Le interazioni neurone-glia nella neurodegenerazione non sono ben comprese a causa di strumenti e metodi inadeguati. Qui, descriviamo protocolli ottimizzati per ottenere neuroni indotti, cellule precursori degli oligodendrociti e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti umane e forniamo esempi dei valori di questi metodi nella comprensione dei contributi specifici del tipo di cellula nella malattia di Alzheimer.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Generazione di neuroni umani e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti per la modellazione delle interazioni neurone-oligodendrociti
* These authors contributed equally
In questo articolo
Avviso di errata corrige
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Sommario
Abstract
Nella malattia di Alzheimer (AD) e in altri disturbi neurodegenerativi, l'insufficienza oligodendrogliale è una caratteristica patologica precoce comune, ma il modo in cui contribuisce allo sviluppo e alla progressione della malattia, in particolare nella materia grigia del cervello, rimane in gran parte sconosciuto. La disfunzione delle cellule della linea oligodendrocitaria è caratterizzata da carenze nella mielinizzazione e compromissione dell'auto-rinnovamento delle cellule precursori degli oligodendrociti (OPC). Questi due difetti sono causati almeno in parte dall'interruzione delle interazioni tra neurone e oligodendrociti lungo l'accumulo di patologia. Gli OPC danno origine a oligodendrociti mielinizzanti durante lo sviluppo del SNC. Nella corteccia cerebrale matura, le OPC sono le principali cellule proliferative (che comprendono ~ 5% delle cellule cerebrali totali) e controllano la formazione di nuova mielina in modo dipendente dall'attività neurale. Tali comunicazioni neurone-oligodendrocita sono significativamente poco studiate, specialmente nel contesto di condizioni neurodegenerative come l'AD, a causa della mancanza di strumenti appropriati. Negli ultimi anni, il nostro gruppo e altri hanno compiuto progressi significativi per migliorare i protocolli attualmente disponibili per generare neuroni funzionali e oligodendrociti individualmente da cellule staminali pluripotenti umane. In questo manoscritto, descriviamo le nostre procedure ottimizzate, compresa la creazione di un sistema di co-coltura per modellare le connessioni neurone-oligodendrocitario. I nostri risultati illustrativi suggeriscono un contributo inaspettato da OPC / oligodendrociti all'amiloidosi cerebrale e all'integrità delle sinapsi ed evidenziano l'utilità di questa metodologia per la ricerca sull'AD. Questo approccio riduzionista è un potente strumento per sezionare le specifiche interazioni eterocellulari dalla complessità intrinseca all'interno del cervello. I protocolli che descriviamo qui dovrebbero facilitare studi futuri sui difetti oligodendrogliali nella patogenesi della neurodegenerazione.
Introduzione
Le cellule della linea oligodendrocitaria, comprese le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC), gli oligodendrociti mielinizzanti e i tipi di transizione intermedi, costituiscono un gruppo importante di cellule cerebrali umane1 che partecipano attivamente a molte funzioni critiche per il corretto funzionamento e mantenimento del nostro sistema nervoso centrale durante lo sviluppo neurale e l'invecchiamento 2,3,4 . Mentre gli oligodendrociti sono ben noti per la produzione di mielina per facilitare la trasmissione dell'attività neuronale e suppor....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Induzione di neuroni umani da cellule staminali pluripotenti umane
- Preparazione del lentivirus (~5 giorni, protocollo dettagliato come descritto in precedenza16)
- Piastra ~ 1 milione di cellule HEK293T ogni pallone T75, per averle ~ 40% confluenti durante l'esecuzione della trasfezione. Trasfettarli con plasmidi che esprimono Ngn2 inducibile da tetraciclina e gene resistente alla puromicina (PuroR; sotto lo stesso controllo del promotore TetO), rtTA e i tre plasmidi helper pRSV-REV, pMDLg/pRRE e VSV-G (12 μg di DNA vettore lentivirale e 6 μg di ciascuno dei DNA plasmidi helper). Preparare almeno tre palloni per preparazione d....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Generazione diretta di neuroni umani indotti da cellule staminali pluripotenti umane
È molto importante che le cellule staminali pluripotenti umane di partenza mostrino un alto grado di pluripotenza per la generazione di successo di iNs o iOPC / iOL. Pertanto, le cellule dovrebbero essere colorate per marcatori specifici, come Oct4 e SOX2, prima di iniziare uno dei protocolli di induzione descritti nel presente manoscritto (Figura 1A). Le cellule H1 umane sono state utili.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Oltre al supporto fisico e metabolico per stabilizzare le strutture sinaptiche e facilitare la conduzione del segnale saltatorio da parte della mielinizzazione, le cellule del lignaggio oligodendrocitario possono modellare il modello di attività neuronale attraverso cross-talk rapidi e dinamici con i neuroni 5,6,7. Mentre nella patologia di AD le risposte oligodendrogliali erano inizialmente considerate semplicemente secondarie .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (R00 AG054616 a Y.A.H. e T32 GM136566 a K.C.), dalla Stanford University School of Medicine e da una Siebel Fellowship (assegnata a S.C.). Y.A.H. è un professore traslazionale GFL presso il Center for Translational Neuroscience del Brown Institute for Translational Sciences.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | |
| B27 supplemento | ThermoFisher | 17504044 | |
| bFGF | ThermoFisher | PHG 0266 | |
| cAMP | MilliporeSigma | A9501 | |
| Clemastine | MilliporeSigma | SML0445 | |
| DMEM/F12 medium | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | |
| Doxiciclina | MilliporeSigma | D3072 | |
| Siero fetale bovino | ScienCell | 10 | |
| H1 cellule ES umane | WiCell | WA01 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| mTeSR plus | STEMCELL Technologies | 5825 | |
| Integratore di N2 | ThermoFisher | 17502001 | |
| Neurobasal A medium | ThermoFisher | 10888-022 | |
| Aminoacidi non essenziali | ThermoFisher | 11140-050 | |
| PDGF-AA | R& D Systems | 221-AA-010 | |
| PEI | VWR | 71002-812 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
| pRSV-REV | Addgene | 12253 | |
| Puromicina | ThermoFisher | A1113803 | |
| ROCK Inibitore Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| SAG | Tocris | 4366 | |
| STEMdiff Progenitore neurale Terreni di congelamento STEMCELL | Technologies | 5838 | |
| STEMdiff SMADi Kit di induzione neurale STEMCELL | Technologies | 8581 | |
| T3 triiodotironina | MilliporeSigma | T6397 | |
| Tempo-iOlogo: OPC umani derivati da iPSC | Tempo BioScience | SKU102 | |
| TetO-Ng2-Puro | Addgene | 52047 | |
| VSV-G | Addgene | 12259 |
Riferimenti
- Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., Pakkenberg, B. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiology of Aging. 29 (11), 1754-1762 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 6....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions
Posted by JoVE Editors on 12/29/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions. The Representative Results section has been updated.
Figure 3 was updated from:
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. (E) Coculturing iOPC with iN leads to the formation of neuron-OPC synapses. The fluorescence-tagged post-synaptic marker PSD95-mCherry is expressed only in OPCs, and display a diffuse pattern in single cultures (left) but aggregate to form puncta in cocultures (right, indicated by arrows; Tuj1, neuronal marker). (F) The expression of well-characterized oligodendroglial genes that can sense and respond to neuronal activities in the pure cultures of iOPCs at Day 14. Please click here to view a larger version of this figure.
The fourth paragraph was updated from:
Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D).
to:
Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D). The iOPCs express a good number of well-characterized genes that can potentially respond to and mediate the activity-dependent signals from neighboring neurons, in a paracrine (e.g. neurotrophins and metabolites) and/or a synaptic manner (Figure 3E and 3F).
