Articolo metodologico

Generazione di neuroni umani e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti per la modellazione delle interazioni neurone-oligodendrociti

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DOI:

10.3791/61778

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9 novembre 2020

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1Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University, 2Department of Neurology, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine, 4Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 5Department of Neurology, Warren Alpert Medical School of Brown University, 6Center for Translational Neuroscience, Robert J. and Nancy D. Carney Institute for Brain Science and Brown Institute for Translational Science, Brown University

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Sommario

Le interazioni neurone-glia nella neurodegenerazione non sono ben comprese a causa di strumenti e metodi inadeguati. Qui, descriviamo protocolli ottimizzati per ottenere neuroni indotti, cellule precursori degli oligodendrociti e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti umane e forniamo esempi dei valori di questi metodi nella comprensione dei contributi specifici del tipo di cellula nella malattia di Alzheimer.

Abstract

Nella malattia di Alzheimer (AD) e in altri disturbi neurodegenerativi, l'insufficienza oligodendrogliale è una caratteristica patologica precoce comune, ma il modo in cui contribuisce allo sviluppo e alla progressione della malattia, in particolare nella materia grigia del cervello, rimane in gran parte sconosciuto. La disfunzione delle cellule della linea oligodendrocitaria è caratterizzata da carenze nella mielinizzazione e compromissione dell'auto-rinnovamento delle cellule precursori degli oligodendrociti (OPC). Questi due difetti sono causati almeno in parte dall'interruzione delle interazioni tra neurone e oligodendrociti lungo l'accumulo di patologia. Gli OPC danno origine a oligodendrociti mielinizzanti durante lo sviluppo del SNC. Nella corteccia cerebrale matura, le OPC sono le principali cellule proliferative (che comprendono ~ 5% delle cellule cerebrali totali) e controllano la formazione di nuova mielina in modo dipendente dall'attività neurale. Tali comunicazioni neurone-oligodendrocita sono significativamente poco studiate, specialmente nel contesto di condizioni neurodegenerative come l'AD, a causa della mancanza di strumenti appropriati. Negli ultimi anni, il nostro gruppo e altri hanno compiuto progressi significativi per migliorare i protocolli attualmente disponibili per generare neuroni funzionali e oligodendrociti individualmente da cellule staminali pluripotenti umane. In questo manoscritto, descriviamo le nostre procedure ottimizzate, compresa la creazione di un sistema di co-coltura per modellare le connessioni neurone-oligodendrocitario. I nostri risultati illustrativi suggeriscono un contributo inaspettato da OPC / oligodendrociti all'amiloidosi cerebrale e all'integrità delle sinapsi ed evidenziano l'utilità di questa metodologia per la ricerca sull'AD. Questo approccio riduzionista è un potente strumento per sezionare le specifiche interazioni eterocellulari dalla complessità intrinseca all'interno del cervello. I protocolli che descriviamo qui dovrebbero facilitare studi futuri sui difetti oligodendrogliali nella patogenesi della neurodegenerazione.

Introduzione

Le cellule della linea oligodendrocitaria, comprese le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC), gli oligodendrociti mielinizzanti e i tipi di transizione intermedi, costituiscono un gruppo importante di cellule cerebrali umane1 che partecipano attivamente a molte funzioni critiche per il corretto funzionamento e mantenimento del nostro sistema nervoso centrale durante lo sviluppo neurale e l'invecchiamento 2,3,4 . Mentre gli oligodendrociti sono ben noti per la produzione di mielina per facilitare la trasmissione dell'attività neuronale e supportare la salute assonale nella sostanza bianca, le OPC sono abbondanti (~ 5%) nella materia grigia dove la mielinizzazione è scarsa e svolgono funzioni di segnalazione dipendenti dall'attività per governare il comportamento di apprendimento e la formazione della memoria 5,6,7,8 . Il modo in cui le cellule oligodendrogliali funzionano e disagiscono nella patogenesi della malattia di Alzheimer (AD) e di altre condizioni neurodegenerative associate all'età è stato poco studiato9. Le inadeguatezze di un sistema modello appropriato e le carenze nella conoscenza generale per guidare un percorso sperimentale in avanti sono le ragioni principali di questa lacuna.

Alla luce delle ultime scoperte nel derivare cellule cerebrali umane da cellule staminali pluripotenti, tra cui le cellule staminali embrionali (ES) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), tali modelli cellulari in combinazione con moderni strumenti di modifica genetica sono emersi come strumenti robusti per gestire l'intricato nesso delle interazioni cellulari nel cervello e sono in grado di dimostrare manifestazioni di malattia specifiche per l'uomo10, 11. Considerando che i singoli tipi di cellule cerebrali possono mostrare effetti distinti e persino contrastanti di fronte alle stesse condizioni che promuovono l'AD12,13, questa metodologia di cellule staminali offre in modo univoco informazioni specifiche sul tipo di cellula che in precedenza sono state perse utilizzando modelli stabiliti in vivo o in vitro che forniscono solo letture aggregate da collezioni di tipi di cellule cerebrali. Nell'ultimo decennio, un buon numero di protocolli affidabili sono stati sviluppati per generare neuroni umani dalla trans-differenziazione di cellule ES/iPS o dalla conversione diretta da altri tipi cellulari terminalmente differenziati (ad esempio, fibroblasti)14,15. In particolare, l'applicazione di fattori chiave di trascrizione neurogenica (ad esempio, neurogenina 2, Ngn2)16 a cellule staminali pluripotenti umane può generare una popolazione omogenea di tipi di cellule neuronali ben caratterizzati per colture pure senza necessità di cocoltura con cellule gliali12,17,18. Per gli oligodendrociti umani indotti, ci sono alcuni protocolli pubblicati che possono generare cellule funzionali molto simili alle loro controparti primarie, con una vasta gamma di efficienza e richiesta di tempo e risorse 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . Ad oggi, nessuno di questi protocolli è stato applicato per studiare come le cellule oligodendrogliali rispondono e influenzano la patogenesi dell'AD.

Qui, descriviamo i nostri protocolli migliorati per colture singole e miste di neuroni indotti umani (iN) e OPC / oligodendrociti (iOPC / iOL). Il protocollo iN qui descritto si basa sull'approccio Ngn216 ampiamente utilizzato e ha la caratteristica aggiuntiva di essere privo di glia. Gli iN risultanti sono omogenei e molto simili ai neuroni eccitatori dello strato corticale 2/3, con morfologia piramidale caratteristica, pattern di espressione genica e caratteristiche elettrofisiologiche17,18 (Figura 1). Per superare alcune delle barriere fondamentali nella differenziazione diretta delle cellule staminali pluripotenti, abbiamo sviluppato un metodo semplice ed efficace di pre-trattamento a basse dosi di dimetilsolfossido (DMSO)29,30 e riportato una maggiore propensione delle cellule ES / iPS umane a transdifferenziarsi in iOPC e iOLs31, basato su un protocollo ampiamente adattato da Douvaras e Fossati 32 . Abbiamo ulteriormente semplificato il protocollo e incorporato un robusto composto che promuove la differenziazione, clemastina 7,33,34, per accelerare il processo di maturazione oligodendrogliale. Di conseguenza (Figura 2), le iOPC possono essere generate in 2 settimane (~95% positivo per il marcatore O4) e iOL in quattro settimane (esprimendo marcatori maturi MBP e PLP1). È interessante notare che abbiamo scoperto che le iOPC da sole secernono una notevole quantità di amiloide-β (Aβ), coerente con i dati trascrittomici indipendenti che mostrano l'abbondante espressione della proteina precursore dell'amiloide (APP) e della proteasi di trasformazione β-secretasi (BACE1) nelle cellule del lignaggio oligodendrocitario35,36. Inoltre, il nostro sistema di co-coltura iN-iOPC promuove l'inguaina degli assoni mediante processi iOL MBP-positivi e fornisce un supporto significativo per la formazione delle sinapsi (Figura 3). Pertanto, i protocolli che abbiamo dettagliato di seguito hanno vantaggi tecnici e biologici rispetto ai metodi di co-coltura neurone-oligodendroglia precedentemente catalogati e promettono di modellare meglio la neurodegenerazione nell'AD.

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Protocollo

1. Induzione di neuroni umani da cellule staminali pluripotenti umane

  1. Preparazione del lentivirus (~5 giorni, protocollo dettagliato come descritto in precedenza16)
    1. Piastra ~ 1 milione di cellule HEK293T ogni pallone T75, per averle ~ 40% confluenti durante l'esecuzione della trasfezione. Trasfettarli con plasmidi che esprimono Ngn2 inducibile da tetraciclina e gene resistente alla puromicina (PuroR; sotto lo stesso controllo del promotore TetO), rtTA e i tre plasmidi helper pRSV-REV, pMDLg/pRRE e VSV-G (12 μg di DNA vettore lentivirale e 6 μg di ciascuno dei DNA plasmidi helper). Preparare almeno tre palloni per preparazione di lentivirus. Utilizzare PEI per la trasfezione seguendo le istruzioni del produttore. Cambiare il supporto dopo 16 ore e scartare.
    2. Harvest ha rilasciato particelle virali raccogliendo terreni di coltura ogni giorno e sostituirli con terreni freschi per 3 giorni. Raggruppare i mezzi raccolti contenenti particelle virali per la purificazione. Filtrare il virus attraverso un filtro da 0,22 μm e centrifugare a 49.000 x g per 90 minuti. Risospendere il pellet nel volume appropriato di glucosio PBS (~150 μL).
  2. Induzione neuronale (~5 giorni)
    NOTA: Questo protocollo di induzione (Figura 1A; diagramma di flusso) è altamente efficace sia per le cellule iPS che ES di pluripotenza convalidata (che può essere dosata mediante colorazione immunoistochimica di marcatori di pluripotenza ben caratterizzati; Figura 1B).
    1. Utilizzare cellule ES umane H1 disponibili in commercio al passaggio di 52 (vedi Tabella dei materiali). Coltura delle cellule su piastre a 6 pozzetti rivestite in soluzione di matrice extracellulare (~0,5 mg di soluzione di matrice per piastra a 6 pozzetti; vedere Tabella dei materiali) utilizzando il mezzo di manutenzione delle cellule ES (vedi Tabella dei materiali) e incubare le piastre a 37 °C con il 5% di CO2.
    2. Il giorno -2, staccare le cellule ES (80% confluenti) con 1 mL di soluzione di distacco cellulare (vedere Tabella dei materiali) e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Trasferire le cellule in un tubo; lavare il pozzetto con 2 ml di fluido e combinare nello stesso tubo. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti, risospendere il pellet in mezzi e placcare le celle su piastre a 6 pozzetti rivestite con matrice alla densità di semina di 1 x 105 celle per pozzetto.
    3. Il giorno -1, aggiungere lentivirus che esprimono Ngn2 più PuroR e rtTA insieme a polibrene (8 μg/ml) alle cellule ES in un mezzo di mantenimento delle cellule ES fresco (vedere Tabella dei materiali). La quantità esatta di virus deve essere determinata dai titoli effettivi o dalla titolazione. In genere aggiungiamo 5 μL per ogni virus per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti.
    4. Il giorno 0, aggiungere Doxiciclina (2 μg/ml, per attivare l'espressione di Ngn2) nel mezzo DMEM-F12 con supplemento di N2 senza morfogeni.
    5. Il giorno 1, aggiungere Puromicina in mezzo fresco di DMEM-F12 più N2 e doxiciclina, alla concentrazione finale di 1 μg/mL di mezzo. Selezionare le cellule trasdotte in Puromicina per almeno 24 ore. Una maggiore concentrazione di puromicina (fino a 5 μg/ml) e un periodo di selezione più lungo (fino a 48 ore) possono essere necessari per rimuovere adeguatamente le cellule sotto-trasdotte se il titolo virale è basso.
    6. Il giorno 2, staccare i neuroni differenzianti con la soluzione di distacco cellulare (vedi Tabella dei materiali) e riplaccarli su piastre da 24 pozzetti (tra 80.000-200.000 cellule / pozzetto) rivestiti con soluzione di matrice (vedi Tabella dei materiali) e mantenerli in mezzo NBA / B27 senza doxiciclina. La densità di semina è fondamentale.
    7. In questa fase, i neuroni distaccati possono essere congelati in un mezzo di congelamento commerciale specializzato (vedi Tabella dei materiali) e conservati in azoto liquido per un massimo di 3 mesi. I neuroni puri possono essere placcati tenendo conto della tipica morte cellulare ~ 15% -20% post-disgelo, coltivati da soli o co-coltivati con altri tipi di cellule cerebrali (vedi passo 3.2.3. per la co-coltura con OPC).
    8. Coltura iNs pura sulle piastre rivestite con soluzioni a base di matrice extracellulare secondo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali). La caratteristica morfologia piramidale dovrebbe essere evidente entro il Giorno 4 (e il Giorno 6; Figura 1C). La formazione di sinapsi può essere rilevata già dal giorno 14 al giorno 16 ed è prominente al giorno 24 mediante colorazione immunoistochimica con marcatori standard pre e post-sinaptici. (Figura 1D; etichettato con il marcatore pre-sinaptico Synapsin 1 e il marcatore dendritico Map2).

2. Induzione di cellule precursori degli oligodendrociti umani (OPC) da cellule staminali pluripotenti e maturazione degli oligodendrociti

  1. Generazione di cellule progenitrici neurali (NPC): protocollo monostrato (~7 giorni). Vedere la Figura 2A per il diagramma di flusso.
    1. Coltura di cellule ES umane H1 come descritto in precedenza (vedi passo 1.2.1.) e trans-differenziarle in cellule progenitrici neurali (NPC) con un approccio consolidato chiamato doppia SMADi, con inibitori di piccole molecole per molteplici vie di segnalazione. Qui utilizziamo un kit commerciale ampiamente accettato e seguiamo il protocollo monostrato fornito dal produttore (vedi Tabella dei materiali).
    2. Il giorno -1, piastra 0,5-1 x 10 6 celle per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti rivestita da una soluzione a matrice ridotta con fattore di crescita (vedi Tabella dei materiali; ~ 0,5 mg di soluzione di matrice per piastra a6 pozzetti) con mezzo di mantenimento delle cellule ES (vedi Tabella dei materiali). Questa soluzione a matrice ridotta del fattore di crescita viene utilizzata per rivestire tutte le piastre che verranno utilizzate nelle fasi successive.
    3. Il giorno 0, trattare le cellule per 24 ore con terreno di mantenimento delle cellule ES (vedi Tabella dei materiali) integrato da DMSO al 2%.
    4. Nei giorni 1-6, sostituire il mezzo di induzione neurale completo con un mezzo di induzione neurale caldo (37 °C) contenente gli inibitori SMAD dal kit commerciale (vedere Tabella dei materiali). Se le cellule si dividono e raggiungono la confluenza prima del giorno 7, passarle alla densità di semina di 0,5-1 x 106, come descritto in precedenza nel passaggio 2.1.2.
    5. Il giorno 7, passaggio NPC utilizzando la soluzione di distacco cellulare (vedi Tabella dei materiali) e piastra ad una densità di semina di 1-2 x 105 celle / pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
    6. Analizzare l'efficienza di differenziazione mediante colorazione immunoistochimica (IHC) per l'assenza di marcatori di pluripotenza, ad esempio OCT4, e la presenza di marcatori NPC come PAX6, Nestin e Sox1.
    7. In questa fase, gli NPC distaccati possono essere congelati nei mezzi di congelamento NPC commerciali specializzati (vedi Tabella dei materiali) e conservati in azoto liquido per un massimo di 3 mesi. Dopo il congelamento e lo scongelamento per una volta, gli NPC mantengono ancora la multipotenza per dare origine a neuroni, astrociti e OPC con protocolli affidabili.
  2. Generazione di cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) (~7 giorni). Vedere la Figura 2A per il diagramma di flusso.
    1. Il giorno 7, far passare gli NPC usando la soluzione di distacco cellulare (vedi Tabella dei materiali) e placcarli a una densità di semina di 1-2 x 105 cellule per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti in mezzo di induzione neurale caldo (37 ° C) più inibitori SMAD dal kit commerciale (vedi Tabella dei materiali).
    2. Il giorno 8, preparare una soluzione di DMSO all'1% nel mezzo di differenziazione OPC e trattare gli NPC placcati per 24 ore. Il mezzo di differenziazione OPC è composto da: DMEM/F12 medio, 1% supplemento N2, 1% B27 supplemento, bFGF a 20 ng/mL, SAG a 1 μM, PDGF-AA a 10 ng/mL (vedi Tabella dei materiali).
    3. Il giorno 9, sostituire i supporti con un nuovo mezzo di differenziazione OPC senza DMSO. Nutrire le cellule a giorni alterni fino al giorno 15. Se le cellule raggiungono la confluenza prima del giorno 15, passarle alla densità di semina di 1-2 x 105 cellule per pozzetto come descritto al punto 2.2.1.
    4. Il giorno 14, OPC di piastre in mezzo di differenziazione OPC ad una densità di 1-2 x 105 celle / pozzetto in una piastra a 24 pozzetti.
    5. In questa fase (Giorno 15), celle di prova per la presenza di marcatori OPC-specifici mediante colorazione IHC o qPCR (ad esempio, O4, Olig1/2, CSPG4/Ng2, NKX2.2, PDGFRa; Figura 2B) e per l'assenza di marcatori NPC (Pax6 o Nestin; Figura 2D). In genere rileviamo l'immunoreattività O4 in oltre il 95% delle cellule al giorno 15. Di particolare rilevanza per la malattia di Alzheimer, l'espressione di APP (proteina precursore dell'amiloide), BACE1 (la proteasi di trasformazione β-secreatasi 1) e peptide amiloide-β (Aβ) è abbondante nelle OPC (Figura 2F).
  3. Maturazione degli oligodendrociti (OL) (~7–20 giorni)
    1. Il giorno 15, sostituire i terreni con il terreno di maturazione OL: terreno neurobasale-A, supplemento di B27 al 2%, cAMP da 1 μM, triiodotironina T3 da 200 ng/ml e Clemastina da 1 μM (vedere Tabella dei materiali). Cambia il mezzo a giorni alterni o ogni giorno, se necessario.
    2. Quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, dividersi in un rapporto 1: 3 fino a 2 passaggi o fino a quando la divisione cellulare rallenta sostanzialmente. Se gli OPC si dividono troppo velocemente e raggiungono la confluenza in meno di 3 giorni, aggiungere Ara-C (vedi Tabella dei materiali) ad una concentrazione di 2-5 μM per 1-3 giorni. La proliferazione attiva indica una ridotta efficienza di maturazione.
    3. Esaminare l'efficienza della maturazione oligodendrogliale valutando l'espressione di marcatori OL, ad esempio CLDN11, PLP1, MBP mediante qPCR, colorazione IHC o immunoblotting. La morfologia caratteristica di strutture altamente complesse (Figura 2C) e l'espressione dei marcatori OL (Figura 2E) dovrebbero essere prontamente rilevate entro il Giorno 28.

3. Co-coltura di neuroni umani indotti (iNs) e cellule precursori degli oligodendrociti (iOPCs)

  1. placcatura iOPC (~3 giorni)
    1. IOPC a piastra al giorno 14 ad una densità di 1 x 105 celle per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti (come descritto sopra al punto 2.2.4.) nel mezzo di differenziazione OPC (come descritto nella fase 2.2.2.).
  2. Creazione della co-cultura iN-iOPC
    1. Il giorno 15, staccare i neuroni umani indotti nella fase del giorno 2 dopo la selezione della puromicina (come descritto nella fase 1.2.6.) con la soluzione di distacco cellulare (vedere Tabella dei materiali).
    2. Aggiungere neuroni agli OPC in coltura, placcando alla densità di semina di 2 x 105 cellule per pozzetto nella piastra a 24 pozzetti con OPC in crescita (dal punto 3.1.1). Utilizzare il terreno di coltura contenente terreno Neurobasal-A, supplemento di B27 al 2% e triiodotironina T3 da 100 ng / ml. Cambia il mezzo il giorno successivo e poi ogni altro giorno dopo. Se le OPC proliferano troppo velocemente e raggiungono la confluenza in meno di 3 giorni, aggiungere Ara-C ad una concentrazione di 2-5 μM. Un'immagine rappresentativa degli iNs e iOPC cresciuti in co-coltura dopo 7 giorni di neuroni è mostrata nella Figura 3A.
    3. Utilizzare neuroni congelati preparati come descritto sopra nel passaggio 1.2.7 per la co-coltura con OPC. Congelare e scongelare i neuroni delle piastre a una densità maggiore di 3 x 105 cellule per pozzetto.
    4. Dopo il giorno 14-16 nelle co-colture, la formazione di sinapsi nelle iNs può essere osservata dalla colorazione IHC dei marcatori pre- e post-sinaptici, ed entro il giorno 21 il puncta sinaptico dovrebbe essere abbondante (Figura 3C) e le attività neuronali possono essere registrate in modo affidabile.
    5. A partire dal giorno 21, celle di prova per marcatori specifici OL (ad esempio, MBP e PLP1). Dal giorno 28, osserviamo normalmente il fenomeno dell'inguaina degli assoni iN da parte dei processi iOL, etichettato mediante colorazione IHC per marcatori specifici (Figura 3B; neurofilamento NF per assoni iN e MBP per processi iOPC).

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Risultati

Generazione diretta di neuroni umani indotti da cellule staminali pluripotenti umane
È molto importante che le cellule staminali pluripotenti umane di partenza mostrino un alto grado di pluripotenza per la generazione di successo di iNs o iOPC / iOL. Pertanto, le cellule dovrebbero essere colorate per marcatori specifici, come Oct4 e SOX2, prima di iniziare uno dei protocolli di induzione descritti nel presente manoscritto (Figura 1A). Le cellule H1 umane sono state utili...

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Discussione

Oltre al supporto fisico e metabolico per stabilizzare le strutture sinaptiche e facilitare la conduzione del segnale saltatorio da parte della mielinizzazione, le cellule del lignaggio oligodendrocitario possono modellare il modello di attività neuronale attraverso cross-talk rapidi e dinamici con i neuroni 5,6,7. Mentre nella patologia di AD le risposte oligodendrogliali erano inizialmente considerate semplicemente secondarie ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (R00 AG054616 a Y.A.H. e T32 GM136566 a K.C.), dalla Stanford University School of Medicine e da una Siebel Fellowship (assegnata a S.C.). Y.A.H. è un professore traslazionale GFL presso il Center for Translational Neuroscience del Brown Institute for Translational Sciences.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AccutaseSTEMCELL Technologies7920
B27 supplementoThermoFisher17504044
bFGFThermoFisherPHG 0266
cAMPMilliporeSigmaA9501
ClemastineMilliporeSigmaSML0445
DMEM/F12 mediumSTEMCELL Technologies36254
DMSOThermoFisherD12345
DoxiciclinaMilliporeSigmaD3072
Siero fetale bovinoScienCell10
H1 cellule ES umaneWiCellWA01
MatrigelCorning354234
mTeSR plusSTEMCELL Technologies5825
Integratore di N2ThermoFisher17502001
Neurobasal A mediumThermoFisher10888-022
Aminoacidi non essenzialiThermoFisher11140-050
PDGF-AAR& D Systems221-AA-010
PEIVWR71002-812
pMDLg/pRREAddgene12251
PolybreneMilliporeSigmaTR-1003-G
pRSV-REVAddgene12253
PuromicinaThermoFisherA1113803
ROCK Inibitore Y-27632STEMCELL Technologies72302
SAGTocris4366
STEMdiff Progenitore neurale Terreni di congelamento STEMCELLTechnologies5838
STEMdiff SMADi Kit di induzione neurale STEMCELLTechnologies8581
T3 triiodotironinaMilliporeSigmaT6397
Tempo-iOlogo: OPC umani derivati da iPSCTempo BioScienceSKU102
TetO-Ng2-PuroAddgene52047
VSV-GAddgene12259

Riferimenti

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Formal Correction: Erratum: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions
Posted by JoVE Editors on 12/29/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions. The Representative Results section has been updated.

Figure 3 was updated from:

IN-OPC co-culture results; neurofilament staining, synaptic density diagram, marker expression graph.
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Microscopy analysis, astrocyte markers, iOPC-neuron interaction, fluorescence labeling.
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. (E) Coculturing iOPC with iN leads to the formation of neuron-OPC synapses. The fluorescence-tagged post-synaptic marker PSD95-mCherry is expressed only in OPCs, and display a diffuse pattern in single cultures (left) but aggregate to form puncta in cocultures (right, indicated by arrows; Tuj1, neuronal marker). (F) The expression of well-characterized oligodendroglial genes that can sense and respond to neuronal activities in the pure cultures of iOPCs at Day 14. Please click here to view a larger version of this figure.

The fourth paragraph was updated from:

Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D).

to:

Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D). The iOPCs express a good number of well-characterized genes that can potentially respond to and mediate the activity-dependent signals from neighboring neurons, in a paracrine (e.g. neurotrophins and metabolites) and/or a synaptic manner (Figure 3E and 3F). 

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