Articolo metodologico
Il metodo presentato prevede lo stiramento uniassiale di idrogel morbidi 3D incorporati nella gomma siliconica, consentendo al contempo la microscopia confocale viva. Vengono dimostrate la caratterizzazione dei ceppi idrogel esterni e interni e l'allineamento delle fibre. Il dispositivo e il protocollo sviluppati possono valutare la risposta delle cellule a vari regimi di deformazione.
Le forze esterne sono un fattore importante nella formazione, nello sviluppo e nella manutenzione dei tessuti. Gli effetti di queste forze sono spesso studiati utilizzando metodi specializzati di stretching in vitro. Vari sistemi disponibili utilizzano barelle basate su substrato 2D, mentre l'accessibilità delle tecniche 3D per filtrare gli idrogel morbidi è più limitata. Qui descriviamo un metodo che consente lo stiramento esterno di idrogel morbidi dalla loro circonferenza, utilizzando una striscia elastica in silicone come portacampcampo. Il sistema di stretching utilizzato in questo protocollo è costruito con parti stampate in 3D ed elettronica a basso costo, rendendolo semplice e facile da replicare in altri laboratori. Il processo sperimentale inizia con idrogel di fibrina morbida spessi (>100 μm) (modulo elastico di ~ 100 Pa) in un ritaglio al centro di una striscia di silicone. I costrutti in silicone-gel vengono quindi attaccati al dispositivo di stiramento stampato e posizionati sullo stadio del microscopio confocale. Sotto microscopia dal vivo viene attivato il dispositivo di allungamento e i gel vengono immagini a varie grandezze di allungamento. L'elaborazione delle immagini viene quindi utilizzata per quantificare le deformazioni del gel risultanti, dimostrando ceppi relativamente omogenei e allineamento delle fibre attraverso lo spessore 3D del gel (asseZ). I vantaggi di questo metodo includono la capacità di filtrare idrogel estremamente morbidi in 3D durante l'esecuzione della microscopia in situ e la libertà di manipolare la geometria e le dimensioni del campione in base alle esigenze dell'utente. Inoltre, con un adeguato adattamento, questo metodo può essere utilizzato per allungare altri tipi di idrogel (ad esempio collagene, poliacrilammide o polietilene glicole) e può consentire l'analisi delle cellule e la risposta dei tessuti alle forze esterne in condizioni 3D più biomimetiche.
La risposta dei tessuti alle forze meccaniche è parte integrante di una vasta gamma di funzioni biologiche, tra cui l'espressione genica1,ladifferenziazione cellulare 2e il rimodellamento deitessuti 3. Inoltre, i cambiamenti indotti dalla forza nella matrice extracellulare (ECM) come l'allineamento e la densificazione delle fibre possono influire sul comportamento cellulare e sullaformazione dei tessuti 4,5,6. La struttura in rete fibrosa dell'ECM ha intriganti proprietà meccaniche, come elasticità non li....
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1. Preparazione della soluzione (da eseguire in anticipo)
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I dati rappresentativi provenienti da un tratto statico di magnitudini crescenti applicato alla striscia di silicone che trasporta un idrogel di fibrina 3D, incorporato con perline fluorescenti da 1 μm, sono mostrati nella figura 9. L'analisi dimostra l'effetto dell'allungamento del silicone sui cambiamenti geometrici del cut-out e sui ceppi sviluppati all'interno del gel. Le immagini z-stackdell'intero gel vengono utilizzate per valutare la deformazione del ritaglio origin.......
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Il metodo e il protocollo qui presentati si basano in gran parte sul nostro precedente studio di Roitblat Riba etal.
I principali vantaggi del metodo presentato rispetto agli approcci esistenti includono la possibilità di sforzare idrogel 3D molto morbidi (modulo elastico di ~ 100 Pa) dalla loro circonferenza e sotto imaging confocale dal vivo. Altri metodi sono solitamente limitati nella loro capacità di applicare campi di deformazione nell'asse .......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Alcune figure incluse qui sono state adattate su autorizzazione del Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Sforzo idrogel 3D con ceppi uniformi dell'asse Z, consentendo al contempo l'imaging di microscopia dal vivo, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 546 acido carbossilico, estere succinimidilico | Invitrogen | A20002 | |
| Cell Medium (DMEM High Glucose) | Biological Industries | 01-052-1A | Aggiungere 10% FBS, 1% PNS, 1% L-glutammina, 1% Sodium Piruvato |
| Cover Slip #1.5 | Bar-Naor Ltd. | BN72204-30 | 22&volte; 40 mm |
| DIMETIL SOLFOSSIDO 99,5% GC DMSO | Sigma-Aldrich Inc. | D-5879-500 ML | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco | Biological Industries | 02-023-1A | |
| EVICEL Sigillante di fibrina (umano) | Omrix Biopharmaceuticals | 3902 | Fibrinogeno: 70 mg/mL, Trombina: 800-1200 UI/mL |
| Fibrinogeno Tampone | N/A | Ricetta per 1L: 7 g di NaCl, 2,94 g di citrato trisodico diidrato, 9 g di glicina, 20 g di arginina cloridrato e 0,15 g di cloruro di calcio diidrato. Portare il volume finale a 1L con PuW (pH 7,0-7,2) | |
| Microsfere fluorescenti FluoSpheres (1 µ m) | Invitrogen | F8820 | Arancione (540/560) Fornito in sospensione (2% di solidi) in acqua più 2 mM di sodio azide |
| Gomma siliconica per alte temperature | McMaster-Carr | 3788T41 | 580 µ m-spessore E = 1,5 Mpa Rapporto di Poisson = 0,48 Resistenza alla trazione = 4,8 MPa Limite superiore di allungamento = +300% di deformazione ingegneristica |
| Colonna di desalinizzazione HiTrap 5 mL (Sephadex G-25 imballato) | GE Healthcare | 17-1408-01 | |
| HIVAC-G Composto sigillante ad alto vuoto | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | HIVAC-G 100 | |
| ImageJ FIJI software39 | National Institute of Health, Bethesda, MD | Versione 1.8.0_112 | |
| Microcontrollore (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) | Arduino/Adafruit | Arduino-DK001/Adafruit-1438 | |
| MicroVL 21R Centrifuga | Thermo Scientific | 75002470 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Microscopio ottico | Primovert Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. | 491206-0011-000 | |
| SCyUS CAD (Solidworks) | Dassault Systè mes | N/A | |
| SCyUS Code37 | >N/A | N/A | |
| Servomotore - TowerPro SG-5010 | Adafruit | 155 | |
| SL 16R Centrifuga | Thermo Scientific 75004030 | Per 50 provette mL | |
| Sterili 10 cm piastre non di coltura | Corning | 430167 | |
| Tampone per trombina | N/A | Ricetta per 1L: 20 g di mannitolo, 8,77 g di NaCl, 2,72 g di acetato di sodio triidrato, 24 ml di albumina sierica umana al 25%, 5,88 g di cloruro di calcio. Porta il volume finale a 1 litro con PuW (pH 7,0) | |
| Tripsina EDTA Soluzione B (0,25%), EDTA (0,05%) | Cavo USB Biological Industries | 03-052-1B | |
| (da tipo B maschio a tipo A maschio) | N/A | N/A | |
| Zeiss LSM 880 Microscopio confocale | Carl Zeiss AG | 2811000417 | |
| ZEN 2.3 SP1 FP3 (nero) | Carl Zeiss AG | Release Version 14.0.0.0 |
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