonda multicanale nella fetta di tessuto cerebrale ex vivo

1. Perfuse bubbled eACSF (non in sacchetti sigillati) a 3-6 mL/min.
2. Trasferire la fetta di cervello contenente l'area di interesse sulla griglia della rete nella camera di perfusione del microscopio. Ancora con arpa di platino (vedi figura supplementare 3).
3. Ruotare la griglia della maglia in modo tale che la linea dei contatti dell'elettrodo sull'estremità distale della sonda multicanale sia approssimativamente perpendicolare alla superficie piale.
4. Sotto l'illuminazione a campo largo e sotto il controllo fine del micromanipolatore, abbassare la sonda multicanale verso la superficie della fetta.
5. Ruotare la torretta del cubo del filtro per attivare il cubo filtrante appropriato per la visualizzazione della proteina reporter fluorescente espressa nei terminali assoni delle afferenze corticali. Se necessario, ruotate la fetta per allineare più precisamente la sonda alla superficie piale.
6. Posizionare la sonda appena sopra il piano della fetta, ~200 μm in meno rispetto alla posizione target finale lungo l'asse x, lasciando almeno un canale al di fuori del confine dell'area di tessuto da registrare
7. Inserire lentamente la sonda nella fetta spostando il manipolatore lungo il suo asse longitudinale. Per ridurre al minimo i danni al tessuto, far avanzare la sonda solo nella misura in cui le punte affilate sono appena visibili sotto la superficie del tessuto. Ciò ridurrà al minimo i danni al tessuto pur garantendo che i contatti degli elettrodi siano in contatto con il tessuto.

8. Patch bloccando i neuroni mirati e ottenendo la configurazione dell'intera cellula

1. Commutazione della sorgente eACSF con la soluzione di controllo insaccata.
2. Identificare la cella marcata in modo fluorescente per la registrazione mirata di patch clamp .
   1. Limitare il diaframma del diaframma del diaframma dell'apertura al diametro più piccolo. Attivare una lente obiettivo a bassa potenza e mettere a fuoco il tessuto.
   2. Centrare la luce su un'area di tessuto adiacente (ma non sovrapposta) alla sonda multicanale.
   3. Inserire l'obiettivo ad immersione in acqua ad alta potenza (40x o 60x), prestando attenzione per evitare il contatto tra la sonda multicanale e l'obiettivo.
   4. Ruotare la torretta del cubo del filtro per attivare il set di filtri appropriato per consentire l'imaging delle cellule che esprimono il marcatore fluorescente Cre-dipendente.
   5. Identificare una cella marcata con fluorescenza come destinazione per la registrazione di patch mors. Sollevare l'obiettivo per creare ampio spazio per abbassare una pipetta patch.
3. Caricare una pipetta patch (vedere Tabella 1) con soluzione interna (Tabella 2) e montare la pipetta nel supporto dell'elettrodo. Utilizzando una siringa da 1 ml, applicare una pressione positiva corrispondente a ~ 0,1 ml di aria.
4. Inserire la pipetta nella soluzione. Mettere a fuoco la punta della pipetta sotto la guida visiva.
5. Ottenere la registrazione dell'intera cella dalla cella di destinazione utilizzando i passaggi precedentemente dimostrati³³.
6. Se si prevede di valutare le modifiche alle proprietà intrinseche della cella (ad esempio, resistenza di ingresso, velocità di attivazione del potenziale d'azione in risposta ai passaggi correnti), eseguire queste registrazioni. Altrimenti, passa al protocollo di stimolazione degli assoni in basso.

9. Attivazione optogenetica layer-specifica dei terminali assonici

1. Manipolare il campo visivo nel piano x-y per allineare il profilo di stimolazione della luce con la posizione desiderata sulla fetta.
2. Caricare il protocollo di stimolo luminoso e preparare il sistema di erogazione della luce per ricevere un impulso TTL digitale.
3. Optogeneticamente attivano i terminali assonici mentre registrano simultaneamente i potenziali di campo extracellulare e le fluttuazioni della membrana intracellulare.
4. Passare dalla fonte eACSF alla soluzione di isoflurano e lavare il farmaco per 15 minuti. Se necessario, raccogliere registrazioni spontanee durante il wash-in.
5. Ripetere i passaggi 9.2-9.3.
6. Commutare la sorgente eACSF sulla soluzione di controllo e lavare il farmaco per 20 minuti. Se necessario, raccogliere le registrazioni spontanee durante il wash-out.
7. Ripetere i passaggi 9.2-9.3.

Results

Una sequenza temporale dei passaggi descritti nel protocollo è mostrata nella Figura 1. Gli input corticali provenienti da aree corticali di ordine superiore o da nuclei talamici non primari hanno campi terminali parzialmente sovrapposti nello strato 1 della corteccia visiva non primaria²⁴. Per isolare vie afferenti talamocorticali o corticocorticali indipendenti, è stato iniettato un vettore virale contenente ChR2 e un reporter fluorescente eYFP in Po o TCG. Le cellu...

Discussion

In questo manoscritto viene descritto un protocollo per valutare le risposte intra ed extracellulari a vie afferenti attivate selettivamente in fette di cervello ex vivo.

L'uso di strumenti optogenetici e schemi di registrazione paralleli consente ai ricercatori di sondare le risposte delle popolazioni locali agli input afferenti provenienti da regioni cerebrali distanti, registrando simultaneamente da popolazioni mirate di interneuroni. L'uso della tecnologia optogenetica consente di preserva...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Obiettivo a campo largo 2,5x	Olympus	MPLFLN2,5X
40x	Olympus	LUMPLFLN40XW
miscela 95% O2/5% CO2 Sonda	Airgas	Z02OX95R2003045
A16	NeuroNexus	A16x1-2mm-100-177-A16	Sonda a 16 canali
AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP	Karl Deisseroth Lab, UNC Vector Core
Monitoraggio dei gas anestetici (POET II)	Criticare	602-3A
ATP, sale di magnesio	Sigma Aldrich	A9187	soluzione intracellulare
B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	The Jackson Laboratory	007914	Cre-dipendente tdTomato topo
B6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J	The Jackson Laboratory	008069	PV-Cre mouse
Belly dancer Shaker	Thomas Scientific	1210H86-TS	per l'equilibratura di sacche di gas sigillate
Soluzione di betadina	Marca generica
Bleach Marca		generica	per elettrodo patch clamp per cloruraggio d'argento
Bupivicaina
Cloruro di calcio (CaCl2)	Dot Scientific	DSC20010	ACSF
Vetro capillare (registrazioni con morsetto patch)	King Precision Glass, Inc.	KG-33	Borosilicato, ID: 1,1 mm, OD: 1,7 mm, Lunghezza: 90,0 mm
Vetro capillare (iniezioni virali)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	3,5"
Controllo del micromanipolatore junior	Luigs e Neumann	SM8	per il controllo del micromanipolatore junior
Controllo dei manipolatori e della tavola mobile	Luigs e Neumann	SM7	per il controllo dell'elettrodo multicanale e tavolo mobile
Digidata 1440A + Clampex 10	Molecular Devices	1440A	Digitalizzatore e
software Tubo E-3603	Fisher Scientific	14171208	per la somministrazione di una miscela di gas 95% O2/5% CO2 alla camera di incubazione + applicazione di pressione durante il bloccaggio del cerotto
EGTA	Dot Scientific	DSE57060	soluzione intracellulare
ERP-27 EEG Reference/Patch Panel	Neuralynx	ritirato
	World Precision Instruments	50821912	per il riempimento di pipette con morsetto patch
Cubo filtrante per imaging EYFP	Olympus	U-MRFPHQ
Carta da filtro	Fisher Scientific	09801E	Lay over slice template durante la preparazione del blocco di tessuto
Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone	Strumento	SutterP-1000	2,5x2,5 Scatola filamento
Tubo di dispersione di gas	Sigma Aldrich	CLS3953312C
Siringa in vetro (100 mL)	Sigma Aldrich	Z314390	per il riempimento di sacchetti sigillati
a gas Acido gluconico, sale di potassio (K-gluconato)	Dot Scientific		DSG37020 soluzione intracellulare
Glucosio	Dot Scientific	DSG32040	ACSF
GTP, Soluzione intracellulare al sale di sodio	Sigma Aldrich	G8877
Adattatore per sonda per headstage	Adattatore NeuroNexus	A16-OM16	per collegare la sonda a 16 canali all'ingresso per headstage
Pinze emostatiche	VWR International	76192-096
HEPES	Dot Scientific	DSH75030	ACSF, soluzione intracellulare
HS-16 Headstage	Neuralynx	Pensionato
Isoflurane	Patterson Veterinario	07-893-1389
Alcool isopropilico (70%)	VWR International	101223-746
Micromanipolatore junior	Luigs e Neumann	210-100 000 0090-R	per la manipolazione dell'elettrodo patch clamp Modulo di
controllo della sorgente luminosa a LED	Mightex	BLS-PL02_US	controllo optogenetico della sorgente luminosa
Lidocaina
Lynx-8 Amplifier	Neuralynx	Pensionato
Lynx-8 Alimentatore	Neuralynx	Pensionato
Solfato di magnesio (MgSO4)	Dot Scientific	DSM24300	ACSF
mCherry, Texas Cubo filtro rosso	Chroma	49008	per imaging tdTomato fluorescente reporter
Meloxicam
Porta micropipette	Fisher Scientific NC9044962
Pompa a microsiringa	World Precision Instruments	UMP3-4
Olio minerale	Marca
MultiClamp 700A	Molecular Devices/Axon Instruments	700A	Amplificatore
Azoto (per falda aria)	Airgas	NI200
Rete di nylon	Fisher Scientific	501460083	tesa su ferro di cavallo di filo di platino appiattito, fetta di riposo sopra questo durante le registrazioni
Nylon, tagliato da collant	marca		generica per creare una piattaforma di fetta nella camera di incubazione, fibre singole per creare unguento oftalmico per arpa di platino
	Fisher Scientific	NC1697520
Pipetta	Dot Scientific	307	Per il trasferimento di tessuti al
filo di platino	VWR International	BT124000	2 cm, appiattito, per realizzare un'arpa di platino
Polygon400	Mightex	DSI-E-0470-0617-000	sistema di erogazione della luce optogenetica, viene fornito con il software PolyScan2
Cloruro di potassio (KCl)	Dot Scientific	DSP41000	ACSF
Fosfato di potassio (KH2PO4)	Dot Scientific	DSP41200	ACSF
Lama di rasoio	Fisher Scientific	12-640
Lama di zaffiro (per vibratomo)	VWR International	100492-502
Lama di bisturi	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-361445
Sacca di gas sigillata	Fisher Scientific	109236
Tavolo mobile per microscopio	Luigs e Neumann	380FMU
Bicarbonato di sodio (HCO3-)	Dot Scientific	DSS22060	ACSF
Cloruro di sodio (NaCl)	Dot Scientific	DSS23020	ACSF, soluzione intracellulare
Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre)	Il Jackson Laboratory	013044	mouse SOM-Cre
Strumento stereotassico	Kopf	Modello 902	Dual Small Animal
Super colla	Graffe	886833	fissare il blocco di tessuto allo stadio del campione durante la preparazione della fetta
Trapano chirurgico	RAM Products Inc.	DIGITALMICROTORQUE	Microtorque II
(1 mL) con punta LuerLock	Fisher Scientific	309628	per l'applicazione della pressione durante il bloccaggio del cerotto
Siringa (1 mL) con punta scorrevole	WW Grainger, Inc.	19G384	per il riempimento di pipette a pinza per
cerotti Filtri per siringa	VWR International	66064-414
Microscopio verticale	Olympus	BX51
Microtomo vibrante	Leica Biosystems	VT1000S
Asciugamani Wypall	Fisher Scientific	19-042-427