Uveite autoimmune sperimentale: un modello murino infiammatorio intraoculare

Sommario

In questo rapporto presentiamo un protocollo che consente allo sperimentatore di generare un modello murino di uveite intraoculare. Più comunemente indicato come uveite autoimmune sperimentale (EAU), questo modello consolidato cattura molti aspetti della malattia umana. Qui, descriveremo come indurre e monitorare la progressione della malattia utilizzando diverse letture.

Abstract

L'uveite autoimmune sperimentale (EAU) è guidata dalle cellule immunitarie che rispondono agli auto-antigeni. Molte caratteristiche di questo modello di malattia infiammatoria intraoculare non infettiva ricapitolano il fenotipo clinico dell'uveite posteriore che colpisce l'uomo. L'EAU è stata utilizzata in modo affidabile per studiare l'efficacia di nuove terapie infiammatorie, la loro modalità d'azione e per studiare ulteriormente i meccanismi che sono alla base della progressione della malattia dei disturbi intraoculari. Qui, forniamo un protocollo dettagliato sull'induzione EAU nel topo C57BL / 6J - l'organismo modello più utilizzato con suscettibilità a questa malattia. La valutazione clinica della gravità e della progressione della malattia sarà dimostrata mediante fundoscopia, esame istologico e fluorangiografia. La procedura di induzione prevede l'iniezione sottocutanea di un'emulsione contenente un peptide (IRBP_1-20) dalla proteina oculare interfotorecettore proteina legante i retinoidi (nota anche come proteina legante il retinolo 3), Complete Freund's Adjuvant (CFA) e integrata con Mycobacterium tuberculosis ucciso. L'iniezione di questa emulsione viscosa sul retro del collo è seguita da una singola iniezione intraperitoneale di tossina Bordetella pertussis . All'inizio dei sintomi (giorno 12-14) e in anestesia generale, vengono prelevate immagini fundoscopiche per valutare la progressione della malattia attraverso l'esame clinico. Questi dati possono essere confrontati direttamente con quelli dei timepoint successivi e del picco della malattia (giorno 20-22) con le differenze analizzate. Allo stesso tempo, questo protocollo consente allo sperimentatore di valutare le potenziali differenze nella permeabilità e nel danno dei vasi utilizzando l'angiografia con fluoresceina. L'EAU può essere indotta in altri ceppi murini - sia wildtype che geneticamente modificati - e combinata con nuove terapie che offrono flessibilità per studiare l'efficacia dei farmaci e/o i meccanismi della malattia.

Introduzione

Questo protocollo dimostrerà come indurre l'uveite autoimmune sperimentale (EAU) nel topo C57BL/6J mediante una singola iniezione sottocutanea di un antigene retinico in un adiuvante emulsionato. I metodi per il monitoraggio e la valutazione della progressione della malattia saranno dettagliati attraverso l'imaging fundoscopico e l'esame istologico, con parametri di misurazione delineati all'interno. Inoltre, verrà discussa l'angiografia della fluoresceina, una tecnica per esaminare la struttura e la permeabilità dei vasi sanguigni retinici.

Questo modello EAU riassume le caratteristiche centrali dell'uveite posteriore non infettiva nell'uomo per quanto riguarda le caratteristiche clinico-patologiche e i meccanismi cellulari e molecolari di base che guidano la malattia. L'EAU è mediata da sottogruppi Th1 e/o Th17 di linfociti CD4⁺T autoreattivi, come mostrato in esperimenti di trasferimento adottivo e con topi impoveriti di IFNγ¹. Gran parte della nostra comprensione dei potenziali ruoli di queste cellule nell'uveite deriva dallo studio dell'EAU² in cui vengono rilevate sia le cellule Th1 che Th17 all'interno dei tessuti retinici³. Spesso, l'EAU viene utilizzata come modello preclinico per valutare l'utilità di nuove terapie nell'attenuare la malattia. Gli approcci terapeutici che hanno modulato con successo la malattia EAU hanno mostrato una certa efficacia nella clinica e hanno raggiunto lo stato approvato dalla FDA. Esempi di questi sono gruppi di farmaci immunoregolatori come le terapie mirate alle cellule T: ciclosporina, FK-506 e rapamicina ^4,5,6. Recentemente, in questo modello sono stati esplorati anche interventi mirati a nuovi percorsi per studiare sia il meccanismo che l'effetto sull'esito della malattia. Questi includono la regolazione trascrizionale mirata attraverso il lettore di cromatina Bromodomain Extra-Terminal (BET) proteine e inibitori P-TEFb³. Inoltre, approcci più convenzionali come un inibitore VLA-4 hanno recentemente dimostrato la soppressione nell'EAU attraverso la modulazione delle cellule T CD4⁺ effettrici⁷. Inoltre, il targeting delle cellule Th17 con TMP778, un agonista inverso RORγt, è stato trovato anche per sopprimere significativamente EAU⁸. Inoltre, questo modello offre l'opportunità di studiare l'infiammazione autoimmune cronica nella retina e i meccanismi sottostanti di accompagnamento come il priming dei linfociti.

Le letture primarie per gli studi preclinici EAU sono la valutazione clinica eseguendo l'imaging fundoscopia retinica e, meno frequentemente, valutando l'integrità retinica mediante tomografia a coerenza ottica (OCT). La valutazione istopatologica retinica e l'immunofenotipizzazione delle cellule retiniche mediante citometria a flusso vengono quindi intraprese al termine. Fundoscopy è un sistema di live imaging facile da usare che consente una valutazione clinica rapida e riproducibile dell'intera retina. Per le valutazioni immunoistochimiche, le tecniche si basano sulla preparazione di sezioni retiniche che consentono di studiare l'architettura tissutale per il grado di infiammazione e danno strutturale⁹. I criteri di valutazione e i sistemi di punteggio convenzionali, per tutte le tecniche utilizzate, saranno delineati all'interno di questo protocollo. L'entità del danno registrato utilizzando l'imaging fundoscopico è spesso strettamente correlata ai cambiamenti istologici. Questo duplice approccio al monitoraggio e alla valutazione della gravità della malattia offre una maggiore sensibilità e risultati di misurazione più affidabili.

L'EAU è un modello consolidato e comunemente usato per i test preclinici e lo studio della malattia oculare immuno-mediata. Questo modello è affidabile e riproducibile con un'incidenza di malattia del >95% e genera dati completi che possono essere utilizzati per convalidare o ripudiare nuove terapie per il trattamento della malattia infiammatoria intraoculare che rappresenta una delle principali cause di cecità in età lavorativa in tutto il mondo¹⁰.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con il UK Animals (Scientific Procedures) Act del 1986 e le linee guida istituzionali dell'Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB).

1. Alloggiamento mouse C57BL / 6J

1. Topi domestici in un ambiente specifico privo di agenti patogeni, con un ciclo luce-buio di 12 ore e cibo e acqua disponibili ad libitum.
2. Eseguire tutti gli esperimenti su femmine adulte C57BL/6J (le femmine sono scelte preferenzialmente in quanto vi è un'incidenza di donne rispetto agli uomini 1,4 a 1 nei pazienti con uveite). Randomizzare topi femmina C57BL / 6J tra 6-8 settimane di età in base al peso e all'età. Ospitare i topi in gabbie ventilate individualmente (IVC) in gruppi di 5-6 topi per gabbia.

2. Immunizzazione dei topi C57BL / 6

1. IRBP_{1-20 -} Preparazione dell'emulsione CFA
   NOTA: La preparazione dell'emulsione è essenziale per la riproducibilità e l'incidenza della malattia; Pertanto, è necessario compiere ogni sforzo per mantenere la coerenza durante tutto il processo di preparazione e tra gli esperimenti. Quando si prepara l'emulsione, la perdita deve essere contabilizzata nei calcoli di tutti i reagenti in anticipo. Questa perdita può essere di circa 1,5 volte (o il 50% in più del volume preparato), in base al numero di topi pianificati per l'immunizzazione. Si prega di vedere il seguente esempio di seguito. Per immunizzare 10 topi, preparare 15 topi e utilizzare 400 μg (peptide per topo da 20 g) x 15 topi = 6 mg. Ogni topo dovrebbe ricevere 200 μL per l'immunizzazione (3 ml totali). Il volume finale comprende un rapporto 1: 1 di soluzione peptidica e CFA, quindi 1,5 ml di soluzione peptidica e 1,5 ml di CFA.
   1. Preparare tutte le soluzioni sterili in una cabina a flusso laminare utilizzando tecniche asettiche.
   2. Pesare la quantità desiderata (400 μg per 20 g di topo) di IRBP_1-20 umano (LAQGAYRTAVDLESLASQLT) peptide liofilizzato. Sciogliere il peptide in DMSO al 100%. Conservare le scorte in forma liofilizzata a -20 °C.
      NOTA: Per garantire che la polvere sia completamente sciolta, ogni scaglia deve prima entrare in contatto con il DMSO e non mostrare alcun segno di solido residuo. Aggiungi PBS in piccole porzioni per raggiungere il volume finale. Non mescolare con un vortice, ma usare una leggera agitazione con una pipetta. La concentrazione finale di DMSO non deve superare l'1% del volume totale di preparazione peptidica. La preparazione dell'emulsione in un tubo di plastica da 20 ml con un fondo affusolato dovrebbe consentire una migliore accessibilità del DMSO alla polvere liofilizzata.
   3. Aggiungere la soluzione peptidica DMSO-PBS a 1:1 v/v al CFA che è già stato integrato con 1,5 mg/mL ucciso Mycobacterium tuberculosis , per dare una concentrazione finale di 2,5 mg/ml. Aggiungere goccia a goccia, pipettando delicatamente e frequentemente per formare un'emulsione viscosa e uniformemente distribuita.
   4. Aerare la soluzione peptidica e CFA utilizzando una pipetta da 1000 μL (impostata su 700 μL per evitare ulteriori perdite) e una pipetta per generare una consistenza cremosa e densa. Questa tecnica prevede l'utilizzo della pipetta per aspirare ripetutamente su e giù fino a raggiungere lo spessore desiderato. Per risultati ottimali, assicurarsi che la soluzione di antigene e l'adiuvante siano miscelati accuratamente prima dell'iniezione.
2. Iniezione intraperitoneale di tossina della pertosse
   1. Sospendere 1,5 μg di tossina Bordetella pertussis in 100 μL di RPMI 1640 terreno integrato con siero di topo all'1^{% 11}.
   2. Eseguire l'iniezione i.p. con una siringa sterile e un ago da 23G.
      NOTA: Al fine di evitare disturbi al sito di iniezione, la tossina della pertosse deve essere somministrata prima di iniettare l'antigene.
   3. Trasferire temporaneamente ogni topo in una gabbia separata per ricevere una singola iniezione i.p. da 100 μL di tossina Bordetella pertussis .
3. Iniezione sottocutanea di emulsione IRBP
   1. Quindi, iniettare l'emulsione IRBP per via sottocutanea. Questo processo richiede due addestratori di animali adeguatamente vestiti con protezione secondo le norme di salute e sicurezza.
   2. Chiedi a una persona addestrata di trattenere leggermente il topo sulla parte superiore della gabbia in una posizione simile a una collottola, con lo stomaco rivolto verso il basso mentre l'altra persona addestrata pizzica la pelle per formare una struttura simile a una tenda sulla parte posteriore del collo in cui l'ago può essere inserito per infilare tra il dito e il pollice.
      ATTENZIONE: C'è il pericolo di lesioni da puntura d'ago.
   3. Una volta posizionato l'ago, iniettare 200 μL di emulsione IRBP. Quando si rimuove l'ago, ruotare la testina dell'ago per chiudere la pelle prima di estrarlo e applicare successivamente pressione sul sito di iniezione per prevenire il reflusso dell'emulsione.
      ATTENZIONE: L'emulsione non deve entrare in contatto con la pelle o il pelo del topo in quanto ciò potrebbe causare irritazione e, nei casi più gravi, lo sviluppo di una lesione. Se ciò si verifica, l'area deve essere pulita immediatamente e accuratamente utilizzando etanolo al 70%, quindi asciugata.
      NOTA: Se i linfonodi drenanti sono necessari per l'esame alla fine dello studio, il sito di iniezione sarà diverso. In questo caso, iniettare 100 μL su entrambi i lati del fianco per via sottocutanea. Ciò genererà una risposta più forte ai linfonodi inguinali drenanti, che possono essere asportati al momento della raccolta. Tuttavia, se il risultato atteso è esclusivamente quello di sviluppare EAU, una singola iniezione di 200 μL nella parte posteriore del collo è preferibile per evitare il disagio da più siti di iniezione.

3. Valutazione clinica - Esame del fondo oculare del topo

NOTA: La malattia clinica deve essere valutata utilizzando l'esame del fondo oculare, tramite imaging live a campo chiaro utilizzando un fundoscopio e il software Discover utilizzato per la visualizzazione.

1. All'esordio della malattia (giorno 12-14), sedare i topi in anestesia generale usando una combinazione di ketamina (50 mg/ml) e Domitor (Medetomidina; 1 mg/ml). Diluire Domitor in 1 parte; 1,5 parti di ketamina e 2,5 parti di acqua iniettabile sterile, quindi iniettare 100 μL per 30 g per via intraperitoneale. Utilizzare 1 mL di siringhe sterili e aghi da 23G per la suddetta combinazione di anestesia.
2. Successivamente, monitorare il mouse per assicurarsi che tutti i riflessi siano persi e che non risponda agli stimoli.
3. Immediatamente dopo aver ricevuto l'iniezione i.p. e mentre il topo è ancora tenuto in una collottola, applicare topicamente l'1% di tropicamide e il 2,5% di fenilefrina su ciascun occhio per la dilatazione della pupilla. Mirare a coprire completamente la cornea con entrambe le soluzioni dilatatorie. Potrebbero essere necessari alcuni minuti prima che la pupilla sia completamente dilatata.
4. Successivamente, applicare generosamente sull'unguento viscoteare oculare e mantenere durante tutto il processo di imaging al fine di mantenere l'occhio completamente lubrificato e idratato.
5. Nel frattempo, apri il software (ad esempio, Discover) e imposta il fundoscopio (ad esempio, Micron) per catturare immagini in campo chiaro. Assegna a ogni singolo mouse una cartella ed etichetta le immagini con R o L in base a ciascun occhio fotografato.
6. Montare il mouse su un palco appositamente costruito per la visualizzazione dal vivo e posizionare il microscopio per un accesso completo alla retina.
7. Per ottenere una rappresentazione accurata della malattia, scattare immagini dell'intera area retinica, coprendo tutti gli angoli della periferia oltre al disco ottico. Per ottenere ciò, regolare l'oculare in tutto. È fondamentale che l'occhio rimanga completamente lubrificato in ogni momento durante il processo di imaging; Assicurati questo rabboccando l'unguento per gli occhi a una velocità costante.
8. Fare riferimento al paragrafo 4 (sotto) in questa fase per eseguire l'angiografia con fluoresceina.
9. Una volta completata l'imaging, diluire l'anti-sedazione anestetica inversa (5 mg/mL Antisedan) in acqua iniettabile e somministrare a 0,1 mg/kg i.p. Riportare il mouse in una gabbia e posizionarlo su un tappetino preriscaldato con accesso a una dieta imbevuta di umidità fino al recupero. Il recupero completo è caratterizzato dal movimento di tutto il corpo e dal camminare intorno alla gabbia con andatura costante, in genere impiegando alcune ore.
10. All'endpoint sperimentale designato (ad esempio, giorno 21-23), ripetere i passaggi 4.1-4.5 e scattare nuovamente fotografie dell'intera area retinica, coprendo il disco ottico e tutti gli angoli della periferia per catturare una rappresentazione accurata della malattia.

4. Fluorangiografia

1. Per misurare la perdita dei vasi in questi animali, mentre sono sotto anestesia, somministrare a ciascun topo un'iniezione di fluoresceina al 2% per via sottocutanea nella parte posteriore del collo e posizionarla in modo tale che la retina sia centralizzata al centro dell'immagine dal vivo.
2. Impostare il fundoscopio su un filtro di eccitazione a luce blu a 465-490 nm. La luce catturata dalla fluoresceina eccitata è compresa tra 520-530 nm.
3. Dopo 1,5 minuti dopo l'iniezione di fluoresceina, scattare una fotografia di ciascuna retina e ripetere di nuovo a 7 minuti.
   NOTA: il tempismo è fondamentale per questi eventi, se non è possibile catturare entrambi, è sufficiente visualizzare un occhio.

5. Punteggio clinico della malattia

1. Basare la valutazione clinica sulla gravità dei seguenti criteri: infiammazione del disco ottico, cuffing dei vasi retinici, infiltrato di tessuto retinico e danno strutturale.
2. Assegna a ciascuno di questi parametri un punteggio su una scala da 0 a 5 e il totale collettivo è rappresentativo della malattia clinica per l'intero occhio, con un punteggio massimo di 20 ottenibile per occhio. La tabella 1 può essere utilizzata come guida per i criteri di punteggio.

6. Istologia e punteggio istologico

1. Dopo l'eutanasia dei topi per lussazione cervicale, enucleare gli occhi separando le palpebre per un facile accesso a tutto l'occhio.
2. Quindi, posizionare una pinza curva dietro il globo con l'intenzione di afferrare il tessuto connettivo orbitale e il nervo ottico. Fare attenzione a evitare di spremere il globo.
3. Per la fissazione, posizionare l'occhio in glutaraldeide al 4% per un minimo di 15 minuti per ridurre al minimo il distacco di retina, quindi trasferire al 10% di formaldeide per almeno 24 ore. 1-2 ml di fissativo darebbero abbastanza volume per coprire due occhi.
4. Eseguire l'incorporamento in paraffina, il sezionamento su un microtomo e la colorazione secondo protocolli standard. Lo spessore della sezione di 3-4 μm è consigliato per qualsiasi tipo di colorazione.
5. Eseguire l'esame istologico degli occhi utilizzando protocolli standard per la colorazione con ematossilina ed eosina (H & E).
6. Assegnare punteggi su una scala da 0 a 4, secondo i criteri per il punteggio EAU, in base all'estensione dell'infiltrazione delle cellule immunitarie all'interno della retina e della coroide, alla rottura degli strati retinici, al grado di formazione del granuloma e all'estensione del distacco della retina, indicando il danno retinico, come precedentemente descritto (Agarwal 2013) e riassunto nella tabella 2¹¹.

Risultati

In questo protocollo, descriviamo un metodo passo-passo per indurre un modello di uveite autoimmune sperimentale (EAU) immunizzando topi con un peptide retinico uveitogenico derivato da IRBP. La valutazione della malattia che impiega approcci ampiamente utilizzati e facilmente accessibili è coperta sebbene questi non siano esclusivi e possano essere aggiunti, o parzialmente sostituiti, da altre tecniche di imaging. I primi segni di EAU nei topi C57BL/6J possono essere rilevati due settimane dopo l'immunizzazione e il pic...

Discussione

I modelli animali sperimentali sono strumenti necessari per lo studio della patogenesi della malattia e la sperimentazione preclinica di nuovi paradigmi terapeutici. Nel protocollo attuale, abbiamo discusso una metodologia per indurre, monitorare e valutare EAU, un modello sperimentale di uveite infiammatoria intraoculare. Questo modello EAU ha un'incidenza di malattia superiore al 95% quando tutte le procedure vengono eseguite secondo il protocollo qui delineato e si traduce nello sviluppo di EAU cronica e monofasica. P...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
antisedan	ZOETIS, USA		per il risveglio
Complete Freund' s Adiuvante; CFA	Sigma, Regno Unito	F5881	per l'immunizzazione
Domitor	Orion Pharma, Finlandia		per anestesia
Flourescein	Sigma, Regno Unito	F2456	per angiografia
IRBP1-20	Chamberidge peptide, peptide britannico		; antigene
Ketamina	Orion Pharma, Finlandia		per anestesia
Micron III	Phoenix Research, USA		per fundoscopia
Siero di topo	Sigma, Regno Unito	M5905	per l'immunizzazione
Mycobacterium terberculosis	Sigma, Regno Unito	344289	per l'immunizzazione
Tossina della pertosse	Sigma, Regno Unito	P2980	per l'immunizzazione
fenilefrina cloridrato 2,5%	Bausch & Lomb Regno Unito	PHEN25	per la dilatazione
Tropicamide 1%	SANDOZ		per la dilatazione
Viscotears	WELDRICKS Pharmacy, Regno Unito	2082642	per la lubrificazione degli occhi