Articolo metodologico

Imaging a fluorescenza multiplexata a singola cellula per visualizzare acidi nucleici e proteine virali e monitorare HIV, HTLV, HBV, HCV, virus Zika e infezione influenzale

DOI:

10.3791/61843

⸱

29 ottobre 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biochemical Pharmacology, Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, University of Missouri School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentato qui un protocollo per un approccio di imaging a fluorescenza, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), un metodo in grado di visualizzare simultaneamente fluorescenza singola cellula di proteine virali e acidi nucleici di diverso tipo e filamento. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di sistemi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'acquisizione dei processi di replicazione dinamica e assemblaggio dei virus è stata ostacolata dalla mancanza di robuste tecnologie di ibridazione in situ (ISH) che consentano la marcatura sensibile e simultanea dell'acido nucleico virale e delle proteine. I metodi convenzionali di ibridazione in situ a fluorescenza del DNA (FISH) spesso non sono compatibili con l'immunocolorazione. Abbiamo quindi sviluppato un approccio di imaging, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein), che consente la visualizzazione simultanea di DNA, RNA e proteine. Rispetto al DNA FISH convenzionale, MICDDRP utilizza la tecnologia ISH del DNA ramificato (bDNA), che migliora notevolmente la sensibilità e il rilevamento della sonda oligonucleotidica. Piccole modifiche di MICDDRP consentono l'imaging di proteine virali in concomitanza con acidi nucleici (RNA o DNA) di diversa filamento. Abbiamo applicato questi protocolli per studiare i cicli di vita di più patogeni virali, tra cui il virus dell'immunodeficienza umana (HIV)-1, il virus T-linfotropico umano (HTLV)-1, il virus dell'epatite B (HBV), il virus dell'epatite C (HCV), il virus Zika (ZKV) e il virus dell'influenza A (IAV). Abbiamo dimostrato che possiamo etichettare in modo efficiente gli acidi nucleici virali e le proteine in una vasta gamma di virus. Questi studi possono fornirci una migliore comprensione meccanicistica di più sistemi virali e, inoltre, servire come modello per l'applicazione dell'imaging a fluorescenza multipla di DNA, RNA e proteine in un ampio spettro di sistemi cellulari.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mentre migliaia di anticorpi commerciali sono disponibili per marcare specificamente le proteine tramite approcci convenzionali di immunocolorazione, e mentre le proteine di fusione possono essere progettate con tag fluorescenti foto-ottimizzati per tracciare più proteine in un campione1, la visualizzazione microscopica delle proteine spesso non è compatibile con l'ibridazione convenzionale della fluorescenza del DNA in situ (FISH)2 . Le limitazioni tecniche nella visualizzazione simultanea di DNA, RNA e proteine utilizzando approcci basati sulla fluorescenza hanno ostacolato una comprensione approfondita della replicazione del virus. Il monitoraggio sia dell'acido nucleico virale che delle proteine durante il corso dell'infezione consente ai virologi di visualizzare i processi fondamentali che sono alla base della replicazione e dell'assemblaggio del virus 3,4,5,6.

Abbiamo sviluppato un approccio di imaging, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and Protein (MICDDRP)3, che utilizza la tecnologia in situ del DNA ramificato (bDNA) per migliorare la sensibilità del rilevamento degli acidi nucleici 7,8,9 . Inoltre, questo metodo utilizza sonde accoppiate per una maggiore specificità. Le sonde specifiche per la sequenza di bDNA utilizzano DNA di preamplificatori ramificati e amplificatori per produrre un segnale intenso e localizzato, migliorando i precedenti metodi di ibridazione che si basavano sul targeting di regioni ripetute nel DNA9. Le cellule infette in un contesto clinico spesso non contengono abbondante materiale genetico virale, fornendo una merce per un metodo sensibile per il rilevamento di acidi nucleici fluorescenti in contesti diagnostici. La commercializzazione della tecnologia del bDNA attraverso approcci come RNAscope7 e ViewRNA10 ha riempito questa nicchia. La sensibilità dell'imaging a fluorescenza del bDNA ha anche un'importante utilità nella biologia cellulare, consentendo il rilevamento di scarse specie di acidi nucleici in modelli di coltura cellulare. Il grande miglioramento della sensibilità rende i metodi di imaging basati sul bDNA adatti allo studio dei virus. Una potenziale carenza, tuttavia, è che questi metodi si concentrano sulla visualizzazione di RNA o RNA e proteine. Tutte le cellule replicanti e molti virus hanno genomi di DNA o formano DNA durante il loro ciclo di replicazione, rendendo altamente desiderabili metodi in grado di visualizzare sia l'RNA e il DNA, sia le proteine.

Nel protocollo MICDDRP, eseguiamo bDNA FISH per la rilevazione di acido nucleico virale utilizzando il metodo RNAscope, con modifiche7. Una delle principali modifiche a questo protocollo è l'ottimizzazione del trattamento della proteasi dopo la fissazione chimica. Il trattamento con proteasi facilita la rimozione delle proteine legate all'acido nucleico per migliorare l'efficienza di ibridazione della sonda. Il trattamento con proteasi è seguito dall'incubazione con sonde oligonucleotidiche ramificate. Dopo l'applicazione di sonde bDNA, i campioni vengono lavati e successivamente incubati con DNA di preamplificatore di segnale e amplificatore. L'ibridazione multiplexata in situ (ISH), marcatura di bersagli genici multipli, richiede sonde bersaglio con diversi canali di colore per la differenziazione spettrale7. L'incubazione con amplificatori del DNA è seguita da immunofluorescenza (IF).

bDNA ISH impartisce miglioramenti nel rapporto segnale-rumore mediante amplificazione di segnali target-specifici, con una riduzione del rumore di fondo da eventi di ibridazione non specifici 7,11. Le sonde target sono progettate utilizzando programmi software disponibili pubblicamente che prevedono la probabilità di eventi di ibridazione non specifici, oltre a calcolare la temperatura di fusione (Tm) dell'ibrido sonda-bersaglio 7,11. Le sonde bersaglio contengono una regione da 18 a 25 basi complementare alla sequenza DNA/RNA bersaglio, una sequenza distanziatrice e una sequenza di coda a 14 basi. Una coppia di sonde bersaglio, ciascuna con una sequenza di coda distinta, si ibridano in una regione bersaglio (che copre ~ 50 basi). Le due sequenze di coda formano un sito di ibridazione per le sonde preamplificatore, che contengono 20 siti di legame per le sonde amplificatore, che contengono inoltre 20 siti di legame per la sonda di etichetta. Ad esempio, una regione di una kilobase (kb) sulla molecola di acido nucleico è presa di mira da 20 coppie di sonde, creando un'impalcatura molecolare per l'ibridazione sequenziale con il preamplificatore, l'amplificatore e la sonda di etichetta. Ciò può quindi portare a una resa teorica di 8000 etichette fluorescenti per molecola di acido nucleico, consentendo il rilevamento di singole molecole e grandi miglioramenti rispetto agli approcci convenzionali FISH7 (vedi Figura 1A per lo schema dell'amplificazione del segnale bDNA). Per impostare le sonde per ISH multiplexato, ogni sonda target deve trovarsi in un canale di colore diverso (C1, C2 o C3). Queste sonde target con diversi canali di colore possiedono distinte sequenze di coda a 14 basi. Queste sequenze di coda collegheranno amplificatori di segnale distinti con diverse sonde fluorescenti, consentendo così una facile differenziazione spettrale su più bersagli. Nel protocollo presentato, la tabella 4 nella fase 9, fornisce ulteriori informazioni sull'etichettatura fluorescente delle sonde target. Inoltre, la Figura 2 e la Figura 3 forniscono esempi di come abbiamo scelto l'amplificatore 4-FL appropriato (A, B o C) (sonda fluorescente e fase finale di ibridazione) per ottenere una marcatura fluorescente specifica di più bersagli virali di acidi nucleici dopo infezioni da HIV-1 e HTLV-1.

Abbiamo dimostrato diverse applicazioni della visualizzazione simultanea della fluorescenza di RNA, DNA e proteine, osservando le fasi critiche della replicazione del virus con alta risoluzione spaziotemporale 3,4,5. Ad esempio, la visualizzazione simultanea di RNA virale, DNA citoplasmatico e nucleare e proteine ci ha permesso di visualizzare eventi chiave durante l'infezione da HIV-1, incluso il seguito di nuclei contenenti RNA nel citoplasma prima dell'ingresso nucleare e dell'integrazione del DNA provirale3. Inoltre, abbiamo applicato MICDDRP per caratterizzare gli effetti dei fattori dell'ospite e del trattamento farmacologico sull'infezione virale e sulla replicazione 4,5. In Ukah et al., abbiamo monitorato la riattivazione della trascrizione dell'HIV-1 in modelli cellulari di latenza trattati con diversi agenti di inversione della latenza per visualizzare la trascrizione dell'HIV e l'inversione della latenza4. Inoltre, MICDDRP può permetterci di visualizzare i cambiamenti fenotipici associati all'inibizione antivirale attribuita al trattamento con piccole molecole o alla restrizione del fattore ospite. Come prova di concetto per la robustezza e l'ampia applicabilità del nostro approccio, abbiamo dimostrato che possiamo utilizzare le modifiche del nostro protocollo per etichettare in modo efficiente l'acido nucleico virale per seguire l'infezione non solo nel virus dell'immunodeficienza umana (HIV)-1, ma anche nel virus T-linfotropico umano (HTLV)-1, nel virus dell'epatite B (HBV), nel virus dell'epatite C (HCV), Virus Zika (ZIKV) e virus dell'influenza A (IAV). Poiché il ciclo di vita dell'HIV-1 è costituito sia da DNA virale che da specie di RNA, abbiamo eseguito la maggior parte della nostra ottimizzazione di MICDDRP seguendo la cinetica di replicazione dell'HIV-1. Tuttavia, in aggiunta, abbiamo dimostrato che possiamo tracciare la sintesi di diversi trascritti di RNA virale di uno o entrambi i filamenti senso (+) e antisenso (-) in virus come ZIKV, IAV, HBV e HCV per monitorare la trascrizione virale e la replicazione 3,4,5,6. Gli studi mirano a migliorare la comprensione meccanicistica di diversi processi virali e servono come linea guida per implementare questa tecnologia di imaging a fluorescenza in una vasta gamma di modelli cellulari.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cellule seme (Suspension vs. Adherent Cells) su coverslip o vetrini da camera (il protocollo presentato utilizza coverslips).

  1. Semina di celle di sospensione
    1. Preparare i coprivetrini rivestiti in poli-D-lisina (PDL) (facilita l'aderenza delle celle di sospensione al coverslip) incubando prima i coprivetrini in etanolo (EtOH) per 5 minuti (sterilizza i vetrini di copertura e rimuove eventuali residui). Quindi lavare 2 volte in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) prima di incubare i vetrini di copertura in PDL (20 μg/ml) per 30 minuti (min) a temperatura ambiente (RT).
    2. Rimuovere PDL e lavare 2 volte in PBS. Celle pellet (precedentemente infettate/trattate in base alle condizioni di imaging desiderate) e risospendere 106cellule in 50 μL di PBS. Spot 50 μL di cellule su vetro (rivestito PDL) e incubare a RT per 30 minuti.
  2. Semina di cellule aderenti
    1. Cellule di coltura su coprislip sterile posto in 6 pozzetti piatto e infettare le cellule con particelle virali o trattare con composto di interesse. Consentire alle cellule di raggiungere il 50-70% di confluenza prima della preparazione del campione per gli esperimenti di imaging.

2. Fissazione cellulare: preservare la morfologia cellulare per gli studi di imaging a fluorescenza

NOTA: Mantenere il 4% di PFA e PBS a RT per almeno 30 minuti prima della fissazione cellulare.

  1. Aspirare il supporto cellulare, lavare le cellule su coprivetrini 3 volte in PBS e fissare le cellule in paraformaldeide (PFA) al 4% per 30 minuti. Aspirare PFA e lavare le celle in PBS 2x.
    NOTA: Le cellule possono ora essere disidratate e conservate, se lo sperimentatore desidera riprendere l'esperimento in un'altra data. Le cellule fisse possono essere disidratate in EtOH prima dello stoccaggio.
    1. Rimuovere il PBS dopo il lavaggio dopo la fissazione cellulare e sostituirlo con 500 μL di EtOH al 50% (v/v in acqua). Incubare a RT per 5 min.
    2. Rimuovere il 50% di EtOH e sostituirlo con 500 μL di 70% di EtOH. Incubare a RT per 5 min.
    3. Rimuovere il 70% di EtOH e sostituirlo con 500 μL di 100% di EtOH. Incubare a RT per 5 min.
    4. Rimuovere 100% EtOH e sostituirlo con fresco 100% EtOH.
      NOTA: Le cellule disidratate possono essere conservate a -20 °C per 6 mesi. Sigillare le piastre con nastro adesivo o parafilm prima dello stoccaggio per evitare l'evaporazione di EtOH.
    5. Reidratare le cellule per passare all'etichettatura a fluorescenza multipla di cellule/virus.
    6. Rimuovere il 100% EtOH e sostituirlo con 500 μL di 70% di EtOH. Incubare a RT per 2 min.
      NOTA: Non lasciare asciugare le cellule in qualsiasi momento. Utilizzare sempre una soluzione sufficiente per immergere tutte le celle.
    7. Rimuovere il 70% di EtOH e sostituirlo con 500 μL di 50% di EtOH. Incubare a RT per 2 min.
    8. Rimuovere il 50% di EtOH e sostituirlo con 1x PBS.
      NOTA: Preparare la diluizione della proteasi, le sonde di ibridazione e il tampone di lavaggio prima del trattamento con proteasi (Fase 4) e dell'applicazione della sonda target (Fase 5). Istruzioni specifiche sulla preparazione del reagente sono presentate all'inizio di ogni rispettiva fase.
ReagentiAltre note
Soluzione di proteasiPreparazione in 1X PBS
Sonda(e) oligonucletodie bersaglioDiluire in tampone di ibridazione
Tampone di lavaggioLavaggi seguendo le fasi di ibridazione target
Buffer di ibridazioneRicetta presentata nella tabella 3

Tabella 1: Reagenti chiave nel protocollo MICDDDRP.

3. Permeabilizzazione cellulare: aumenta l'accesso alla cellula e agli organelli cellulari per l'ingresso di grandi molecole (anticorpi, sonde di ibridazione degli acidi nucleici)

  1. Rimuovere 1x PBS dopo la fissazione cellulare o la reidratazione e sostituirlo con 500 μL di 0,1% (v/v) Tween-20 in 1x PBS. Incubare a RT per 10 min. Sostituisci uno per uno. Lavare una volta con 500 μL di 1x PBS e aggiungere 1x PBS fresco.

4. Immobilizzazione del coverslip su vetrino e trattamento con proteasi per rimuovere le proteine leganti gli acidi nucleici dall'acido nucleico virale/cellulare fisso per migliorare l'efficienza di ibridazione

NOTA: Preparare la soluzione diluita di Proteasi III (vedere le specifiche del reagente nella Tabella dei materiali) durante la permeabilizzazione cellulare. Lasciare che la proteasi raggiunga RT per 10 minuti prima della permeabilizzazione.

  1. Metti una piccola goccia di smalto su un vetrino sterilizzato. Asciugare la schiena (lato senza strato cellulare) e posizionare il bordo della copertina sulla goccia di smalto, con il lato con le cellule aderenti rivolte verso l'alto. Aggiungere alcune gocce di PBS sul coprislip immobilizzato per evitare l'essiccazione.
    1. Disegnare un cerchio (a circa 3 mm di distanza dal coprivetrino) attorno al perimetro del coprivetrino ora aderente al vetrino utilizzando una penna barriera idrofobica (penna idrorepellente che mantiene i reagenti localizzati sulle cellule).
  2. Diluire Proteasi III in 1x PBS (100 μL/coverslip).
    NOTA: Potrebbe essere necessario regolare la concentrazione della proteasi in base alle differenze nei tipi di cellule, nelle sonde o negli acidi nucleici bersaglio attraverso l'ottimizzazione empirica (vedi discussione). Per una marcatura più efficiente di RNA / DNA in diversi sistemi virali, abbiamo avuto successo con le seguenti diluizioni presentate nella Tabella 2 di seguito con diluizioni che vanno da (1 a 2 ) - (da 1 a 15) (proteasi a 1x PBS).
Target della sondaDiluizione della proteasi in 1X PBS (da Proteasi III a 1X PBS)
HIV-1 DNA/RNA1 a 5
HTLV-1 DNA/RNA1 a 5
pgRNA HBV e RNA HBV totale1 a 15
IAV RNA1 a 15
ZIKV RNA1 a 2

Tabella 2: Diluizioni della proteasi III nella PBS per l'ibridazione dell'acido nucleico virale.

  1. Decantare il PBS 1x sul vetrino dopo l'immobilizzazione e applicare la Proteasi III diluita.
  2. Incubare in forno umidificato a 40 °C per 15 min.
  3. Decantare la soluzione di proteasi e immergere i vetrini in 1x PBS. Agitare con un piatto a dondolo per 2 minuti a RT. Ripetere il lavaggio con il nuovo 1x PBS.
    1. Per il solo rilevamento del DNA, lavare i campioni tre volte con acqua priva di nucleasi per 2 minuti ciascuno, seguita da incubazione con 5 mg/ml di RNasi A diluita in PBS per 30 minuti a 37 °C.
    2. Decantare la soluzione RNase A e lavare 3 volte per 2 minuti con acqua ultrapura. Continuare con ISH della/e sonda/e target/e.
      NOTA: Il buffer di ibridazione migliora il rilevamento del vDNA senza influire sull'efficienza di colorazione del vRNA per i risultati presentati (Risultati rappresentativi). Sonde diluite DNA Channel 1 (C1) 1:1 con sonda di ibridazione. Sonde di RNA C2 e C3 diluite in tampone di ibridazione. Le sonde C2 e C3 utilizzate nei nostri studi di imaging sono in soluzioni 50X (1:50; sonda target al buffer di ibridazione).
  4. Preparare il tampone di ibridazione in acqua priva di nucleasi seguendo la procedura passo-passo riportata di seguito:
    1. In una provetta da 15 ml, aggiungere 700 μL di acqua esente da nucleasi, 300 μL del 50% (peso/volume (p/v)) di destrano solfato, 300 μL di 5 M NaCl, 125 μL di 200 mM di citrato di sodio (pH 6,2) e 375 mg (polvere) di carbonato di etilene.
    2. Mescolare bene usando un vortice per sciogliere il carbonato di etilene (assicurarsi che tutta la polvere sia disciolta e la soluzione limpida).
    3. Aggiungere 25 μL del 10% (volume/volume (v/v)) Tween-20 e abbastanza acqua priva di nucleasi per completare 2,5 mL (2x soluzione).
      NOTA: La ricetta per il buffer di ibridazione presentata può essere trovata nella tabella 3 di seguito. La soluzione è stabile per una settimana. Garantire una miscelazione sufficiente del detergente Tween-20, facendo attenzione a prevenire il gorgogliamento della soluzione.
ReagenteConcentrazione delle scorteNote aggiuntive
Acqua esente da nucleasiNA
Destrano solfato50% (w/v)Molto viscoso
Cloruro di sodio5 metri
Citrato di sodio (pH 6,2)200 mMConservare a 4 °C
Carbonato di etileneNAPolvere
Tween-2010% (v/v)

Tabella 3: Elenco dei reagenti del buffer di ibridazione.

5. Incubazione con sonde di ibridazione bersaglio DNA/RNA: le sonde oligonucleotidiche target si legano alle regioni di interesse, creando un'impalcatura molecolare per preamplificatori, amplificatori e sonde fluorescenti da legare.

NOTA: Sonde DNA/RNA calde a 40 °C per 10 minuti (durante la permeabilizzazione cellulare) e raffreddare a RT per almeno 10 minuti, se non è incluso alcun trattamento con RNasi. Se è necessario un trattamento con RNasi o un ulteriore trattamento del campione prima dell'ibridazione della sonda bersaglio, riscaldare le sonde di conseguenza. Ruotare le sonde C2 e C3 dopo il riscaldamento e diluirle in tampone di ibridazione. Dopo la diluizione, le sonde C2 e C3 possono essere brevemente riscaldate. Tampone di lavaggio caldo 50x (vedere la tabella dei materiali per maggiori dettagli) a 40 °C per 10-20 minuti e diluire a 1x in acqua di biologia molecolare.

  1. Incubare 200 μL del tampone di ibridazione a 67 °C per 10 minuti prima dell'aggiunta della o delle sonde di ibridazione. Sonda diluita in tampone di ibridazione (ricetta elencata nella Tabella 2). Aggiungere 50 μL/coprifoglio.
  2. Incubare in forno umidificato a 40 °C per 2 ore (h). Decantare le sonde e immergere i vetrini in 1x tampone di lavaggio. Agitare dondolando per 2 minuti a RT. Ripetere il lavaggio con il nuovo tampone di lavaggio 1x.

6. Ibridazione amplificatore (amp) 1-FL: aggiunta di preamplificatore complementare alla sequenza di coda delle sonde DNA/RNA bersaglio (Fase 5)

NOTA: Gli amplificatori devono essere a RT prima dell'uso. Estrarre ogni singolo amplificatore dal frigo 30 minuti prima dell'uso e lasciare sul banco a RT.

  1. Rimuovere i vetrini dal tampone di lavaggio 1x e toccare/assorbire per rimuovere il liquido in eccesso.
  2. Aggiungere 1 goccia di Amp 1-FL sul foglietto. Incubare in forno umidificato a 40 °C per 30 min.
  3. Decantare Amp 1-FL e immergere in 1x tampone di lavaggio. Agitare con un piatto a dondolo 2 minuti a RT. Ripetere il lavaggio con il nuovo tampone di lavaggio 1x.

7. Ibridazione Amp 2-FL: Incubazione con amplificatore di segnale con sequenza di riconoscimento affine ai preamplificatori (Amp 1-FL)

  1. Rimuovere i vetrini dal tampone di lavaggio 1x e toccare/assorbire per rimuovere il liquido in eccesso.
  2. Aggiungere 1 goccia di Amp 2-FL sulla copertina. Incubare in forno umidificato a 40 °C per 15 min.
  3. Decantare Amp 2-FL e immergere in 1x tampone di lavaggio. Agitare con un piatto a dondolo 2 minuti a RT. Ripetere il lavaggio con il nuovo tampone di lavaggio 1x.

8. Ibridazione Amp 3-FL: Incubazione con secondo amplificatore di segnale

  1. Rimuovere i vetrini dal tampone di lavaggio 1x e toccare/assorbire per rimuovere il liquido in eccesso.
  2. Aggiungere 1 goccia di Amp 3-FL sul coprifoglio. Incubare in forno umidificato a 40 °C per 30 min.
  3. Decantare Amp 3-FL e immergere in 1x tampone di lavaggio. Agitare con un piatto a dondolo 2 minuti a RT. Ripetere il lavaggio con il nuovo tampone di lavaggio 1x.

9. Ibridazione Amp 4-FL: etichetta fluorescente e fase finale di ibridazione

NOTA: Per prima cosa, vedere la Tabella 4 per scegliere l'amplificatore 4 (A, B o C)- FL adatto in base ai canali della sonda o delle sonde target. Valutare quale Amp 4-FL è necessario per etichettare DNA / RNA di interesse. Un esempio è fornito dalla tabella seguente:

UnBC
Canale del DNA 1 (C1)488550550
DNA/RNA Canale 2 (C2)550488647
RNA Canale 3 (C3)647647488

Tabella 4: Selezione della sonda fluorescente Amp 4 (A, B o C)-FL per ISH multiplexato.

NOTA: Per FISH multiplexati (target multipli), la scelta dell'Amp 4 corretto (A, B o C)- FL è fondamentale per etichettare correttamente il target di interesse. Le sonde target (Step 5) hanno canali di colore diversi (C1, C2 o C3), che dettano la rispettiva etichetta fluorescente (Alexa 488, Atto 550 o Alexa 647), in base all'amplificatore 4-FL scelto. Esempi di scelta di combinazioni di fluorofori per l'imaging multiplex sono forniti nelle legende della Figura 2 e della Figura 3. Come ulteriore esempio, la selezione di Amp 4B-FL etichetterà selettivamente le sonde DNA C1 con Atto 550 e le sonde RNA C3 con Alexa 647.

  1. Rimuovere i vetrini dal tampone di lavaggio 1x e toccare/assorbire per rimuovere il liquido in eccesso.
  2. Aggiungere 1 goccia di Amp 4-FL sulla copertina. Incubare in forno umidificato a 40 °C per 15 min.
    NOTA: dopo il passaggio 9.2, tenere i campioni coperti, al riparo dalla luce.
  3. Decantare Amp 4-FL e immergere in 1x tampone di lavaggio. Agitare dondolando per 2 minuti a RT. Ripetere il lavaggio con il nuovo tampone di lavaggio 1x. Lavare con 1x PBS (2 min) e conservare in PBS.

10. Immunocolorazione proteica: per etichettare le proteine di interesse

  1. Decantare PBS e aggiungere 200 μL di tampone bloccante (1% p/v BSA, 10% v/v FBS in PBS con 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) al coprifoglio. Incubare 1 ora a RT.
  2. Decantare tampone bloccante e applicare 200 μL di anticorpo primario diluito in PBST + 1% p/v BSA. Incubare 1 ora a RT.
  3. Lavare il vetrino due volte con PBST per 10 minuti a RT agitando.
  4. Applicare l'anticorpo secondario di scelta per 1 ora a RT in PBST + 1% w/v BSA.
  5. Lavare il vetrino con PBST per 10 minuti a RT agitando.

11. Colorazione nucleare: nuclei contro-colorazione dopo immunocolorazione

  1. Decantare PBST e applicare DAPI o colorazione nucleare di scelta per 1 minuto a RT.
  2. Lavare il vetrino due volte con PBS per 10 minuti a RT agitando.

12. Montaggio

  1. Posizionare 1 goccia di soluzione antisbiadimento (ad esempio, Prolong Gold) su un nuovo vetrino sterile (in primo luogo, pulire il vetrino con EtOH e lasciare asciugare per assicurarsi che non ci siano residui sul vetro). Con la stessa punta, distribuire la goccia di soluzione antisbiadimento per coprire un'area approssimativamente delle dimensioni del vetrino.
    NOTA: la soluzione antisbiadimento è molto viscosa e può essere difficile da pipettare. Tagliare la punta di una punta da 200 μL prima del pipettaggio può mitigare questi problemi.
  2. Rimuovere il coprislip con il campione di cellule dal vetrino e immergerlo in PBS per rimuovere lo smalto residuo sul retro usando la pinza e il PBS. Pinza asciutta e retro della copertina usando un Kimwipe.
  3. Incorporare delicatamente il coprislip nella goccia della soluzione antisbiadimento, posizionando il lato del campione (lato con lo strato cellulare) del coprislip sulla goccia).
  4. Lasciare asciugare i campioni durante la notte.

13. Imaging

  1. Immagine con un microscopio epifluorescente.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uno schema di MICDDRP è illustrato nella Figura 1. L'etichettatura del DNA e dell'RNA è seguita dall'immunocolorazione. L'uso di amplificatori ramificati aumenta il segnale, consentendo la rilevazione di singole molecole di acido nucleico.

figure-results-1
Figura 1: Schema di MICDDRP e flusso di lavoro passo-passo. (A) Il segnale bDNA v...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La visualizzazione simultanea di RNA, DNA e proteine richiede spesso un'ampia ottimizzazione. Due metodi comunemente usati sono l'etichettatura con 5-etinil-2-deossiuridina (EdU) e DNA FISH. L'etichettatura EdU è stata applicata per visualizzare simultaneamente DNA virale e proteine, poiché l'EdU è incorporato nel DNA nascente e successivamente etichettato con coloranti fluorescenti contenenti azoturo tramite chimica a clic. L'etichettatura EdU può quindi essere utilizzata per monitorare la cinetica di replicazi...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto in tutto o in parte dal National Institutes of Health (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 e U54 AI150472). Ringraziamo il Dr. Raymond F. Schinazi e Sadie Amichai per aver fornito cellule infette dal virus dell'influenza A.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4% PFA
50% destrano solfatoAmreso198Per tampone di ibridazione del DNA
50X tampone di lavaggioACD Bio320058
piastre
Amplificatore 1-FLACD Bio
Amplificatore 2-FLACD Bio
Amplificatore 3-FLACD
Amplifier 4-FLACD BioConsult Amp-4 tabella nel protocollo
Anticorpo anti-HCV NS5aAbcamab13833Monoclonale di topo; funziona con i genotipi HCV 1a, 1b, 3 e 4
Anticorpo monoclonale anti-HIV-1 p24di reagenti NIH AIDS 3537
Anticorpo anti-Mov10Abcamab80613Policlonale
di coniglioAnticorpo anti-PB1GeneTexGTX125923Anticorpo contro la proteina dell'influenza
AlbuminaReagente bloccante per l'immunocolorazione
Terreni cellulari con integratoriTerreni appropriati per il modello cellulare
Vetrini coprioggetti
DAPIACD BioColorazione nucleare (kit RNAscope di ACD Bio)
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (1X PBS)Gibco14190250Senza calcio e magnesio
Carbonato di etileneSigmaE26258
Siero fetale bovino (FBS)Utilizzare FBS specifico in base al siero in cui è stato allevato l'anticorpo secondario (ad es. FBS di capra)
Fisherbrand colorfrost plus vetrini per microscopioFisher Scientific12-550-17/18/19Prepulito
Sonda HCV-GT2a-sense-C2ACD Bio441371Sonda di rilevamento dell'RNA HCV(+)
HIV-gagpol-C1ACD Bio317701Sonda cDNA HIV-1
HIV-nongagpol-C3ACD Bio317711-CSonda RNA HIV-1
Forno di ibridazione HybEZACD Bio321710/321720
Penna barriera idrofobica ImmEdgeVector LaboratoriesH-4000
per unghiePer immobolizzare il vetrino coprioggetto da far scorrere prima del trattamento con proteasi
Acqua priva di nucleasiAmbionAM9937
Poli-d-lisina (PDL)Coprioggetti per rivestimento in 20 &; g/mL di PDL per 30 minuti
Diluente perACD Bio300041Per diluire le sonde RNA C2 o C3
Prolungare l'oro antifadeInvitrogenP36930
Proteasi IIIACD Bio322337
RNAscope®   Sonda- V-Influenza-H1N1-H5N1-NPACD Bio436221 RNasi
AQiagen
Anticorpi
Vetrini
CloruroPer tampone di ibridazione del DNA
Citrato di sodio, pH 6,2Per tampone di ibridazione del DNA
Tween-20Per tampone di ibridazione del DNA e PBS-T
V-HBV-GTDACD Bio441351Totale HBV RNA
V-HBV-GTD-01-C2ACD Bio465531-C2HBV sonda pgRNA
V-HCV-GT2a sondaACD Bio441361HCV(-) sonda di RNA sensoriale
V-HTLV-HBZ-sense-C3ACD Bio495071-C3HTLV-1 (-) sonda di RNA sensoriale mirata HBZ
V-HTLV1-GAG-C2ACD Bio495051-C2HTLV-1 Sonda DNA
V-HTLV1-GAG-POL-senseACD Bio495061HTLV-1 (+) sonda per RNA di rilevamento
V-Influenza-H1N1-H5N1-NPACD Bio436221Sonda per RNA IAV
V-ZIKA-PP-O2ACD Bio464531Sonda per RNA di senso Zika (+
V-ZIKA-pp-O2-sense-C2ACD Bio478731-C2RNA di senso Zika (-) sonda
a 6 pozzettiBio Programma sierica bovina Smalto sonda secondari di sodio )

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
  2. Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
  3. Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882(2017).
  4. Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
  5. Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
  6. Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
  7. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  8. Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721(2019).
  9. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
  10. Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
  11. Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
  12. Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
  13. Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
  14. Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505(2020).
  15. Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Multiplex Fluorescence ImagingViral Nucleic Acid DetectionViral Protein VisualizationSingle Cell AnalysisBranched DNA ISH TechnologyImmunofluorescent Cell Based DetectionConfocal MicroscopyHIV 1 Infection StudyHBV RNA QuantificationHCV Infection Imaging

Articoli correlati