Un modello murino di lesione retinica ischemica indotta dall'occlusione dell'arteria carotide comune transiente

La retina è un tessuto neurosensoriale per la funzione visiva. Poiché è necessaria una notevole quantità di ossigeno per la funzione visiva, la retina è conosciuta come uno dei tessuti più esigenti di ossigeno nel corpo¹. La retina è suscettibile alle malattie vascolari poiché l'ossigeno viene fornito attraverso i vasi sanguigni. Vari tipi di malattie vascolari, come la retinopatia diabetica e il vaso sanguigno retinale (vene o arterie) occlusione, possono indurre ischemia retinica. Per studiare i meccanismi patologici dell'ischemia retinica, sono considerati necessari modelli sperimentali riproducibili e clinicamente rilevanti di ischemia retinica. L'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) mediante inserimento di un filamento intraluminale è il metodo più generalmente utilizzato per lo sviluppo di modelli di roditori in vivo di ischemia cerebrale sperimentale^2,3. A causa della vicinanza dell'arteria oftalmica (OpA) a MCA, i modelli MCAO vengono utilizzati anche contemporaneamente per comprendere la fisiopatologia dell'ischemia retinica^4,5,6. Per indurre l'ischemia cerebrale insieme all'ischemia retinica, i filamenti lunghi vengono tipicamente inseriti attraverso l'incisione della comune arteria carotide (CCA) o dell'arteria carotide esterna (ECA). Questi metodi sono difficili da eseguire, richiedono molto tempo per completare l'intervento chirurgico (oltre 60 minuti per un topo) e portano ad alte variabilità nei risultati dopo l'intervento^{chirurgico 7}. Resta importante sviluppare un modello migliore per migliorare tali preoccupazioni.

In questo studio, abbiamo semplicemente usato breve occlusione bilaterale CCA transitoria (tBCCAO) con aghi e un morsetto per indurre l'ischemia retinica nei topi e analizzato i risultati tipici delle lesioni ischemiche nella retina. In questo video, daremo una dimostrazione della procedura tBCCAO.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Keio University School of Medicine.

1. Preparazione di strumenti chirurgici e animali

1. Autoclave strumenti chirurgici e tenerli in 70% alcol etilico. Prima di ogni nuova procedura chirurgica, pulire accuratamente gli strumenti chirurgici utilizzando il 70% di alcol etilico.
2. Preparare topi BALB/cAJc1 maschi (6 settimane, 26-28 kg) in una stanza priva di agenti patogeni specifici (SPF) per mantenere condizioni sterili prima, durante e dopo l'intervento chirurgico.

2. Occlusione dell'arteria carotide comune bilaterale transitoria (tBCCAO)

1. Mettere un topo in anestesia mediante iniezione intraperitoneale con una combinazione di midazolam (40 μg/100 μL), medetomidina (7,5 μg/100 μL) e tartrato butorfannolo (50 μg/100 μL), detto "MMB", come descritto in precedenza^8,9. Tenere le skin della schiena del mouse per evitare che il mouse sbatta gli occhi fino a quando il mouse non viene completamente anestetizzato.
   1. Giudicare la profondità dell'anestesia pizzicando la dita del mouse fino a quando non ha risposta, di cui il metodo viene comunemente utilizzato per controllare l'anestesia completa¹⁰.
      NOTA: Generalmente, sono necessari meno di 5 minuti affinché i topi si addormentino. Le ricette corrette per l'anestesia generale possono essere diverse dalle istituzioni.
2. Applicare una goccia di soluzione di caduta oculare ialuronato di sodio purificata allo 0,1% sugli occhi per prevenire la secchezza degli occhi in anestesia.
3. Posizionare il mouse sulla schiena e fissare le zampe del mouse utilizzando nastri adesivi.
4. Disinfettare l'area del collo del mouse usando il 70% di alcol etilico prima dell'intervento chirurgico.
   NOTA: Il ritaglio aggiuntivo della pelliccia non è stato eseguito in quanto ciò può causare successiva^{infiammazione della pelle 11,12}.
5. Eseguire l'incisione sagittale del collo con una lama (Figura 1).
   NOTA: L'incisione deve essere effettuata sulla linea mediana tra collo, sterno e trachea.
6. Separare attentamente entrambe le ghiandole salivari usando due forcep e mobilitarle per visualizzare le CTA sottostanti.
7. Isolare attentamente il CCA destro dai rispettivi nervi vagali e dalle vene di accompagnamento senza danneggiare le loro strutture e posizionare due suture di seta 6-0 sotto il CCA. Legare saldamente le due cravatte per bloccare il flusso sanguigno (Figura 1).
   NOTA: Durante la procedura, piccole vene potrebbero essere danneggiate. Se si vede sanguinamento, è necessario pulire per visualizzare chiaramente i CCA.
8. Trovare il CCA sinistro con attenzione dai rispettivi nervi vagali e dalle vene di accompagnamento senza danneggiare le loro strutture e occludere il CCA sinistro per 2 secondi da un morsetto (Figura 1).
   NOTA: È necessario posizionare un ago da sutura di seta 6-0 sotto il CCA sinistro per contrassegnare un sito per il bloccaggio.
9. Dopo la riapertura del CCA sinistro, le ferite da sutura del collo da una sutura di seta 6-0 e applicare un tampone di antibiotico (50 μL) sul collo per inibire l'infezione batterica.
   NOTA: Rimuovere dolcemente un morsetto per evitare di danneggiare la parete arteriosa durante la riapertura del CCA sinistro.
10. Iniettare 0,75 mg/kg di atipamezolo cloridrato per via intraperitoneale al topo per aiutare il topo a recuperare rapidamente dall'anestesia profonda. Riportare il mouse in una gabbia per topi con cuscinetti preriscaldati.
    NOTA: Non lasciare il mouse lasciato incustodito fino a quando il mouse non riacquista sufficiente coscienza per mantenere la reclinanza sternale.
11. Iniettare 0,4 mg/kg di tartrato di butorfanolo al topo per la gestione del dolore quando il topo si sveglia.
    NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Come primo suggerimento per il successo del tBCCAO, si può osservare lo sbavatura delle palpebre del topo (Figura 2).
12. Per l'eutanasia, iniettare 3 volte di miscela di MMB ai topi e sacrificarli per esperimenti.

3. Osservazioni generali (tassi di sopravvivenza e sbavatura palpebrali)

1. Dopo l'intervento chirurgico, controllare i tassi di sopravvivenza per tutte le cause di morte al giorno 0 (dopo l'intervento chirurgico), 1, 3 e 7.
2. Valutare lo sbavatura delle palpebre con una scala di valutazione di 4 punti: 1 = nessun cadente, 2 = lieve sbavatura (~50%), 3 = grave sbavatura (oltre il 50%) e 4 = grave sbavatura con scarica oculare.

4. Perfusione di sangue retinica

1. Iniettare 200 μL di FITC-dextran (25 mg/mL) nel ventricolo sinistro del topo, che è comunemente usato per l'osservazione della perfusione di sangue nei vasi retinici del^{topo 13,14}.
2. 2 minuti dopo la circolazione, enucleare gli occhi e fissare in paraformaldeide al 4% per 1 ora. Le retine sono state accuratamente ottenute e montate in piano, come descritto^{in precedenza 15}, ed esaminate tramite un microscopio a fluorescenza.
3. Scattare fotografie dei supporti integrali retini con ingrandimento 4x e unirsi in un unico utilizzando un analizzatore di unione, descritto in precedenza¹⁶.
4. Misurare le aree perfuse tramite uno strumento di analisi delle navi nel software NIH Fiji/ImageJ.

5. Macchia occidentale

1. 3 e 6 ore dopo il tBCCAO, ottenere gli occhi dei topi e trasferire immediatamente in una piastra di Petri contenente PBS freddo per isolare le retine.
2. Dopo l'isolamento delle retine, eseguire l'assorbimento occidentale, come descritto in precedenza⁹.
3. Incubare con anticorpi per fattore ipossia-inducibile-1α (HIF-1α; un marcatore di ipossia generale) e per β-Actin (un controllo interno del carico) durante la notte seguito dall'incubazione di anticorpi secondari coniugati con HRP. Visualizza i segnali tramite chemiluminescenza.

6. PCR quantitativo (qPCR)

1. 6, 12 e 24 ore dopo tBCCAO, elaborare le retine ottenute per qPCR, come descritto in precedenza¹⁷.
2. Eseguire qPCR tramite sistema PCR in tempo reale. I primer utilizzati sono elencati nella tabella 1. Calcola le variazioni di piegatura tra i livelli di trascrizioni diverse con il metodo ΔΔC_T.

7. Immunoistochimica (IHC)

1. 3 giorni dopo tBCCAO, ottenere gli occhi dei topi e incorporare in paraffina.
2. Tagliare gli occhi incorporati nella paraffina con un microtomo per ottenere le sezioni oculari.
3. De-paraffinare e macchiare le sezioni oculari di 5 μm di spessore come descritto in precedenza¹³.
4. Incubare con un anticorpo per la proteina acida fibrillare gliale (GFAP; un marcatore affidabile per astrociti e cellule di Müller nella retina) durante la notte seguito dall'incubazione di anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor 555.
5. Utilizzare DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo) per macchiare il nucleo nella retina. Visualizza i segnali tramite un microscopio a fluorescenza.
6. Valutare il punteggio morfologico in base a una scala di valutazione di 4 punti, come descritto in^{precedenza 13,18}: 0 = nessun segnale, 1 = pochi piedi finali gliali positivi nello strato di cellule gangliari (GCL), 2 = pochi processi etichettati che vanno dal GCL allo strato nucleare esterno (ONL) e 3 = processi più etichettati che vanno da GCL a ONL.

8. Elettroretinografia (ERG)

1. 3 e 7 giorni dopo tBCCAO, eseguire ERG utilizzando una cupola di Ganzfeld, un sistema di acquisizione e stimolatori LED, come descritto in precedenza⁹.
2. Dopo l'adattamento scuro durante la notte, anestetizza i topi con una combinazione di MMB sotto la luce rossa fioca.
3. Utilizzare una soluzione mista dello 0,5% di tropicamide e dello 0,5% di fenilefrina per dilatare le pupille.
4. Posizionare gli elettrodi attivi sulla lente a contatto e posizionare l'elettrodo di riferimento in bocca.
5. Ottenere risposte ERG da entrambi gli occhi di ogni animale.
6. Registra le risposte scotopiche sotto l'adattamento oscuro con vari stimoli.
7. Misurare le ampiezze di un'onda dalla linea di base al punto più basso di un'onda.
8. Misurare le ampiezze dell'onda b dal punto più basso di un'onda al picco dell'onda b.
9. Tenere tutti i topi al caldo durante la procedura utilizzando termoscapacchi.

9. Tomografia a coerenza ottica (PTOM)

1. 2 settimane dopo tBCCAO, eseguire lo Strumento di personalizzazione di Office utilizzando il sistema SD-OCT, come^{precedentemente riportato 8,9}.
2. Per la misurazione, sottoscrivi i topi alla mioriasi con una soluzione mista dello 0,5% di tropicamide e 0,5% di fenilefrina e all'anestesia generale da una miscela di MMB.
3. Ottenere immagini di scansione B da fette equatoriali di scansioni en-face.
4. Esaminare le retine a 0,2, 0,4 e 0,6 mm dalla testa del nervo ottico.
5. Misurare lo spessore retinico dallo strato di fibra nervosa retinica (NFL) alla membrana limitante esterna (ELM), e considerare la media dei valori misurati come spessore retinico di un singolo topo.
6. Traccia i risultati come diagrammi a ragno.

Dopo la circolazione sistemica del FITC-dextran per 2 minuti, sono state esaminate le vasculure retiniche delle retine sinistra e destra nei topi azionati da sham e nei topi azionati da tBCCAO (Figura complementare 1). Fitc-dextran era completamente visibile sia nelle retine nei topi a farsa che nella retina sinistra nei topi azionati da tBCCAO, mentre era parzialmente rilevabile nella retina destra nei topi azionati da tBCCAO.

Dopo il tBCCAO, è stato esaminato lo sbavatura delle palpebre(figura 2). Gli occhi giusti hanno mostrato lievi (punteggio 2; 75%) e palpebra grave (punteggio 3 e 4; 25%) cadenti, mentre gli occhi di sinistra non hanno sbavato (punteggio 1; 93,75%) ad eccezione di un mouse (punteggio 2; 6,25%). Sebbene nei topi azionati da tBCCAO non sia stato osservato considerevolmente un grave sbavatura palpebrale con scarica oculare, abbiamo potuto vedere un topo per questo fenotipo (punteggio 4; 6,25%).

La riduzione dello stato di ossigeno nei tessuti porta alla stabilizzazione dell'HIF-1α e all'induzione di una serie di geni reattivi all'ipossia come EPO, VEGF e BNIP319,20,21. Prima di tutto, l'ipossia biologica molecolare con un marcatore ipossico generale HIF-1α è stata valutata tramite gonfiore occidentale (Figura 3). L'aumento dell'espressione hif-1α è stato significativamente osservato nella retina destra 3 e 6 ore dopo il tBCCAO. Successivamente, le espressioni dei geni ipossia-reattivi sono state valutate tramite qPCR (Figura complementare 2). Non c'è stato alcun cambiamento significativo nelle espressioni geniche reattive all'ipossia 6 ore dopo il tBCCAO. 12 ore dopo tBCCAO, abbiamo trovato l'espressione Binp3 significativamente aumentata e un leggero aumento dell'espressione Epo è stato mostrato nella retina destra. 24 ore dopo tBCCAO, abbiamo anche potuto trovare un leggero aumento dell'espressione Epo nella retina destra anche se non era statisticamente significativa. L'espressione di Vegf non è stata alterata da 6 a 24 ore nei topi azionati da tBCCAO.

La gliosi reattiva retinica è stata esaminata 3 giorni dopo il tBCCAO (Figura 4), poiché glia come gli astrociti e cellule di Müller sono stati strettamente associati all'ischemia retinica22. GFAP è stato ampiamente utilizzato per il rilevamento di astrociti e cellule di Müller nella retina23. La media dei punteggi morfologici per l'etichettatura GFAP nella retina destra era la più alta tra le retine sia nei topi azionati da sham che nella retina sinistra nei topi azionati da tBCCAO. Sulla base della localizzazione dell'espressione GFAP, si ritiene che un cambiamento di morfologia nell'etichettatura GFAP rifletta l'attivazione delle cellule Müller.

L'ERG è stato utilizzato per esaminare la disfunzione retinica dopo tBCCAO(Figura 5). Le ampiezze dell'onda b nell'occhio destro sono drasticamente diminuite 3 e 7 giorni dopo il tBCCAO. Tuttavia, le ampiezze di un'onda nell'occhio destro non sono state significativamente cambiate. Quando si tratta dell'occhio sinistro, non abbiamo potuto vedere alcun cambiamento nelle ampiezze delle onde a e b (Figura complementare 3).

Abbiamo eseguito oct per determinare un'alterazione dello spessore della retina dopo tBCCAO(Figura 6). Lo spessore della retina nell'occhio destro è aumentato drasticamente 2 settimane dopo il tBCCAO, mentre non c'era differenza nello spessore della retina nell'occhio sinistro tra i topi tBCCAO e finti.

Figura 1: Schema della procedura del modello e della circolazione sanguigna nel cerchio di Willis. Un'illustrazione schematica ha mostrato la procedura del modello di topo ischemico retinica indotta da tBCCAO e la circolazione sanguigna alla retina. CCA, ECA, ICA, PCA e OpA rappresentano rispettivamente l'arteria carotide comune, l'arteria carotide esterna, l'arteria carotide interna, l'arteria comunicante posteriore e l'arteria oftalmica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Palpebra cadente dopo tBCCAO. La gravità dello sbavatura delle palpebre è stata valutata con una valutazione di 4 punti in base alle immagini di riferimento: 1 = nessun cadente, 2 = lieve sbavatura (~50% cadente), 3 = cadenza grave (oltre il 50% cadente) e 4 = grave sbavatura con scarica oculare. La palpebra cadente è stata osservata dopo il tBCCAO ed è stata mantenuta durante l'osservazione sperimentale. I risultati (sham: n = 10, tBCCAO: n = 16) sono stati tracciati come un grafico a punti a dispersione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Stabilizzazione hif-1α dopo tBCCAO. Immunobloti rappresentativi e analisi quantitative (gruppi per l'ora 3; sham: n = 3, tBCCAO: n = 6 e gruppi per l'ora 6; sham e tBCCAO: n = 6) per HIF-1α e β-Actin hanno dimostrato che HIF-1α è stato stabilizzato nella retina destra 3 e 6 ore dopo tBCCAO. *P < 0,05. I dati sono stati analizzati utilizzando il test tdi Student e presentati come meschino con ±standard. L e R stanno rispettivamente per la retina sinistra e destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Gliosi reattiva dopo tBCCAO. Sezioni sagittali rappresentative delle retine (sham: n = 4, tBCCAO: n = 4) e analisi quantitative dell'etichettatura GFAP (rosso) con un punteggio morfologico (0-3) hanno mostrato che l'etichettatura GFAP, per lo più limitata in NFL +GCL, è stata espansa all'intero strato interno, da GCL a ONL (frecce bianche) nella retina destra dopo tBCCAO. Barre di scala, 50 μm. Dapi (blu) è stato utilizzato per macchiare il nucleo nella retina. NFL, GCL, IPL, INL e ONL rappresentano rispettivamente lo strato di fibra nervosa, lo strato di cellule gangliari, lo strato plessiforme interno, lo strato nucleare interno e lo strato nucleare esterno. I dati sono stati analizzati utilizzando il test t diStudent e presentati come mediani con intervallo interquartile, 25° e 75° percentile. *P < 0,05. L e R stanno rispettivamente per la retina sinistra e destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Disfunzione visiva nell'occhio destro dopo tBCCAO. (A) Forme d'onda rappresentative di ERG adattato al buio eseguite 3 e 7 giorni dopo il tBCCAO. Intensità di stimolazione (cd.s/m2): 0,005. (B) Le analisi quantitative hanno mostrato che vi è stata una diminuzione delle ampiezze dell'onda b nell'occhio destro (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6) mentre le ampiezze di un'onda non sono state modificate. *P < 0,05, **P < 0,01. I dati sono stati analizzati utilizzando il test tdi Student e presentati come meschino con ±standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Variazione dello spessore della retina dopo tBCCAO. Le immagini rappresentative degli OCT nelle retine gestite da sham e tBCCAO e le analisi quantitative hanno mostrato che c'è stato un aumento dello spessore della retina nella retina destra (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). Non c'è stato alcun cambiamento nello spessore della retina nella retina sinistra (sham: n = 4, tBCCAO: n = 8). Le barre di scala sono rispettivamente 200 (superiore) e 100 (inferiore) μm. *P < 0,05. I valori nell'asse orizzontale dei diagrammi rappresentano 0,2, 0,4 e 0,6 mm di distanza dalla testa del nervo ottico (0) rilevata dalla linea verde. I dati sono stati analizzati utilizzando ANOVA bi senso seguito da un test post hoc Bonferroni. I diagrammi ragno sono stati presentati come meschino con ± deviazione standard. NFL, INL, ONL ed ELM sono rispettivamente lo strato di fibra nervosa, lo strato nucleare interno, lo strato nucleare esterno e la membrana limitante esterna. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura complementare 1: Perfusione di sangue retinica dopo tBCCAO. Immagini rappresentative a montaggio piatto retinale (con ingrandimento più elevato di ogni immagine) dopo 2 minuti di circolazione FITC-dextran e analisi quantitative hanno mostrato che la perfusione completa era osservabile sia nelle retine nei topi azionati da sham che nella retina sinistra nei topi azionati da tBCCAO. Tuttavia, la retina destra nei topi azionati da tBCCAO ha mostrato una parziale perfusione di sangue. I dati sono stati analizzati utilizzando il test tdi Student e presentati come meschino con ±standard. L e R stanno rispettivamente per la retina sinistra e destra. Le barre di scala sono rispettivamente 800 e 400 μm. Clicca qui per scaricare questa cifra.

Figura complementare 2: Espressioni di geni ipossia-reattivi dopo tBCCAO. Le analisi quantitative hanno mostrato un aumento transitorio dell'espressione di MRNA Bnip3 nella retina destra con significatività statistica 12 ore dopo il tBCCAO. L'espressione di Epo mRNA ha mostrato una crescente tendenza nella retina destra per 24 ore dopo il tBCCAO, sebbene i suoi valori non fossero significativamente diversi rispetto alla retina destra azionata da sham. **P < 0,01. I dati sono stati analizzati utilizzando il test tdi Student e presentati come meschino con ±standard. Clicca qui per scaricare questa cifra.

Figura complementare 3: Funzione visiva nell'occhio sinistro dopo tBCCAO. Le analisi quantitative hanno mostrato che non vi è stato alcun cambiamento nelle ampiezze delle onde a e b nell'occhio sinistro (sham: n = 5, tBCCAO: n = 6). P > 0,05. I dati sono stati analizzati utilizzando il test tdi Student e presentati come meschino con ±standard. Clicca qui per scaricare questa cifra.

Figura complementare 4: Tassi di sopravvivenza dopo tBCCAO in C57BL6 e BALB. Le curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier hanno dimostrato che quasi tutti i topi sono morti entro 3 giorni dopo il tBCCAO nei topi C57BL6. Quando si tratta di topi BALB, il tempo di bloccaggio più lungo in tBCCAO induce morte improvvisa e grave degli animali (tassi di sopravvivenza il giorno 7, 20 secondi: 10%, 10 sec: 20%, 2 sec: 81% e 0 sec: 95%). Clicca qui per scaricare questa cifra.

Figura complementare 5: stabilizzazione hif-1α dopo CCAO unilaterale. Un'immunoblot rappresentativa e un'analisi quantitativa (sham: n = 3, CCAO unilaterale: n = 3) per HIF-1α e β-Actin hanno dimostrato che HIF-1α non è stato stabilizzato nelle retine 3 ore dopo il CCAO unilaterale. P > 0,05. I dati sono stati analizzati utilizzando il test tdi Student e presentati come meschino con ±standard. L e R stanno rispettivamente per la retina sinistra e destra. Clicca qui per scaricare questa cifra.

Figura supplementare 6: Grave palpebra cadente dopo tBCCAO con lungo tempo di bloccaggio. 10 secondi di sbavatura grave della palpebra indotta da tBCCAO, che è stata valutata da una scala di valutazione di 4 punti: 1 = nessun cadente, 2 = lieve sbavatura (~50%), 3 = grave sbavatura (oltre il 50%) e 4 = grave cadente con scarica oculare, come descritto nella figura 2. Clicca qui per scaricare questa cifra.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.