Un piccolo RNA non codificante MicC contribuisce alla virulenza nelle proteine della membrana esterna in Salmonella enteritidis

I piccoli RNA non codificanti (sRNA) sono lunghi 40-400 nucleotidi, che generalmente non codificano proteine ma potrebbero essere trascritti indipendentemente nei cromosomi batterici ^1,2,3. La maggior parte degli sRNA sono codificati nelle regioni intergeniche (IGR) tra regioni codificanti geni e interagiscono con gli mRNA bersaglio attraverso azioni di accoppiamento di basi e regolano l'espressione dei geni bersaglio a livello post-trascrizionale ^4,5. Svolgono importanti ruoli di regolazione nel metabolismo delle sostanze, nella sintesi proteica della membrana esterna, nel quorum sensing e nell'espressione genica di virulenza⁵.

MicC è un trascritto di 109 nucleotidi di piccolo RNA presente in Escherichia coli e Salmonella enterica sierotipo Typhimurium, che potrebbe regolare l'espressione di più proteine della membrana esterna come OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 e Omp36 6,7,8,9. MicC regola l'espressione di OmpC inibendo il legame del ribosoma al leader dell'mRNA ompC in vitro e richiede lo chaperone dell'Hfq RNA per la sua funzione in Escherichia coli⁶. In Salmonella Typhimurium, MicC silenzia l'mRNA ompD attraverso un duplex di RNA ≤12-bp all'interno della sequenza codificante (codoni 23-26) e quindi destabilizza l'mRNA endonucleolitico⁷. Questo processo di regolazione è assistito dalla proteina chaperone Hfq¹⁰. L'OmpC è un'abbondante proteina della membrana esterna che si pensava fosse importante in ambienti in cui le concentrazioni di nutrienti e tossine erano elevate, come nell'intestino⁶. La porina OmpD è la proteina della membrana esterna più abbondante in Salmonella Typhimurium e rappresenta circa l'1% della proteina cellulare totale¹¹. OmpD è coinvolto nell'aderenza ai macrofagi umani e alle cellule epiteliali intestinali¹². MicC reprime anche l'espressione delle porine OmpC e OmpD. Si pensa che MicC possa regolare la virulenza. Per esplorare nuovi geni bersaglio regolati da MicC e studiare la funzione di regolazione della virulenza di micC, abbiamo clonato il gene micC nel ceppo 50336 di Salmonella Enteritidis (SE), quindi abbiamo costruito il mutante 50336ΔmicC e il mutante complementare 50336ΔmicC/p micC. Nuovi geni bersaglio sono stati sottoposti a screening mediante qRT-PCR. La virulenza di 50336ΔmicC è stata rilevata da infezioni da topi e polli.

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Consiglio Nazionale delle Ricerche. Il comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Yangzhou ha approvato tutti gli esperimenti e le procedure applicate sugli animali (SYXK2016-0020).

1. Ceppi batterici, plasmidi e condizioni di coltura

1. Utilizzare i batteri e i plasmidi elencati nella Tabella 1.
2. Batteri di coltura in brodo LB o su piastre di agar LB a 37 °C, in presenza di 50 μg/mL di ampicillina (Amp) quando appropriato.
3. I ceppi di coltura contenenti plasmidi sensibili alla temperatura sono utilizzati per la costruzione mutante di delezione a 30 °C.

2. Clone micC gene di S. Enteritidis ceppo 50336

1. Basato sulla sequenza a monte e a valle del gene micC di S. Typhimurium ceppo SL1344, progetta primer vmicC-F e vmicC-R per amplificare un frammento contenente il gene micC mediante PCR utilizzando il DNA genomico SE50336 come modello.
2. Mescolare 5 μL di tampone di reazione 10x PCR, 2 μL di miscela dNTP (2,5 mM), 1 μL di primer vmicC-F e vmicC-R, rispettivamente, 5 μL di modello, 1 μL di Taq DNA polimerasi e 35 μL di ddH₂O insieme per PCR.
3. Utilizzare le seguenti condizioni di reazione PCR:pre-denaturazione a 94 °C per 4 minuti; 94 °C per 30 s, 53 °C per 1 min, 72 °C per 1 min per 25 cicli ed estensione a 72 °C per 10 min.
4. Sequenziare il prodotto PCR per ottenere la sequenza del gene micC .

3. Costruzione del mutante di delezione micC

NOTA: Il mutante micC-negativo del ceppo 50336 di Salmonella Enteritidis è stato costruito utilizzando la ricombinazione λ-rosso-mediata come descritto in precedenza^13,14. I primer utilizzati sono elencati nella tabella 2.

1. Amplificare la cassetta di cloramfenicolo contenente frammenti di omologia del gene micC .
   1. Progettare primer micC-F e micC-R per amplificare la cassetta del cloramfenicolo (Cm) dal plasmide pKD3, comprese le estensioni di omologia di 50 bp dai 5' e 3' del gene micC .
   2. Estrarre il plasmide pKD3 come modello PCR.
   3. Mescolare 5 μL di tampone di reazione 10x PCR, 2 μL di miscela dNTP (2,5 mM), 1 μL di primer micC-F e micC-R, rispettivamente, 5 μL di modello, 1 μL di Taq DNA polimerasi e 35 μL di ddH₂O insieme come miscela di reazione PCR
   4. Amplificare la cassetta Cm con le seguenti condizioni di reazione PCR: pre-denaturazione a 94 °C per 4 min; 94 °C per 1 min, 52 °C per 1 min, 72 °C per 1 min per 10 cicli; 94 °C per 1 min, 63 °C per 1 min, 72 °C per 1 min per 25 cicli ed estensione a 72 °C per 10 min.
   5. Rilevare le dimensioni del prodotto PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio. Purificare e recuperare il prodotto PCR con il kit di recupero del gel del DNA e determinare la concentrazione di DNA mediante spettrofotometro.
      ATTENZIONE: La PCR deve essere eseguita due volte. Il primo prodotto PCR è stato diluito con un rapporto di 1:200 e utilizzato come modello per la PCR secondaria, per eliminare l'interferenza di un'ulteriore ricombinazione da parte del plasmide pKD3.
2. Costruire 1^° ceppo ricombinante 50336ΔmicC::cat
   1. Mescolare uniformemente 100 μL di cellule competenti SE50336 con 5 μL di plasmide pKD46 e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Shock termico della miscela di cui sopra a 42 °C per 90 s e trasferire rapidamente la miscela sul ghiaccio per 2 minuti per trasformare il plasmide pKD46 in SE50336. Schermare le colonie positive coltivando per una notte a 30 °C su una piastra resistente all'Amp (50 μg/mL).
   2. Aggiungere 30 mM di L-arabinosio alla coltura liquida SE50336/pKD46 e indurre l'espressione della ricombinasi mediante una coltura di agitazione a 30 °C per 1 ora. Quindi preparare le cellule competenti.
   3. Mescolare 100 ng di prodotto PCR purificato (fase 3.1) e 40 μL di cellule competenti SE50336/pKD46 in una coppa a scossa elettrica (ad esempio, Bio-Rad). Effettuare la trasformazione della scossa elettrica con i parametri di tensione 1,8 kV, impulso 25 μF e resistenza 200 Ω.
   4. Dopo elettrotrasformazione, trasferire la miscela a 1 mL di mezzo SOC e una coltura di agitazione a 150 rpm e 30 °C per 1 ora. Quindi spalmare la miscela su una piastra LB resistente a Cm (34 μg/mL) e coltura a 37 °C durante la notte per lo screening della colonia positiva.
   5. Coltura della suddetta colonia positiva a 42 °C per 2 ore. Schermare la colonia sensibile all'Amp (50 μg/mL) ma resistente a Cm (34 μg/mL) a 37 °C durante la notte per ottenere il 1° ceppo ricombinante senza pKD46.
3. Identificare il 1° ceppo ricombinante 50336ΔmicC::Cat.
   1. Estrarre 50336ΔmicC::DNA genomico del gatto come modello PCR. Utilizzare gli stessi componenti di reazione PCR del punto 2.1. Eseguire la reazione PCR con le stesse condizioni del punto 2.1.
   2. Rilevare le dimensioni del prodotto PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio e sequenziare il prodotto PCR.
4. Construct deletion mutant 50336ΔmicC.
   1. Elettroporate 100 ng di plasmide pCP20 in 40 μL di 50336ΔmicC::Celle competenti Cat con i parametri di tensione 1,8 kV, impulso 25 μF e resistenza 200 Ω, trasformanti positivi dello schermo su piastre resistenti sia ad Amp (50 μg/mL) che a Cm (34 μg/mL) a 30 °C.
   2. Trasferire sopra i trasformanti positivi in LB non resistenti e coltivarli per una notte a 42 °C, quindi isolare singole colonie su una piastra LB a 37 °C. Selezionare la colonia sensibile sia ad Amp che a Cm. Questo mutante è il mutante di delezione micC SE50336ΔmicC.
   3. Verificare 50336ΔmicC mediante PCR.
      1. Estrarre il DNA genomico 50336ΔmicC come modello PCR. Mescolare 5 μL di tampone di reazione 10x PCR, 2 μL di miscela dNTP (2,5 mM), 1 μL di primer vmicC-F, 1 μL di primer vmicC-R, 5 μL di modello, 1 μL di Taq DNA polimerasi e 35 μL di ddH₂O insieme per PCR.
      2. Utilizzare le seguenti condizioni di reazione PCR:pre-denaturazione a 94 °C per 4 minuti; 94 °C per 30 s, 53 °C per 1 min, 72 °C per 1 min per 25 cicli ed estensione a 72 °C per 10 min.

4. Costruzione del ceppo integrato micC

1. Progettare primer pBR-micC-F e pBR-micC-R con siti di restrizione NheI e SalI.
   1. Amplificare il gene micC a lunghezza intera con sequenze di fianco utilizzando una miscela di reazione PCR che contiene 5 μL di DNA genomico SE50336 come modello, primer 1 μL di pBR-micC-F e 1 μL di pBR-micC-R come primer, 5 μL di tampone di reazione PCR 10x, 2 μL di miscela dNTP (2,5 mM), 2 μL di miscela dNTP (2,5 mM) e 35 μL di ddH₂O.
   2. Utilizzare le seguenti condizioni di reazione PCR: pre-denaturazione a 94 °C per 4 min; 94 °C per 30 s, 52 °C per 50 s, 72 °C per 1 min per 25 cicli e prolunga a 72 °C per 10 min. Purificare e recuperare il prodotto PCR.
2. Digerire il prodotto PCR e il plasmide pBR322 rispettivamente utilizzando l'enzima di restrizione NheI e SalI, e ligarli usando T4 ligasi a 16 °C durante la notte per ottenere il plasmide pBR322-micC.
3. Trasformare pBR322-micC nelle cellule competenti SE50336ΔmicC e eseguire lo screening del trasformante positivo per ottenere il ceppo integrato SE50336ΔmicC/pmicC. Estrarre il plasmide pBR322-micC dal ceppo complementare e verificarlo mediante digestione enzimatica di restrizione e sequenziamento.

5. Isolamento dell'RNA e PCR quantitativa in tempo reale

1. Coltura SE50336, 50336ΔmicC e 50336ΔmicC/pmicC in mezzo LB durante la notte a 24 °C con coltivazione di shake a 180 rpm a un OD₆₀₀ di 2.0. Raccogliere la coltura batterica mediante centrifugazione a 13000 giri/min per 2 min.
2. Estrarre l'RNA totale utilizzando il reagente TRIzol. Incubare 50 μL di RNA isolato con 2 μL di DNaseI e 6 μL di tampone 10x a 37 °C per 30 minuti per rimuovere il DNA. Determinare la quantità di RNA pipettando 1 μL di campione di RNA in un microspettrofotometro.
3. Sintesi del cDNA
   1. Utilizzare 1 μg di RNA totale per la sintesi di cDNA in 20 μL di sistema di reazione di trascrizione inversa (4 μL di tampone 5x, 1 μL di miscela enzimatica RT, 1 μL di miscela primer RT, 10 μL di RNA totale e 4 μL di ddH₂O). Incubare sopra il sistema di reazione a 37 °C per 15 minuti e poi a 85 °C per 5 s.
4. Progettare primer basati sulla sequenza dei geni bersaglio ompA, ompC e ompD. Eseguire la trascrizione inversa-PCR utilizzando un kit di reagenti RT. I componenti della reazione PCR contengono 2,5 μL di tampone di reazione PCR 10x, 1 μL di miscela dNTP (2,5 mM), 1 μL di primer del gene bersaglio (ompA, ompC o ompD), 2,5 μL di template, 0,5 μL di Taq DNA polimerasi e 17,5 μL di ddH₂O.
   1. Utilizzare le seguenti condizioni di reazione PCR:pre-denaturazione a 94 °C per 4 minuti; 94 °C per 30 s, 60 °C per 1 min, 72 °C per 1 min per 25 cicli ed estensione a 72 °C per 10 min.
5. Eseguire la PCR in tempo reale utilizzando il kit RT-PCR verde SYBR in uno strumento RT-PCT in triplice copia.
   1. Utilizzare i seguenti componenti di reazione PCR: 10 μL di 2x tampone SYBR, 0,4 μL di primer diretto e primer inverso rispettivamente, 0,4 μL di RoxDye II, 2 μL di cDNA e 6,8 μL di H₂O libero da RNasi.
   2. Utilizzare le seguenti condizioni di reazione PCR:pre-denaturazione a 95 °C per 1 minuto per un ciclo; 95 °C per 5 s, 60 °C per 34 s per 40 cicli.
   3. Normalizzare tutti i dati al gene di riferimento endogeno gyrA. Utilizzare il metodo ^{2-Δ ΔCT} per la quantificazione dei dati¹⁵.

6. Saggi di virulenza

1. Coltura SE50336, 50336ΔmicC e 50336ΔmicC/pmicC in fase stazionaria da media a precoce LB (OD₆₀₀ di 2-3) a 24 °C, raccolta mediante centrifugazione e diluizione fino a CFU mL-1 appropriata in PBS sterile.
2. Per le infezioni da topi, diluire i ceppi coltivati a 10 CFU/200 μL, 10² CFU/200 μL e 10³ CFU/200 μL di gradiente risussivo. Infettare gruppi di cinque topi Balb/c di 6-8 settimane per ceppo mediante iniezione sottocutanea. Iniettare nel gruppo di controllo 200 μL di soluzione fisiologica.
3. Per le infezioni da pollo, diluire sopra tre ceppi a 10⁷ CFU/200 μL, 10⁸ CFU/200 μL e 10⁹ CFU/200 μL di risospensione del gradiente. Infettare gruppi di venti polli di 1 giorno per ceppo mediante iniezione sottocutanea.
4. Monitorare quotidianamente i segni di malattia e la morte di animali da esperimento. Calcolare la DL₅₀ (dose letale mediana) 14 d post-infezione come descritto in precedenza¹⁶. Elaborare i dati utilizzando un software di analisi dei dati.
5. Nei gruppi di infezione, raccogliere il cuore, il fegato, la milza, il polmone e il rene dei pulcini appena morti. Pesare separatamente 0,5 g dei tessuti di cui sopra e macinarli con un'operazione sterile. Diluire gradualmente i campioni di macinazione, distribuirli su piastra LB e coltura per 8-10 ore a 37 °C. Registrare la quantità di ceppi di Salmonella colonizzati nei tessuti dei pulcini.

Costruzione del mutante 50336Δ micC e del ceppo complementare 50336Δ micC /pmicC
Il risultato del clone del gene micC ha indicato che questo gene era composto da 109 bp che mostravano un'identità del 100% con quella di S. Typhimurium. Sulla base dei dati di sequenza, il mutante di delezione 50336ΔmicC e il mutante complementare 50336ΔmicC/pmicC sono stati costruiti con successo. Nel dettaglio, i risultati del sequenziamento hanno mostrato che una cassetta di resistenza da 1,1 kb Cm è stata amplificata e utilizzata per costruire il 1° ricombinante. Il 1° ricombinante 50336ΔmicC::cat è stato validato mediante PCR utilizzando primer vmicC-F e vmicC-R con una dimensione di banda prevista di circa 1200 bp di prodotti PCR con inserimento di Cm rispetto ai 279 bp dei prodotti PCR nel ceppo wild type (Figura 1). Nella seconda ricombinazione, la cassetta Cm è stata eliminata da pCP20. I risultati della PCR combinati con il sequenziamento hanno confermato che il mutante micC isogenico è stato costruito con successo e denominato 50336ΔmicC (Figura 1).

MicC regola l'espressione genica ompA, ompC e ompD
Per determinare i bersagli di MicC, l'espressione dei geni ompA, ompC e ompD nei ceppi SE 50336, 50336ΔmicC e 50336ΔmicC/pmicC è stata analizzata mediante PCR quantitativa in tempo reale utilizzando gyrA come standard interno normalizzante. I risultati hanno mostrato che la trascrizione di ompA e ompC in 50336ΔmicC è aumentata di circa 2,2 volte e 3 volte rispetto a quella del ceppo wild type, mentre ompD in 50336ΔmicC è aumentato leggermente (1,3 volte) rispetto a quello nel ceppo wild type (Figura 2). Indicava che micC poteva reprimere l'espressione di ompA, ompC e ompD. OmpA era probabilmente un potenziale nuovo gene bersaglio regolato direttamente da micC.

L'eliminazione di micC migliora S. Virulenza di Enteritidisin topi e polli
Abbiamo eseguito saggi LD50 per quantificare l'impatto dell'eliminazione di micC su S. Virulenza di Enteritidis nei topi e nei polli. Dopo aver infettato topi Balb / c di 6-8 settimane con 103 CFU di ciascuno dei tre ceppi, abbiamo osservato che la maggior parte dei topi infettati da 50336ΔmicC mostrava pigrizia, inappetenza o diarrea 48 ore dopo l'infezione e sembrava morire in successione 96 ore dopo l'infezione. Mentre i topi infettati dal ceppo WT e 50336ΔmicC / pmicC hanno mostrato i sintomi di cui sopra 72 ore dopo l'infezione e sono morti 120 ore dopo l'infezione. I DL50s sono stati calcolati 7 d post-infezione. I risultati hanno mostrato che la LD50 del ceppo WT 50336, 50336ΔmicC e 50336ΔmicC/pmicC per i topi erano rispettivamente 12,59, 5,01 e 19,95 CFU. Ha indicato che la virulenza del mutante 50336ΔmicC è aumentata di 2,5 volte rispetto al WT nei topi (Tabella 3). Dopo aver infettato polli di 1 giorno con 109 CFU di ciascuno dei tre ceppi, la maggior parte dei polli ha mostrato iperemia intestinale e diarrea 10 ore dopo l'infezione. Quando infettati con 108 CFU, i polli infettati con 50336ΔmicC hanno mostrato una mortalità più elevata, rispetto al ceppo WT e 50336ΔmicC/pmicC. I DL50s sono stati calcolati per 14 d post-infezione. I risultati hanno mostrato che la LD 50 del ceppo WT 50336, 50336ΔmicC e 50336ΔmicC/pmicC per i polli era rispettivamente 1,13×109, 1,55×10 8 e2,54×10 8 CFU. Ha indicato che la delezione di micC ha anche migliorato la virulenza di S. Enteritidis nei polli. Tutti e tre i ceppi di S. Enteritidis sono stati recuperati dal fegato, dalla milza e dal cieco dei polli infetti.

Figura 1: Verifica PCR dei mutanti 50336ΔmicC con primer vmicC-F e vmicC-R. Un prodotto PCR a 280 bp è stato ottenuto quando il genoma wild-type 50336 come modello (corsia 1). Quando il gene della cassetta Cm è stato inserito nel genoma di S. Enteritidis, il 1° microfono ricombinante 50336Δ è stato verificato mediante PCR ed è stato ottenuto un prodotto PCR da 1100 bp (corsia 2). Il gene della cassetta Cm di 50336Δmic::cat è stato asportato introducendo il vettore che esprime la ricombinasi FLP pCP20 e il 2° microfono ricombinante 50336Δ è stato ottenuto e verificato mediante PCR (corsia 3). M: marcatore di massa molecolare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Cambiamenti di piega dei geni ompA, ompC e ompD a livello di mRNA sono stati determinati nel mutante 50336 Δ mic e hanno completato il ceppo 50336Δmic/p mic mediante RT-PCR quantitativa rispetto al ceppo wild type. I saggi sono stati eseguiti in triplice copia. Per la quantificazione dei dati è stato utilizzato il metodo 2-ΔΔCT. *Indica una differenza statisticamente significativa rispetto al ceppo wild type (p<0.05) Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1. Ceppi batterici e plasmidi utilizzati in questo studio.

Tabella 2. Primer utilizzati in questo studio

Tabella 3. Proprietà di virulenza di S. Ceppi di Enteritidis 50336 in topi e polli

Gli autori non hanno nulla da rivelare.