Presentato qui un protocollo per un approccio di imaging a fluorescenza, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), un metodo in grado di visualizzare simultaneamente fluorescenza singola cellula di proteine virali e acidi nucleici di diverso tipo e filamento. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di sistemi.
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Articolo metodologico
Imaging a fluorescenza multiplexata a singola cellula per visualizzare acidi nucleici e proteine virali e monitorare HIV, HTLV, HBV, HCV, virus Zika e infezione influenzale
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'acquisizione dei processi di replicazione dinamica e assemblaggio dei virus è stata ostacolata dalla mancanza di robuste tecnologie di ibridazione in situ (ISH) che consentano la marcatura sensibile e simultanea dell'acido nucleico virale e delle proteine. I metodi convenzionali di ibridazione in situ a fluorescenza del DNA (FISH) spesso non sono compatibili con l'immunocolorazione. Abbiamo quindi sviluppato un approccio di imaging, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein), che consente la visualizzazione simultanea di DNA, RNA e proteine. Rispetto al DNA FISH convenzionale, MICDDRP utilizza la tecnologia ISH del DNA ramificato (bDNA), che migliora notevolmente la sensibilità e il rilevamento della sonda oligonucleotidica. Piccole modifiche di MICDDRP consentono l'imaging di proteine virali in concomitanza con acidi nucleici (RNA o DNA) di diversa filamento. Abbiamo applicato questi protocolli per studiare i cicli di vita di più patogeni virali, tra cui il virus dell'immunodeficienza umana (HIV)-1, il virus T-linfotropico umano (HTLV)-1, il virus dell'epatite B (HBV), il virus dell'epatite C (HCV), il virus Zika (ZKV) e il virus dell'influenza A (IAV). Abbiamo dimostrato che possiamo etichettare in modo efficiente gli acidi nucleici virali e le proteine in una vasta gamma di virus. Questi studi possono fornirci una migliore comprensione meccanicistica di più sistemi virali e, inoltre, servire come modello per l'applicazione dell'imaging a fluorescenza multipla di DNA, RNA e proteine in un ampio spettro di sistemi cellulari.
Introduzione
Mentre migliaia di anticorpi commerciali sono disponibili per marcare specificamente le proteine tramite approcci convenzionali di immunocolorazione, e mentre le proteine di fusione possono essere progettate con tag fluorescenti foto-ottimizzati per tracciare più proteine in un campione1, la visualizzazione microscopica delle proteine spesso non è compatibile con l'ibridazione convenzionale della fluorescenza del DNA in situ (FISH)2 . Le limitazioni tecniche nella visualizzazione simultanea di DNA, RNA e proteine utilizzando approcci basati sulla fluorescenza hanno ostacolato una comprensione approfondita della replicazi....
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Protocollo
1. Cellule seme (Suspension vs. Adherent Cells) su coverslip o vetrini da camera (il protocollo presentato utilizza coverslips).
- Semina di celle di sospensione
- Preparare i coprivetrini rivestiti in poli-D-lisina (PDL) (facilita l'aderenza delle celle di sospensione al coverslip) incubando prima i coprivetrini in etanolo (EtOH) per 5 minuti (sterilizza i vetrini di copertura e rimuove eventuali residui). Quindi lavare 2 volte in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) prima di incubare i vetrini di copertura in PDL (20 μg/ml) per 30 minuti (min) a temperatura ambiente (RT).
- Rimuovere PDL e lavare 2 volte in PBS. Celle pellet (prece....
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Risultati
Uno schema di MICDDRP è illustrato nella Figura 1. L'etichettatura del DNA e dell'RNA è seguita dall'immunocolorazione. L'uso di amplificatori ramificati aumenta il segnale, consentendo la rilevazione di singole molecole di acido nucleico.
Figura 1: Schema di MICDDRP e flusso di lavoro passo-passo. (A) Il segnale bDNA v.......
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Discussione
La visualizzazione simultanea di RNA, DNA e proteine richiede spesso un'ampia ottimizzazione. Due metodi comunemente usati sono l'etichettatura con 5-etinil-2-deossiuridina (EdU) e DNA FISH. L'etichettatura EdU è stata applicata per visualizzare simultaneamente DNA virale e proteine, poiché l'EdU è incorporato nel DNA nascente e successivamente etichettato con coloranti fluorescenti contenenti azoturo tramite chimica a clic. L'etichettatura EdU può quindi essere utilizzata per monitorare la cinetica di replicazi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in tutto o in parte dal National Institutes of Health (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 e U54 AI150472). Ringraziamo il Dr. Raymond F. Schinazi e Sadie Amichai per aver fornito cellule infette dal virus dell'influenza A.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 4% PFA | |||
| 50% destrano solfato | Amreso | 198 | Per tampone di ibridazione del DNA |
| 50X tampone di lavaggio | ACD Bio | 320058 | |
| piastre | |||
| Amplificatore 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplificatore 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplificatore 3-FL | ACD | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 tabella nel protocollo | |
| Anticorpo anti-HCV NS5a | Abcam | ab13833 | Monoclonale di topo; funziona con i genotipi HCV 1a, 1b, 3 e 4 |
| Anticorpo monoclonale anti-HIV-1 p24 | di reagenti NIH AIDS 3537 | ||
| Anticorpo anti-Mov10 | Abcam | ab80613 | Policlonale |
| di coniglioAnticorpo anti-PB1 | GeneTex | GTX125923 | Anticorpo contro la proteina dell'influenza |
| Albumina | Reagente bloccante per l'immunocolorazione | ||
| Terreni cellulari con integratori | Terreni appropriati per il modello cellulare | ||
| Vetrini coprioggetti | |||
| DAPI | ACD Bio | Colorazione nucleare (kit RNAscope di ACD Bio) | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (1X PBS) | Gibco | 14190250 | Senza calcio e magnesio |
| Carbonato di etilene | Sigma | E26258 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Utilizzare FBS specifico in base al siero in cui è stato allevato l'anticorpo secondario (ad es. FBS di capra) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus vetrini per microscopio | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Prepulito |
| Sonda HCV-GT2a-sense-C2 | ACD Bio | 441371 | Sonda di rilevamento dell'RNA HCV(+) |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | Sonda cDNA HIV-1 |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | Sonda RNA HIV-1 |
| Forno di ibridazione HybEZ | ACD Bio | 321710/321720 | |
| Penna barriera idrofobica ImmEdge | Vector Laboratories | H-4000 | |
| per unghie | Per immobolizzare il vetrino coprioggetto da far scorrere prima del trattamento con proteasi | ||
| Acqua priva di nucleasi | Ambion | AM9937 | |
| Poli-d-lisina (PDL) | Coprioggetti per rivestimento in 20 &; g/mL di PDL per 30 minuti | ||
| Diluente per | ACD Bio | 300041 | Per diluire le sonde RNA C2 o C3 |
| Prolungare l'oro antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Proteasi III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Sonda- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 RNasi | |
| A | Qiagen | ||
| Anticorpi | |||
| Vetrini | |||
| Cloruro | Per tampone di ibridazione del DNA | ||
| Citrato di sodio, pH 6,2 | Per tampone di ibridazione del DNA | ||
| Tween-20 | Per tampone di ibridazione del DNA e PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Totale HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV sonda pgRNA |
| V-HCV-GT2a sonda | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sonda di RNA sensoriale |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sonda di RNA sensoriale mirata HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 Sonda DNA |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sonda per RNA di rilevamento |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | Sonda per RNA IAV |
| V-ZIKA-PP-O2 | ACD Bio | 464531 | Sonda per RNA di senso Zika (+ |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | RNA di senso Zika (-) sonda |
Riferimenti
- Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
- Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (....
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Ristampe e permessi
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