Preparazione e iniezione di embrioni di zanzare Culex per generare mutazioni nulle utilizzando CRISPR / Cas9

Sommario

CRISPR/Cas9 è sempre più utilizzato per caratterizzare la funzione genica in organismi non modello. Questo protocollo descrive come generare linee knock-out di Culex pipiens, dalla preparazione di miscele di iniezione, all'ottenimento e all'iniezione di embrioni di zanzara, nonché come allevare, incrociare e schermare le zanzare iniettate e la loro progenie per le mutazioni desiderate.

Abstract

Le zanzare Culex sono i principali vettori di diverse malattie che hanno un impatto negativo sulla salute umana e animale, tra cui il virus del Nilo occidentale e le malattie causate da nematodi filariali come la filaria canina e l'elefantiasi. Recentemente, l'editing del genoma CRISPR / Cas9 è stato utilizzato per indurre mutazioni dirette al sito iniettando una proteina Cas9 che è stata complessata con un RNA guida (gRNA) in embrioni appena deposti di diverse specie di insetti, comprese le zanzare che appartengono ai generi Anopheles e Aedes. Manipolare e iniettare zanzare Culex è leggermente più difficile in quanto queste zanzare depongono le uova in posizione verticale in zattere piuttosto che individualmente come altre specie di zanzare. Qui descriviamo come progettare gRNA, complessarli con la proteina Cas9, indurre le zanzare femmine di Culex pipiens a depostare le uova e come preparare e iniettare embrioni appena deposti per la microiniezione con Cas9 / gRNA. Descriviamo anche come allevare e schermare le zanzare iniettate per la mutazione desiderata. I risultati rappresentativi dimostrano che questa tecnica può essere utilizzata per indurre mutazioni site-directed nel genoma delle zanzare Culex e, con lievi modifiche, può essere utilizzata per generare mutanti nulli anche in altre specie di zanzare.

Introduzione

Le zanzare Culex sono distribuite in tutte le regioni temperate e tropicali del mondo e trasmettono diversi virus mortali tra cui il virus del Nilo occidentale^{1, l'encefalite}di St. Louis² e i nematodi filariali che causano la filaria canina³ e l'elefantiasi⁴. I membri del complesso Culex pipiens, che comprende Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens e Cx. pipiens molestus, mostrano variazioni sorprendenti in molti aspetti della loro biologia. Ad esempio, mentre Cx. quinquefasciatus e Cx. pipiens molestus

Protocollo

Nella maggior parte degli istituti di ricerca, un protocollo di biosicurezza approvato deve essere in atto prima che gli insetti transgenici siano generati o mantenuti per garantire che gli organismi geneticamente modificati non sfuggano o vengano rimossi dalla struttura di laboratorio. Potrebbero essere applicati anche ulteriori regolamenti governativi. Prima di iniziare un progetto di questa natura, controllare tutte le politiche e le procedure istituzionali per determinare quali documenti e approvazioni sono necessari.

1. Progettazione di gRNA e preparazione di miscele di iniezione

1. Progettare 2-5 gRNA per ciasc....

Risultati

Utilizzando il protocollo descritto, siamo stati in grado di iniettare con successo embrioni di Cx. pipiense abbiamo osservato un alto tasso di sopravvivenza tra gli embrioni iniettati (~ 55%, Figura 1). Gli studi precedenti avevano una percentuale inferiore di sopravvivenza, probabilmente perché l'anteriore del follicolo dell'uovo era attaccato alla striscia medicazione, impedendo alle larve di zanzara di sfuggire al coro e nuotare con successo nell'acqua. Garantire che l'estremità.......

Discussione

Questo protocollo presenta metodi per introdurre mutazioni specifiche nel genoma delle zanzare Culex e può essere utilizzato anche per modificare il genoma di altre zanzare. Il protocollo è significativo in quanto fornisce dettagli specifici non solo su come preparare i materiali di iniezione, ma anche una panoramica video dettagliata su come indurre le zanzare a dedurre le uova, nonché su come preparare e iniettare quelle uova. Riassumiamo anche come sfruttare la biologia della femmina Cx. pipiens per .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Alimentatore a membrana artificiale	Hemotek	SP5W1-3	Ubicazione dell'azienda: Blackburn, Regno Unito
ATP	Invitrogen	18330019	Ubicazione dell'azienda: Carlsbad, CA, USA
Tubi mirocapillari in vetro borosilicato, diametro esterno 1 mm	World Precision Instruments	1B100-6	Ubicazione dell'azienda: Sarasota, FL, USA
Smussatrice ad ago BV10	Sutter Instruments	BV-10-B	Ubicazione dell'azienda: Nobato, CA, USA
Carta da filtro circolare Whatman (12,5 cm)	Sigma Aldrich	WHA1001125	Ubicazione dell'azienda: St. Louis, MO, USA
Tubo conico (50 mL)	Thermo Fisher Scientific	339652	Ubicazione dell'azienda: Waltham, MA, USA
Carta da filtro per corsi Fisherbrand con portata elevata	Thermo Fisher Scientific	09-800	Ubicazione dell'azienda: Waltham, MA, USA
Vetro di copertura (24 x 40 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-311-20	Sede dell'azienda: Waltham, MA, USA
Madre dentale	Henry Schein Inc	1010171	Ubicazione dell'azienda: Melville, NY USA
Nastro biadesivo scozzese	Thermo Fisher Scientific	NC0879005	Ubicazione dell'azienda: Waltham, MA, USA
Microiniettore FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000021	: Amburgo, Germania
Fiala di vetro (2 dram)	Thermo Fisher Scientific	033401C	Ubicazione dell'azienda: Waltham, MA, USA
Olio di alocarburi	Sigma Aldrich	H8898-50ML	Ubicazione dell'azienda: St. Louis, MO, USA
Estrattore per aghi laser P-2000	Sutter Instruments	P-2000/G	Ubicazione dell'azienda: Nobato, CA, USA
Parafilm	Thermo Fisher Scientific	50-998-944	Ubicazione e coinvolgimento: Waltham, MA, USA
Estrattore per aghi ponderato PC-100	Narishige	PC-100	Questo è compatibile con il precedente modello PC-10, che è stato interrotto. Ubicazione dell'azienda: Amityville, NY, USA
Kit Phire Direct PCR Thermo	Fisher Scientific	F140WH	Ubicazione dell'azienda: Waltham, MA, USA
Kodak Photo-Flo (1%)	Thermo Fisher Scientific	50-268-05	Ubicazione dell'azienda: Waltham, MA, USA
Provette mirocapillari in vetro di quarzo, diametro esterno di 1 mm	Forniture di tubi capillari Limited	QGCT 1.0	Ubicazione dell'azienda: Cornovaglia, Regno Unito
Guida-it&commercio; Kit di screening sgRNA	Takara, Bio USA	632639	Questo kit consente di determinare se i gRNA tagliano le sequenze di DNA in vitro. Ubicazione dell'azienda: Mountain View, CA, USA
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2-100ML	Ubicazione dell'azienda: St. Louis, MO, USA
Piccole piastre di Petri (35X10 mm)	Thermo Fisher Scientific	50-190-0273	Ubicazione dell'azienda: Waltham, MA, USA
Acido citrato di sodio sangue di pollo	Lampire biologicals	7201406	Ubicazione dell'azienda: Everett, PA, USA
Piastra di Petri quadrata Fisherbrand (10 cm x 10 cm)	Thermo Fisher Scientific	FB0875711A	Sede dell'azienda: Waltham, MA, USA
Tegaderm	Henry Schein Inc.	7771180	Indirizzo dell'azienda: Melville, NY USA
Cibo per pesci tropicali	Tetramin	N/A
Carta da filtro Whatman	Thermo Fisher Scientific	09-927-826	Luogo in cui si trova l'azienda: Waltham, MA, USA
Carta da filtro Whatman, 4.25 cm	Sigma Aldrich	1001-042	Luogo in cui si trova l'azienda: St. Louis, MO, USA