Presentiamo un metodo per stabilire un modello di sottoattività del detrusore mediante transezione del conus medullaris nei ratti. La sottoattività del detrusore è stata stimolata con successo in questi animali. Il modello può essere utilizzato per studiare la funzione del tratto urinario.
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Articolo metodologico
Modello di sottoattività del detrusore nei ratti mediante transezione di Conus medullaris
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'obiettivo del protocollo presentato era quello di stabilire un modello di sottoattività del detrusore (DU) nel ratto attraverso la transezione del cono midollare. La laminectomia è stata eseguita in un totale di 40 ratti Wistar femmina (gruppo di controllo: 10 ratti; gruppo di test: 30 ratti) del peso di 200-220 g, e il cono midollare è stato transettato al livello L4-L5 nel gruppo di test. Tutti i ratti sono stati alloggiati e nutriti nelle stesse condizioni ambientali per sei settimane. Nel gruppo di test, lo svuotamento delle urine è stato eseguito due volte al giorno per sei settimane ed è stato registrato il volume medio residuo di urina. Un cistometrogramma è stato eseguito in entrambi i gruppi. Sono stati registrati e calcolati la capacità cistometrica massima (MCC), la pressione di apertura del detrusore (DOP) e la conformità della vescica. Il gruppo di test ha mostrato una significativa ritenzione urinaria dopo l'intervento chirurgico, sia durante che dopo lo shock spinale. Tuttavia, nessuna anomalia è stata osservata nel gruppo di controllo. Rispetto al gruppo di controllo, l'MCC e la conformità della vescica nel gruppo di prova erano significativamente superiori a quelli del gruppo di prova (3,24 ± 2,261 ml contro 1,04 ± 0,571 ml; 0,43 ± 0,578 ml / cmH 2 O contro 0,032 ± 0,016 ml / cmH 2 O), mentre il DOP nel gruppo di prova era inferiore al controllo (20,28 ± 14,022 cmH 2 O contro 35 ± 13,258 cmH2 O). Questo metodo per stabilire un modello animale di uranio impoverito mediante la transezione del cono midollare offre un'eccellente opportunità per comprendere meglio la fisiopatologia dell'uranio impoverito.
Introduzione
L'underactivity del detrusore (DU) è una tipica disfunzione del tratto urinario inferiore che è rimasta sotto studiata. Anche se l'uranio impoverito è stato definito dall'International Continence Society (ICS)1, vengono utilizzate numerose terminologie diverse per riferirsi a questa malattia, ad esempio "insufficienza del detrusore", "vescica acontrattile", "areflessia del detrusore"2. L'uranio impoverito, come definito dall'International Continence Society (ICS) nel 2002, è una contrazione di forza e durata ridotte, che si traduce in un aumento prolungato del tempo per lo svuotamento della vescica, con conseguente incapacità di raggiungere lo svuotamento completo della vescica entro un periodo normale.
L'uranio impoverito può colpire il 48% degli uomini e il 12% delle donne (di età compresa >70 anni)3 con sintomi del tratto urinario inferiore. Sembra essere multifattoriale e non esiste un trattamento efficace. È stato riportato che l'uranio impoverito è onnipresente nei pazienti con disfunzione neurogena della vescica, come la sclerosi multipla4, il diabete mellito5, il morbo di Parkinson6 o l'ictus cerebrale7. L'uranio impoverito può anche essere causato da danni ai nervi iatrogeni, come l'isterectomia laparoscopica, la prostatectomia o altri interventi chirurgici nella piccola pelvi8. I cambiamenti fisiopatologici e i trattamenti disponibili dell'uranio impoverito sono ancora confusi a causa della mancanza di un modello animale appropriato per lo studio.
Il riflesso della minzione è controllato da vie spino-bulbospinali che combinano il centro di minzione pontina, il nucleo parasimpatico sacrale e i centri della corteccia più anziani9. L'attivazione e il mantenimento del riflesso della minzione dipendono principalmente dal trasporto regolare dei segnali sensoriali dalla vescica ai centri della corteccia più anziani. Si può postulare che la disfunzione sensoriale contribuisca all'uranio impoverito.
La maggior parte degli studi sperimentali sugli animali relativi alle disfunzioni del tratto urinario inferiore si sono concentrati su modelli di vescica iperattiva (OAB)10. Questi modelli forniscono una ragionevole comprensione della fisiopatologia e della prognosi dell'OAB. Tuttavia, sono stati riportati solo pochi modelli di uranio impoverito, ad esempio lesioni sopraspinali (lesioni locali, decerebrazione e occlusione dell'arteria cerebrale media), trassezione del midollo spinale o lesione da contusione, somministrazione sistemica (ad es. ciclofosfamide) o intravescicale di agenti irritanti o infiammatori (ad es. acido, acroleina e lipopolisaccaride)11,12,13,14 . Tra questi metodi, solo il metodo di transezione del midollo spinale o lesione da contusione può essere utilizzato per stabilire un modello animale di DU13. I tentativi di lesione del centro di minzione pontino e dei centri della corteccia superiore sono stati abbandonati a causa del grave trauma. Quindi, viene prestata maggiore attenzione per trovare una posizione accurata nel centro del riflesso della minzione per indurre l'uranio impoverito con effetti collaterali minimi.
Come accennato in precedenza, uno dei meccanismi di induzione dell'uranio impoverito è quello di danneggiare il midollo spinale per danneggiare la via di segnalazione del riflesso della minzione. Il metodo di caduta del peso di Allen è stato sviluppato per stabilire animali da laboratorio con midollo spinale ferito15. Tuttavia, non sono disponibili ulteriori dati sperimentali su questo metodo. Inoltre, poiché parti degli animali hanno recuperato la funzione spinale dopo l'ictus senza DU, non può essere considerato un metodo perfetto per generare un modello animale di uranio impoverito16.
Nel 1987, Bregman ha escogitato un processo di transetto del midollo spinale per generare il modello animale all'uranio impoverito e ha acquisito dati sperimentali17. Tuttavia, questo metodo non è stato applicato per stabilire il modello animale all'uranio impoverito. A quel tempo, i ricercatori erano ancora confusi sulla patogenesi dell'uranio impoverito. Poiché le posizioni nel midollo spinale associate all'induzione di OAB o DU sono adiacenti l'una all'altra, non sono state in grado di trovare il sito preciso del danno al midollo spinale per indurre DU17. OAB e DU sono stati introdotti insieme o separatamente con questo metodo. Quindi, sebbene questo metodo abbia introdotto l'uranio impoverito, era impreciso e non poteva essere utilizzato per la comprensione dell'occorrenza e dell'elaborazione dell'uranio impoverito.
Come detto sopra, la mancanza di un modello animale adatto di uranio impoverito è uno dei principali ostacoli per lo studio dell'uranio impoverito. I ricercatori sono continuamente alla ricerca di un modello accurato e gestibile in grado di simulare la patologia dell'uranio impoverito. Anche le opzioni di trattamento per l'uranio impoverito non sono migliorate significativamente negli ultimi 20 anni. Collettivamente, c'è un grande bisogno di descrivere un protocollo standard per stabilire un modello animale di uranio impoverito.
Quindi, in questo articolo, descriviamo un metodo per stabilire con successo un modello di ratto di uranio impoverito mediante transezione del cono midollare. La transezione è stata eseguita a livello L4\u2012L5 per separare il cono midollare. La capacità cistometrica massima (MCC), la pressione di apertura del detrusore (DOP) e la conformità della vescica sono state registrate e analizzate per convalidare il protocollo. Il protocollo indicato di seguito combina fattibilità e affidabilità in modo standardizzato per stabilire il modello animale di uranio impoverito, simulando la presenza e l'elaborazione dell'uranio impoverito. Il protocollo può essere utilizzato come tecnica per ulteriori studi sull'uranio impoverito.
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Protocollo
Tutti i ratti sono stati utilizzati secondo i protocolli approvati dal Comitato sperimentale sugli animali del Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University.
1. Preparazione chirurgica, anestetizzazione e tecniche chirurgiche
NOTA: Un totale di 40 femmine di ratto Wistar, del peso di 200-220 g, sono stati ottenuti commercialmente per il presente studio. Dei 40 ratti, 10 sono stati selezionati casualmente come gruppo di controllo e il resto è stato trattato come gruppo di test. Tutti gli animali sono stati ospitati in un ambiente sterile nelle strutture per animali del Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University.
- Eseguire l'anestesia generale somministrando pentobarbital di sodio per via intraperitoneale (40 mg/kg). In alternativa, indurre l'anestesia usando isoflurano al 3% -4% e mantenerla all'1% -3% (inalato). Applicare unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza. Quindi, posizionare il ratto sulla piattaforma chirurgica e fornire supporto termico.
NOTA: Somministrare analgesici come buprenorfina, 0,05 mg/kg, SC, 0,1-0,2 mL all'inizio della procedura. - Controllare la profondità dell'anestesia dalla mancanza di risposta al pizzico della punta. Rasare la pelliccia da tutta la zona posteriore con un rasoio.
- Sterilizzare il sito chirurgico con almeno 3 cicli di uno scrub a due stadi come clorexidina o iodio povidone seguito da alcool isopropilico. Fissare gli arti con nastro chirurgico e fare un'incisione mediana di circa 3 cm sulla schiena con forbici chirurgiche.
- Approfondisci l'incisione attraverso i tessuti sottocutanei usando le forbici chirurgiche e taglia i muscoli attaccati alla colonna vertebrale.
- Identificare ed esporre visivamente la 13a costola (lo spazio intervertebrale collegato aquella costola è l'intervallo T13\u2012L1). Segna la 13acostola usando una sutura.
- Dopo l'identificazione, resecare attentamente i muscoli attaccati alla colonna vertebrale ed esporre la colonna vertebrale. Resecare il legamento sopraspinoso e il legamento interspinoso per un'accurata identificazione della colonna vertebrale. Esporre il livello di L4\u2012L5 con forbici chirurgiche e pinze.
NOTA: Il legamento sopraspinoso può essere identificato facilmente a causa della presenza di tessuto sottocutaneo sottile. Dopo la resezione del legamento sopraspinoso, il legamento tra il processo spinoso è il legamento interspinoso. - Sezionare attentamente il processo spinoso vertebrale L4\u2012L5 e parti del processo trasversale usando una pinza Kelly per esporre il midollo spinale (Figura 1).
- Esporre completamente il cono midollare al livello L4\u2012L5 e transectare il midollare del cono totalmente con le forbici per iridectomia. Inserire un imballaggio di tessuto per bloccare il recupero del midollo spinale.
- Chiudere il muscolo e la pelle sovrastanti sullo strato esterno della pelle utilizzando una sutura non assorbibile 4-0.
- Per il gruppo di controllo, eseguire i passaggi 1.1\u20121.7 e lasciare intatto il cono midollare. Chiudere l'incisione secondo il punto 1.9.
2. Recupero degli animali
- Tenere i ratti in un'incubatrice a temperatura controllata (37 °C) durante la prima ora dopo l'operazione e monitorarli fino a quando non sono sternali o in movimento attivo.
NOTA: Ci vuole circa mezz'ora per il recupero totale. - Trasferire l'animale in una gabbia pulita con cibo e acqua sufficienti. Tieni i ratti in gabbie separate.
NOTA: Il successo della transezione è indicato quando i ratti nel gruppo di prova si muovono solo con l'aiuto delle zampe anteriori, mentre i ratti nel gruppo di controllo potrebbero camminare normalmente.
3. Gestione post-operatoria
- Iniettare penicillina G, un antibiotico (50.000 U/ml per animale) per via intraperitoneale. Somministrare analgesici come buprenorfina, 0,05 mg/kg, SC, 0,1-0,2 ml ogni 6-12 ore per 48 ore dopo l'intervento.
- Comprimere la vescica urinaria nell'ipogastrio per aiutare con lo svuotamento. Eseguilo due volte al giorno alla stessa ora (8 am e 8 pm) per sei settimane.
NOTA: La perdita della normale costrizione del detrusore è il simbolo dell'uranio impoverito. - Ospitare tutti i ratti in gabbie metaboliche, ciascuna contenente un imbuto di raccolta delle urine posto su una carta assorbente precedentemente pesata per monitorare la minzione e l'incontinenza.
- Raccogliere e annotare separatamente la variazione di peso della carta assorbente, che indica separatamente il volume vuoto (VV) e il volume residuo di urina.
4. Test urodinamici
- A sei settimane dopo l'operazione, eseguire un cistometrogramma, utilizzando apparecchiature di misurazione urodinamica come segue.
- Anestetizzare i ratti iniettando il 10% di cloralio idrato nella cavità peritoneale (3 ml/kg).
- Comprimere la vescica per lo svuotamento, quindi fissare il ratto alla piattaforma chirurgica usando un nastro.
- Inserire il catetere epidurale (3F) nella vescica e collegare l'apparecchiatura di misurazione urodinamica, il catetere epidurale e la pompa per infusione tramite il tubo a tre arti.
- Pompare soluzione fisiologica salina ad una velocità di 0,2 ml/min per la misurazione urodinamica (vedi Tabella dei materiali). Registrare l'MCC e il DOP e la conformità della vescica (calcolata dividendo δ volume della vescica con δ pressione del detrusore).
5. Analisi statistica
- Eseguire analisi statistiche utilizzando software disponibili in commercio.
- Utilizzare il test di Kolmogorov-Smirnov per testare la normalità dei dati.
- Esprimere le variabili normalmente distribuite come valori medi con deviazioni standard. Utilizzare i test t di Student accoppiati a due code per confrontare i parametri del cistometrogramma in entrambi i gruppi.
NOTA: p < 0,05 indica che la differenza aveva rilevanza statistica.
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Risultati
L'intera procedura della transezione del cono midollare può essere completata entro 45 minuti da chirurghi esperti. Il nostro laboratorio ha eseguito oltre 100 casi di interventi chirurgici di transezione del cono midollare. Il tasso di successo è superiore al 95%, come definito dalla sopravvivenza dei ratti e dall'induzione riuscita dell'uranio impoverito. Il test urodinamico ha confermato l'induzione dell'uranio impoverito.
Sulla base della nostra esperienza, l'induzione dell'uranio impoveri...
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Discussione
L'uranio impoverito è una causa comune di sintomi del tratto urinario inferiore sia negli uomini che nelle donne. È una costellazione complessa di sintomi con poche opzioni di trattamento che possono ridurre significativamente la qualità della vita (Qol) delle persone colpite18. Sebbene si ritenga che l'uranio impoverito sia multifattoriale, la comprensione della sua patogenesi rimane rudimentale. Gli studi hanno dimostrato che la patogenesi dell'uranio impoverito potrebbe essere correlata a fatto...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Wuhan Prosai Company | EY-C1178 | 0,9% | per la misurazione urodinamica |
| 10% idrato di cloralio | Shandong Yulong Co., Ltd | H37022673 | 3 ml/kg, somministrata per via intraperitoneale |
| Iniezione di buprenorfina cloridrato Tianjin | Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co. LTD | H12020275 | 0,05 mg/kg per via sottocutanea 24 ore e 48 ore dopo l'operazione |
| Catetere epidurale | Shandong Xinghua Co, Ltd | VABR3L | per la misurazione urodinamica |
| Penicillina G | Alta Technology Co., Ltd | 1ST5637 | 50.000 unità/ml per animale |
| pentobarbital | Beijing solabo Technology Co., Ltd | NK-WF0001 | 40 mg/kg, somministrato intraperitonealmente |
| Linea di sutura(4-0) | ETHICON | VCP422H | suturare la lesione |
| Tubo a tre arti | Shandong Xinghua Co, Ltd | VAB3T | per la misurazione urodinamica |
| Pompa per infusione di tracce | Zhejiang Smith Medical Instrument Co., Ltd | 20162540335 | Pompa la soluzione salina a una velocità di 0,2 ml/min per la misurazione urodinamica |
| Apparecchiature di misurazione urodinamica | Medical Measurement SystemsB.V. | 08-0467 | apparecchiature di misurazione urodinamica possono non solo aiutare la diagnosi di disuria, ma anche fornire materiali oggettivi per il trattamento e l'effetto terapeutico. È il metodo di esame più comunemente usato nella diagnosi clinica e nel trattamento delle malattie funzionali del tratto urinario inferiore |
| Wistar | Rats HFK Biotechnology Co., Pechino, Cina | SCXK2012-0023 | 200-220g |
Riferimenti
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