L'attuale protocollo descrive un metodo per l'isolamento del DNA da campioni di sangue e biopsie intestinali, generazione di librerie PCR TCRβ e IGH per il sequenziamento di nuova generazione, le prestazioni di una corsa NGS e l'analisi dei dati di base.
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Articolo metodologico
Analisi del repertorio immunitario del recettore delle cellule T e B utilizzando il sequenziamento di nuova generazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
La memoria immunologica, il segno distintivo dell'immunità adattiva, è orchestrata da linfociti T e B. In circolazione e in diversi organi, ci sono miliardi di cloni di cellule T e B unici, e ognuno può legare uno specifico antigene, portando alla proliferazione, differenziazione e / o secrezione di citochine. La vasta eterogeneità nelle cellule T e B è generata dalla ricombinazione casuale di diversi segmenti genetici. Le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS), sviluppate nell'ultimo decennio, consentono una visione approfondita senza precedenti del repertorio immunitario del recettore delle cellule T e B. Studi in varie condizioni infiammatorie, immunodeficienze, infezioni e neoplasie maligne hanno dimostrato marcati cambiamenti nella clonalità, nell'uso genico e nelle proprietà biofisiche del repertorio immunitario, fornendo importanti approfondimenti sul ruolo delle risposte immunitarie adattive nei diversi disturbi.
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per NGS del repertorio immunitario delle cellule T e B dal sangue e dai tessuti. Presentiamo una pipeline che parte dall'isolamento del DNA attraverso la preparazione della libreria, sequenziamento sul sequencer NGS e termina con analisi di base. Questo metodo consente l'esplorazione di specifiche cellule T e B a livello nucleotidico o amminoacido, e quindi può identificare cambiamenti dinamici nelle popolazioni di linfociti e parametri di diversità in diverse malattie. Questa tecnica sta lentamente entrando nella pratica clinica e ha il potenziale per l'identificazione di nuovi biomarcatori, stratificazione del rischio e medicina di precisione.
Introduzione
Il sistema immunitario adattivo, composto da linfociti T e B, utilizza la memoria immunologica per riconoscere un antigene precedentemente incontrato e avviare una risposta rapida. I linfociti sono generati nel midollo osseo e maturano nel timo (cellule T) o nel midollo osseo (cellule B). Sia il recettore delle cellule T (TCR) che il recettore delle cellule B (BCR) mostrano configurazioni uniche che consentono il riconoscimento di antigeni specifici. Nell'omeostasi, le cellule T e B circolano e rilevano costantemente i trilioni di diversi peptidi presentati sulle cellule che presentano antigeni. La legazione TCR o BCR di un antigene specifico ad alta affinità, insieme....
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Protocollo
Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale dello Sheba Medical Center e il consenso scritto informato è stato ottenuto da tutti i soggetti partecipanti.
1. Isolamento e quantificazione del DNA
- Digestione elisi cellulare delle biopsie intestinali
- Recuperare le biopsie intestinali, appena raccolte o quelle conservate a -20 °C o -80 °C. Se si utilizzano biopsie congelate, scongelare sul ghiaccio.
- Aggiungere 600 μL di soluzione di lysis nucleica ad un tubo sterile di micro-centrifuga da 1,7 ml, refrigerato sul ghiaccio.
- Mettere la biopsia in un tubo di microcentrifugo con sol....
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Risultati
Qui, descriviamo un metodo per l'isolamento del DNA dal tessuto intestinale e dal sangue, la preparazione di librerie per NGS e i passaggi di base di una corsa di sequenziamento per il sequenziamento del repertorio immunitario. L'esecuzione genererà file fastq, che possono essere ulteriormente convertiti in file fasta per l'utilizzo nella piattaforma internazionale ImMunoGeneTics (IMGT)/HighV-QUEST. Questo HTS esegue e gestisce molte analisi di decine di migliaia di sequenze TCRβ e IGH riorganizzate, al livello nucleotid.......
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Discussione
I cambiamenti nell'abbondanza e nella funzione dei linfociti B e T si incontrano spesso in diverse neoplasie maligne18,disturbi infiammatori cronici (ad esempio colite ulcerosa e artrite reumatoide)10,19e in varie immunodeficienze17,20. Il metodo attuale utilizza NGS per facilitare una visione approfondita dei repertori TCR e BCR, consentendo il rilevamento di sottili cambiamenti n.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2 propanolo | Sigma | I9516-500ML | |
| da 1,7 mL Provette per centrifuga | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL | Greiner | 188261 | |
| Etanolo assoluto | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| Perline AMPure XP | Coltro Beckman | A63881 | |
| Blocco termico | Bioer | Non applicabile | |
| Alta sensibilità D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | Per Tapestation |
| Alta sensibilità D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | Per Tapestation. Provette vendute separatamente |
| Kit di analisi Lymphotrack | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Ciascuna include 24 indici |
| Kit di reagenti MiSeq v2 (500 cicli) | Illumina | MS-102-2003 | Include il tipo di cella a flusso standard e tutti i reagenti necessari |
| Sequenziatore MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Strisce PCR | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinasi K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorimetro | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Include tampone, colorante, standard e provette specializzate |
| Agitatore | Biosan | Non applicabile | |
| Bioanalizzatore Tapestation 2100 | Agilent | G2940CA | |
| ultra acqua pura | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard Kit di isolamento del DNA | Promega | A1120 | Include soluzione di lisi cellulare, soluzione di lisi dei nuclei e tampone per precipitazione delle proteine |
Riferimenti
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, Suppl 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J.....
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Ristampe e permessi
