Articolo metodologico

OP-IVM: Combinazione della maturazione in vitro dopo il prelievo di ovociti con la chirurgia ginecologica

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DOI:

10.3791/61647

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9 maggio 2021

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1Center for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 2National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology, 3Key Laboratory of Assisted Reproduction, Ministry of Education, 4Beijing Key Laboratory of Reproductive Endocrinology and Assisted Reproduction, 5Research Units of Comprehensive Diagnosis and Treatment of Oocyte Maturation Arrest, Chinese Academy of Medical Sciences

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Sommario

La maturazione in vitro (IVM) prima dell'operazione ginecologica (OP-IVM) combina l'IVM dopo il prelievo degli ovociti con la chirurgia ginecologica di routine e funge da estensione delle applicazioni IVM convenzionali per la conservazione della fertilità.

Abstract

L'uso della maturazione in vitro (IVM) prima dell'operazione ginecologica (OP-IVM) è un'estensione dell'IVM convenzionale che combina l'IVM dopo il prelievo degli ovociti con la chirurgia ginecologica di routine. OP-IVM è adatto per i pazienti sottoposti a chirurgia ginecologica benigna che hanno la necessità di preservare la fertilità (FP) o trattamenti di infertilità come la fecondazione in vitro e il trasferimento di embrioni (IVF-ET). In sala operatoria, i pazienti sottoposti a chirurgia ginecologica benigna vengono prima anestetizzati e ricevono un trattamento di aspirazione del follicolo immaturo (IMFA) guidato da ultrasuoni. Quando viene eseguita la successiva chirurgia ginecologica, vengono esaminati i complessi cumulo-ovocita (COC) e i COC immaturi vengono trasferiti nel mezzo IVM e coltivati per 28-32 ore nel laboratorio di fecondazione in vitro. Dopo la valutazione, gli ovociti maturi nella fase MII saranno selezionati e crioconservati in azoto liquido per FP o fecondati mediante iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI) per IVF-ET. Combinando L'IVM con la chirurgia ginecologica, gli ovociti immaturi che sarebbero stati scartati possono essere salvati e utilizzati per la tecnologia di riproduzione assistita (ART). La procedura, il significato e gli aspetti critici di OP-IVM sono descritti in questo articolo.

Introduzione

IVM è una ART in cui gli ovociti umani immaturi vengono coltivati in vitro fino alla maturazione per IVF-ET o FP. In IVM, i farmaci di induzione dell'ovulazione non vengono utilizzati, riducendo così il dolore, l'onere finanziario e le complicanze come la sindrome da iperstimolazione ovarica (OHSS)1,2. Inoltre, IVM è particolarmente adatto per la FP di pazienti oncologici e il trattamento dell'infertilità di pazienti ormono-sensibili che potrebbero non essere in grado o non avere il tempo di ricevere la terapia di induzione dell'ovulazione3. Pertanto, sebbene il numero di ovociti recuperati, il tasso di gravidanza clinica (CPR) e il tasso di natalità vivo (LBR) siano inferiori a quelli della fecondazione in vitro4,5, IVM ha i suoi vantaggi unici.

I pazienti infertili con lesioni endometriali, idrosalpinx o cisti ovariche di solito hanno un intervento chirurgico ginecologico prima del trattamento con ART e i loro ovociti sono solitamente immaturi. OP-IVM utilizza l'ecografia transvaginale guidata per recuperare gli ovociti immaturi e farli crescere in vitro fino alla maturazione per IVF-ET o FP. OP-IVM combina IVM dopo il prelievo degli ovociti e la chirurgia ginecologica, riducendo così le complicanze che sono comuni nei cicli di iperstimolazione ovarica controllata e risparmiando tempo e denaro. Per i pazienti fertili, OP-IVM potrebbe servire come "assicurazione sulla fertilità" durante la chirurgia ginecologica di routine.

Inoltre, i danni causati da interventi chirurgici ginecologici, come l'elettrocauteria6,7 e la resezione del tumore ovarico, potrebbero essere ridotti attraverso il recupero degli ovociti prima della chirurgia ginecologica. Pertanto, rispetto alla chirurgia ginecologica di routine, OP-IVM potrebbe ridurre il numero di operazioni durante il trattamento dell'infertilità e prevenire la perdita di ovociti funzionali durante la chirurgia ovarica.

Uno studio precedente ha dimostrato che la procedura aggiuntiva di recupero degli ovociti non aumenterebbe le complicanze chirurgiche e gli esiti avversi della gravidanza, né prolungherebbe la degenza ospedaliera8. Alcune pazienti hanno partorito vivo attraverso OP-IVM8, indicando la fattibilità di questo metodo. Questo documento descrive le caratteristiche dei pazienti che possono trarre beneficio da OP-IVM, nonché le procedure e i punti critici di OP-IVM e discute la valutazione della maturità degli ovociti umani.

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Protocollo

NOTA: Gli studi relativi al metodo OP-IVM sono stati approvati dal comitato di revisione istituzionale (IRB) del Terzo Ospedale universitario di Pechino e dal comitato etico dell'Università di Pechino (2014S2004). Un riepilogo di OP-IVM è mostrato nella Figura 1. La procedura dettagliata verrà introdotta nella sezione seguente.

1. Introduzione di OP-IVM a pazienti appropriati

  1. Identificare i potenziali pazienti che possono trarre beneficio da OP-IVM come quelli descritti nei passaggi 1.1.1-1.1.3.:
    1. Sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) pazienti con resistenza al clomifene che necessitano di un intervento chirurgico di perforazione ovarica laparoscopica.
    2. Pazienti infertili che necessitano di interventi chirurgici ginecologici benigni, come miomectomia isteroscopica, polipectomia, resezione transcervicale del setto e chirurgia tubarica laparoscopica e ovariocistectomia, prima del trattamento ART.
    3. Pazienti con cancro o malattia ematologica che stanno ricevendo chemioradioterapia o radioterapia.

2. Consenso informato

  1. Fornire informazioni complete ai pazienti, incluso il motivo per cui OP-IVM può essere utile, la sua procedura, gli usi degli ovociti IVM (IVF-ET o crioconservazione), CCR e LDR stimati e possibili complicanze. Chiedere ai pazienti di dare il consenso informato firmando il modulo di consenso.

3. Preparare etichette e mezzo ovocitario IVM

  1. Stampare etichette di identificazione (ID) con il nome e le date del paziente per piatti e tubi di coltura.
  2. Aggiungere 0,5 mL di IVM medio integrato con 0,075 UI / mL di ormone follicolo-stimolante (FSH) e 0,075 UI / mL di ormone luteinizzante (LH) a ciascun pozzetto di una piastra a 4 pozzetti. Coprire il mezzo con olio.
    NOTA: eseguire tutte queste procedure in banchi puliti a flusso laminare.
  3. Preriscaldare la piastra a 4 pozzi con ovocita IVM medium a 37 °C in aria umidificata contenente il 5% di CO2 e il 5% di O2 almeno 6 ore prima dell'uso.

4. Somministrare l'anestesia in una sala operatoria

  1. Controllare il nome del paziente prima di somministrare l'anestesia.
  2. Anestetizzare per via endovenosa il paziente dall'anestesista.

5. Eseguire il recupero degli ovociti

  1. Contrassegna le etichette con nome, data e ID sui piatti e sui tubi della cultura.
  2. Posizionare il paziente nella posizione di litotomia della vescica; disinfettare costantemente, drappeggiare e strofinare la vagina con soluzione salina calda.
  3. Posizionare la sonda ad ultrasuoni all'interno della vagina; scansionare e registrare il numero di follicoli in entrambe le ovaie. Trova la posizione più vicina all'ovaio come sito di puntura ed evita l'intestino, la vescica e i grandi vasi sanguigni.
  4. Aspirare il liquido follicolare.
    1. Lavare l'ago con un mezzo di manipolazione stabile al pH prima di forare (vedere Tabella dei materiali).
    2. Iniettare l'ago di aspirazione da 19 G a singolo lume nelle ovaie sotto la guida degli ultrasuoni.
    3. Perforare follicoli più grandi con confini chiari più vicini alla sonda. In posizione bassa, iniettare rapidamente la soluzione di risciacquo integrata con 25 U/mL di eparina. Aspirare il liquido follicolare con l'ago sotto una pressione di 80-90 mmHg, ruotando leggermente l'ago per aspirare il più possibile il liquido follicolare. Perforare altri follicoli dal lato vicino a quello lontano su questo piano.
      NOTA: Durante l'aspirazione, il liquido follicolare contenente ovociti fluirà in una provetta sterile da 10 ml a pressione negativa. L'eparina può ridurre la viscosità del fluido follicolare per facilitare il processo di aspirazione.
    4. Rimuovere l'ago dall'ovaio (tenere l'ago nella parete vaginale). Regolare la direzione della sonda ad ultrasuoni e perforare i follicoli rimanenti su altri piani. Prova ad aspirare tutti i follicoli con un diametro di ~ 5-9 mm.
      NOTA: Regolare la posizione della sonda per mantenerla sempre più vicina alle ovaie. Premere il fornice vaginale con la forza appropriata per ridurre lesioni e sanguinamento.
    5. Estrarre l'ago dopo aver finito in un'ovaia, lavare l'ago con il mezzo di manipolazione e perforare l'altro lato con lo stesso metodo.
      NOTA: Aspirazione completa del follicolo entro 25-30 min.
  5. Trasferire il fluido follicolare dalla sala operatoria al laboratorio di fecondazione in vitro entro pochi minuti dalla conferma del nome e dell'ID del paziente.
    NOTA: Trasferire il liquido follicolare aspirato al banco di laboratorio IVF il prima possibile per prevenire la coagulazione.
  6. Rileva l'emorragia attiva nella cavità pelvica con l'ecografia B-mode dopo aver perforato tutti i follicoli. Inserire uno speculum e puntare la punta verso il fornice posteriore per rilevare il sanguinamento attivo nel sito di puntura.
    NOTA: Nessun sanguinamento attivo deve essere osservato nel sito di puntura vaginale se la posizione ovaia è normale e il recupero degli ovociti viene eseguito con attenzione. Per un leggero sanguinamento che continua anche dopo la compressione, tenere una garza sterile comprimere nella vagina per 2-4 ore. Controllare il sanguinamento eccessivo da piccole arterie utilizzando morsetti con pinza vascolare per 2-4 ore. Il sanguinamento nella cavità pelvica o nell'ovaio, che accade raramente, dovrebbe essere controllato mediante elettrocoagulazione mediante chirurgia laparoscopica.

6. Chirurgia ginecologica

  1. In base alle esigenze e alle condizioni del paziente, eseguire un intervento chirurgico ginecologico appropriato dopo il recupero degli ovociti.
    1. Eseguire un intervento chirurgico di perforazione ovarica laparoscopica per pazienti con sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) con resistenza al clomifene.
    2. Eseguire chirurgia ginecologica benigna per pazienti infertili prima del trattamento ART, come miomectomia isteroscopica, polipectomia, resezione transcervicale del setto e chirurgia tubarica laparoscopica e ovariocistectomia.
    3. Eseguire l'ovariectomia per la crioconservazione della fertilità di pazienti con cancro o malattia ematologica che necessitano di ricevere chemioradioterapia.
      NOTA: Questi interventi chirurgici ginecologici sono operazioni cliniche di base e standardizzate. Le linee guida operative in vari paesi e ospedali dovrebbero essere relativamente simili.

7. Eseguire IVM

NOTA: Eseguire l'intero processo di IVM su un piano omotermico a 37 °C.

  1. Filtrare il fluido follicolare aspirato con un filtro a cellule di nylon da 70 μm. Risciacquare ripetutamente il tubo di coltura e il filtro con un mezzo di manipolazione preriscaldato stabile al pH. Assicurarsi che tutti i COC immaturi siano completamente trasferiti al piatto di coltura. Raccogliere il fluido filtrato, risciacquare e coltura in una capsula di Petri da 100 x 15 mm.
  2. Esaminare i COC (Figura 2) sotto lo stereoscopio con ingrandimento 40x. Trasferire rapidamente gli immaturi in un mezzo ovocitario IVM preriscaldato.
    NOTA: scegliere un ingrandimento appropriato in base all'abitudine dell'operatore.
  3. Registrare il numero di COC immaturi coltivati.
  4. Informare il paziente sul numero di COC coltivati. Discutere la raccolta di sperma con i pazienti e i loro partner. Eseguire l'estrazione dello sperma secondo la normale procedura.
  5. Coltura i COC immaturi a 37 °C in aria umidificata contenente il 5% di CO2 e il 5% di O2 per 28-32 ore.
  6. Valutare la maturità degli ovociti.
    1. Denudere le cellule del cumulo mediante pipettaggio ripetuto utilizzando una pipetta Pasteur di vetro sotto lo stereoscopio con ingrandimento 40x. Esaminare l'estrusione del corpo polare (PB) per identificare lo stadio di sviluppo degli ovociti. Vedere la Figura 2 per immagini rappresentative di ovociti in COC, metafase II (MII), metafase I (MI) e vescicole germinali (GV) con chiare caratteristiche morfologiche.
      NOTA: Utilizzare una fiamma verticale (ad esempio, di un bruciatore Bunsen) per regolare il diametro della pipetta Pasteur di vetro alle dimensioni di un ovocita.
    2. Conta gli ovociti MII e registra il numero.
    3. Scegli ovociti maturi per la fecondazione in vitro o la vitrificazione.
      NOTA: Raccogliere lo sperma il giorno in cui gli ovociti maturano per la fecondazione in vitro, ma non per la vitrificazione degli ovociti.
    4. Coltura gli ovociti immaturi nello stadio GV e MI nel terreno di coltura IVM originale con cellule cumuliformi per altre 10-14 ore. Ripetere i passaggi 7.6.2-7.6.3.

8. Eseguire ICSI o vitrificazione degli ovociti

  1. Seguire la procedura standard del centro riproduttivo8.

9. Coltura di embrioni ed esecuzione della crioconservazione degli embrioni

  1. Seguire la procedura standard del centro riproduttivo8.

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Risultati

Fino a dicembre 2019, OP-IVM è stato utilizzato per la conservazione della fertilità di 274 pazienti. Gli esiti embriologici e riproduttivi di 158 pazienti tra il 2014 e il 2016 sono stati pubblicati in un precedente articolo8. L'esempio seguente illustra la procedura seguita per un paziente PCOS che riceve OP-IVM nel 2016. Il paziente è un 28enne con diagnosi di infertilità primaria, cisti annessiale sinistra e PCOS. Ha ricevuto cistectomia laparoscopica e OP-IVM ...

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Discussione

Il metodo OP-IVM descritto in questo articolo si estende alle applicazioni IVM convenzionali e combina L'IVM dopo il recupero degli ovociti con la chirurgia ginecologica di routine. Gli ovociti che sarebbero stati persi nella chirurgia ginecologica possono ora essere utilizzati per IVF-ET o FP senza ulteriori rischi chirurgici. OP-IVM è stato utilizzato per la prima volta per recuperare gli ovociti prima della perforazione ovarica nelle pazienti con PCOS. La sua applicazione si è presto estesa ai pazienti infertili che n...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del China National Key R&D Program (n. 2017YFC1002000, 2018YFC1004001, 2019YFA0801400), della National Science Foundation of China (n. 81571386, 81730038), del CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-001) e dello Special Research Project of Chinese Capital Health Development (2018-2-4095).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Aghi di aspirazione a lume singolo da 19 GCook, AustraliaK-OPS-7035-REH-ET
Piastra a 4 pozzettiCorning
70 μ m filtro cellularein nylon Falcon, USA352350
CO2 IncubatoreThermo
Culture oilVitrolife, Svezia10029,OVOIL Passaggio 3.2.
FSH & LHFerring Salute Riproduttiva, GermaniaMENOPUR®
Pipetta in vetro PasteurHilgenberg GmbH, Germania3154102-26
G-MOPS mediuma pH stabile Mezzo di manipolazione per il lavaggio dell'ago prima della perforazione
del terreno IVMOrigio, DanimarcaART-1600-B
Banchi di pulizia a flusso laminareESCO
Piastra di PetriThermo Fisher Scientific, Danimarca263991
Terreni di manipolazione a pH stabile progettati per supportare la manipolazione e la manipolazione di ovociti ed embrioni al di fuori dell'incubatriceVitrolife, Svezia10130, G-MOPS PLUSStep 7.1.
Soluzione di risciacquoCook, AustraliaK-SIFB-100
StereoscopioNikon

Riferimenti

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Formal Correction: Erratum: OP-IVM: Combining In vitro Maturation after Oocyte Retrieval with Gynecological Surgery
Posted by JoVE Editors on 6/26/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: OP-IVM: Combining In vitro Maturation after Oocyte Retrieval with Gynecological Surgery. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2 of the Protocol was updated from:

Add 0.5 mL of IVM medium supplemented with 0.075 IU/mL of follicle-stimulating hormone (FSH) and 0.075 IU/mL of luteinizing hormone (LH) to each well of a 4-well plate. Cover the medium with oil.

to:

Add 0.5 mL of IVM medium supplemented with 0.75 IU/mL of follicle-stimulating hormone (FSH) and 0.75 IU/mL of luteinizing hormone (LH) to each well of a 4-well plate. Cover the medium with oil.

The legend for Figure 2 was updated from:

Figure 2: Morphological characteristics of representative images of oocytes. (A) COCs, (B) MII, (C) MI, (D) GV stage. Abbreviations: COCs = cumulus-oocyte complexes; GV = germinal vesicle; MI = metaphase I; MII = metaphase II.

to:

Figure 2: Morphological characteristics of representative images of oocytes. (A) COCs, (B) GV, (C) MI, (D) MII stage. Abbreviations: COCs = cumulus-oocyte complexes; GV = germinal vesicle; MI = metaphase I; MII = metaphase II.

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