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Articolo metodologico

Valutazione in tempo reale della microperfusione del midollo spinale in un modello suino di ischemia/riperfusione

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DOI:

10.3791/62047

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10 dicembre 2020

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1Department of Anesthesiology, Center of Anesthesiology and Intensive Care Medicine, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2University Department for Vascular Surgery and Department of Operative Medicine, Medical University of Innsbruck, 3Department of Medical Biometry and Epidemiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 4Department of Vascular Medicine, University Heart and Vascular Center Hamburg (UHZ), 5Department of Cardiology, Rostock University Medical Center, 6University Department for Cardiac Surgery, Heart Center Leipzig

In questo articolo

Sommario

La microcircolazione del midollo spinale svolge un ruolo fondamentale nella lesione del midollo spinale. La maggior parte dei metodi non consente la valutazione in tempo reale della microcircolazione del midollo spinale, che è essenziale per lo sviluppo di terapie mirate alla microcircolazione. Qui, proponiamo un protocollo che utilizza sonde Laser-Doppler-Flow Needle in un modello animale di ischemia/ riperfusione di grandi dimensioni.

Abstract

La lesione del midollo spinale è una complicanza devastante della riparazione aortica. Nonostante gli sviluppi per la prevenzione e il trattamento delle lesioni del midollo spinale, la sua incidenza è ancora considerevolmente elevata e, pertanto, influenza l'esito del paziente. La microcircolazione svolge un ruolo chiave nella perfusione tissutale e nell'apporto di ossigeno ed è spesso dissociata dalla macroemodinamica. Pertanto, la valutazione diretta della microcircolazione del midollo spinale è essenziale per lo sviluppo di terapie mirate alla microcircolazione e la valutazione degli approcci esistenti per quanto riguarda la microcircolazione del midollo spinale. Tuttavia, la maggior parte dei metodi non fornisce una valutazione in tempo reale della microcircolazione del midollo spinale. Lo scopo di questo studio è quello di descrivere un protocollo standardizzato per la valutazione microcircolatoria del midollo spinale in tempo reale utilizzando sonde ad ago laser-Doppler inserite direttamente nel midollo spinale. Abbiamo usato un modello suino di ischemia/riperfusione per indurre il deterioramento della microcircolazione del midollo spinale. Inoltre, è stata utilizzata una tecnica di iniezione di microsfere fluorescenti. Inizialmente, gli animali sono stati anestetizzati e ventilati meccanicamente. Successivamente, è stato eseguito l'inserimento della sonda ad ago laser-Doppler, seguito dal posizionamento del drenaggio del liquido cerebrospinale. È stata eseguita una sternotomia mediana per l'esposizione dell'aorta discendente per eseguire il cross-clamping aortico. L'ischemia/riperfusione è stata indotta da cross-clamping aortico sopra-celiaco per un totale di 48 min, seguito da riperfusione e stabilizzazione emodinamica. Laser-Doppler Flux è stato eseguito in parallelo con la valutazione macroemodinamica. Inoltre, il drenaggio automatico del liquido cerebrospinale è stato utilizzato per mantenere una pressione cerebrospinale stabile. Dopo il completamento del protocollo, gli animali sono stati sacrificati e il midollo spinale è stato raccolto per l'analisi istopatologica e della microsfera. Il protocollo rivela la fattibilità di misurazioni di microperfusione del midollo spinale utilizzando sonde laser-Doppler e mostra una marcata diminuzione durante l'ischemia e il recupero dopo la riperfusione. I risultati hanno mostrato un comportamento paragonabile alla valutazione della microsfera fluorescente. In conclusione, questo nuovo protocollo potrebbe fornire un utile modello animale di grandi dimensioni per studi futuri che utilizzano in tempo reale la valutazione della microperfusione del midollo spinale in condizioni di ischemia / riperfusione.

Introduzione

La lesione del midollo spinale indotta da ischemia/riperfusione (SCI) è una delle complicanze più devastanti della riparazione aortica associata a esito ridotto1,2,3,4. Le attuali opzioni di prevenzione e trattamento per SCI includono l'ottimizzazione dei parametri macroemodinamici e la normalizzazione della pressione del liquido cerebrospinale (CSP) per migliorare la pressione di perfusione del midollo spinale2,5,6,7,8,9. Nonostante l'implementazione di queste manovre, l'incidenza di SCI varia ancora tra il 2% e il 31% a seconda della complessità della riparazione aortica10,11,12.

Recentemente, la microcircolazione ha guadagnato maggiore attenzione13,14. La microcircolazione è l'area di assorbimento di ossigeno cellulare e di scambio metabolico e, pertanto, svolge un ruolo fondamentale nella funzione degli organi e nell'integrità cellulare13. Il flusso sanguigno microcircolatorio alterato è un importante determinante dell'ischemia tissutale associata ad un aumento della mortalità15,16, 17,18,19. La compromissione della microcircolazione del midollo spinale è associata a una ridotta funzione neurologica e all'esito20,21,22,23. Pertanto, l'ottimizzazione della microperfusione per il trattamento della SCI è un approccio molto promettente. La persistenza dei disturbi microcircolatori, nonostante l'ottimizzazione macrocircolatoria, è stata descritta26,27,28,29. Questa perdita di coerenza emodinamica si verifica frequentemente in varie condizioni tra cui ischemia/riperfusione, sottolineando la necessità di una valutazione microcircolatoria diretta e di terapie mirate alla microcircolazione26,27,30.

Finora, solo pochi studi hanno utilizzato sonde laser-Doppler per la valutazione in tempo reale del comportamento microcircolatorio del midollo spinale20,31. Gli studi esistenti hanno spesso utilizzato tecniche di iniezione della microsfera, che sono limitate dall'uso intermittente e dall'analisi post-mortem32,33. Il numero di diverse misurazioni che utilizzano la tecnica di iniezione della microsfera è limitato dalla disponibilità di microsfere con diverse lunghezze d'onda. Inoltre, a differenza delle tecniche Laser-Doppler, la valutazione in tempo reale della microperfusione non è possibile, poiché per questo metodo è necessaria l'elaborazione e l'analisi dei tessuti post-mortem. Qui presentiamo un protocollo sperimentale per la valutazione in tempo reale della microcircolazione del midollo spinale in un modello animale sucino di grandi dimensioni di ischemia/riperfusione.

Questo studio faceva parte di un grande progetto su animali che combinava uno studio randomizzato che confrontava l'influenza dei cristalloidi rispetto ai colloidi sulla microcircolazione in ischemia / riperfusione e uno studio randomizzato esplorativo sugli effetti dei fluidi rispetto ai vasopressori sulla microperfusione del midollo spinale. La calibrazione a 2 punti della sonda di flusso e la calibrazione del catetere a punta di pressione sono state precedentemente descritte34. Oltre al protocollo riportato, sono state utilizzate microsfere fluorescenti per la misurazione della microperfusione del midollo spinale, come precedentemente descritto, utilizzando 12 campioni di tessuto del midollo spinale per ciascun animale, con campioni 1-6 che rappresentano il midollo spinale superiore e 7-12 che rappresentano il midollo spinale inferiore35,36. L'iniezione di microsfere è stata eseguita per ogni fase di misurazione dopo il completamento delle registrazioni Laser-Doppler e della valutazione macroemodinamica. La valutazione istopatologica è stata eseguita utilizzando il Kleinman-Score come precedentemente descritto37.

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Protocollo

Lo studio è stato approvato dalla Commissione governativa per la cura e l'uso degli animali della città di Amburgo (riferimento n. 60/17). Gli animali hanno ricevuto cure in conformità con la "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" (pubblicazione NIH n. 86-23, rivista nel 2011) e le raccomandazioni e gli esperimenti FELASA sono stati condotti secondo le linee guida ARRIVE24,25. Questo studio è stato uno studio acuto e tutti gli animali sono stati sottoposti a eutanasia alla fine del protocollo.

NOTA: Lo studio è stato condotto su sei suini maschi e femmine di tre mesi (Landrace tedesca) di peso di circa 40 kg. Gli animali sono stati portati nelle strutture per la cura degli animali almeno 7 giorni prima degli esperimenti e sono stati ospitati in conformità con le raccomandazioni sul benessere degli animali. Agli animali sono stati forniti cibo e acqua ad libitum e il loro stato di salute è stato regolarmente valutato dal veterinario responsabile. Un tempo di digiuno di 12 ore è stato mantenuto prima degli esperimenti. L'intera procedura sperimentale e la manipolazione degli animali è stata supervisionata dal veterinario responsabile.

1. Induzione dell'anestesia e mantenimento dell'anestesia

  1. Per l'induzione dell'anestesia e il mantenimento dell'anestesia, premedicare gli animali e sedarli profondamente usando un'iniezione intramuscolare seguita da iniezioni endovenose, se necessario, per eseguire l'intubazione endotracheale. Successivamente, indurre e mantenere l'anestesia utilizzando una combinazione di un agente di anestesia volatile con un'applicazione continua di oppioidi integrata con un'ulteriore iniezione in bolo di oppioidi.
  2. Eseguire iniezioni intramuscolari di ketamina 20 mg·kg-1, azaperone 4 mg·kg-1e midazolam 0,1 mg·kg-1 per premedicazione e sedazione.
  3. Posizionare un catetere venoso in una vena dell'orecchio, fissare una corretta fissazione e valutare la funzionalità applicando rapidamente 10 ml di soluzione salina.
  4. Metti l'animale in posizione supina su una coperta riscaldante per prevenire la perdita di calore.
  5. Stabilire un monitoraggio di base con elettrocardiografia (ECG) e pulsossimetria per monitorare lo stato cardio-polmonare degli animali e collegarlo all'hardware di monitoraggio di base.
  6. Somministrare 15 L·min-1 di ossigeno tramite una maschera a forma di maiale per la preossigenazione.
  7. Iniettare boli per via endovenosa di 0,1 mg·kg-1 di propofol all'1%, se necessario, ed eseguire l'intubazione endotracheale.
  8. Fissare il corretto posizionamento con capnografia e auscultazione di marea, somministrare 0,1 mg•kg-1 di pancuronio e garantire la corretta fissazione del tubo endotracheale.
  9. Stabilire una ventilazione volumetrica controllata utilizzando volumi di marea di 10 ml·kg-1 peso corporeo-1,una pressione espiratoria finale positiva di 10 cmH2O e una frazione di ossigeno inspirato (FiO2)di 0,3 utilizzando la macchina per anestesia. Regolare la frequenza del ventilatore per mantenere una tensione di anidride carbonica espiratoria terminale (etCO2) di 35-45 mmHg.
  10. Introdurre un tubo gastrico, eseguire l'aspirazione dei fluidi gastrici, fissare correttamente il tubo e collegarlo a una sacca di raccolta. Chiudere con attenzione gli occhi dell'animale per prevenire la secchezza degli occhi durante l'anestesia.
  11. Mantenere l'anestesia mediante infusione continua di fentanil (10 μg·kg-1·h-1) e sevoflurano (concentrazione scaduta del 3,0%, erogata dal vapore). Garantire un adeguato livello di anestesia attraverso un'attenta osservazione dei segni vitali e dei parametri di ventilazione nonché dall'assenza di movimenti durante l'intero protocollo, prestando particolare attenzione alle fasi di stimolo chirurgico. Somministrare ulteriori dosi in bolo di fentanil (50 μg) se vi è qualche indicazione di dolore o angoscia.
    NOTA: Garantire la presenza di ricercatori esperti in anestesia animale durante l'intera procedura e utilizzare la supervisione di un veterinario esperto per garantire un'anestesia adeguata.
  12. Somministrare una velocità di infusione basale di10ml·kg -1 ·h-1 cristalloidi bilanciati per compensare le perdite di liquidi durante l'anestesia, la preparazione chirurgica e l'esecuzione del protocollo sperimentale. Utilizzare uno scalda fluido per prevenire la perdita di calore.
  13. Pulire delicatamente la pelle del maiale con acqua saponata. Utilizzare una soluzione di disinfezione della pelle contenente povidone-iodio per ridurre la contaminazione della pelle. Utilizzare guanti sterili per preparazioni chirurgiche. Applicare 300 mg di clindamicina come profilassi antimicrobica e ripetere il dosaggio dopo 6 ore.

2. Posizionamento della sonda

  1. Posiziona l'animale nella giusta posizione laterale e fletti la schiena dell'animale per allargare lo spazio tra le vertebre.
  2. Esporre chirurgicamente l'area paravertebrale per la preparazione di processi spinosi e archi vertebrali (Figura 1A).
  3. Posizionare un paramediatore vascolare 14 G del catetere venoso periferico nel midollo spinale a livello della vertebra toracica (Th) 13/14 o della vertebra lombare (L) 1/2 tra due archi vertebrali (Figura 1B).
  4. Rimuovere l'ago, inserire la sonda dell'ago laser/Doppler sul catetere venoso (Figura 1C) e testare la qualità del segnale collegandosi all'hard-up e al software designato. Assicurarsi che vi sia un segnale stabile con pulsatilità moderata.
  5. Fissare con attenzione la sonda con punti di sutura (Figura 1D) e utilizzare l'imbottitura per evitare lussazioni o attorcigliamenti della sonda.
  6. Per il posizionamento percutaneo del drenaggio del liquido cerebrospinale per misurare e controllare la pressione cerebrospinale, identificare il livello di L 4/5 o L 5/6, perforare la pelle e lo spazio sottocutaneo con l'ago introduttore e rimuovere l'ago intarsio.
  7. Posizionare una siringa riempita di soluzione salina sull'ago e introdurre con attenzione l'ago con una pressione costante sulla siringa riempita di liquido.
  8. Una volta che una perdita di resistenza è sentita come prova della posizione epidurale, reintrodurre l'ago dell'intarsio e introdurre l'ago 2-3 mm ulteriormente per perforare la dura madre e rimuovere l'ago dell'intarsio.
  9. Verificare la posizione intratecale gocciolando rapidamente di liquido trasparente. Introdurre il drenaggio fino a 20 cm di profondità, collegare l'adattatore Luer-lock e verificare la posizione mediante un'attenta aspirazione del liquore.
  10. Fissare con cura il drenaggio con punti di sutura e collegarlo al sistema di drenaggio del liquido cerebrospinale.
  11. Esporre il cranio dietro l'orecchio sinistro ed eseguire con attenzione una trapanazione del foro di perforazione della pelle utilizzando un attacco da trapano da 6 mm.
  12. Introdurre una seconda sonda doppler laser direttamente nel cervello. Fissare con attenzione la sonda con punti di sutura e testare la qualità del segnale collegandosi a hardware e software designati. Ancora una volta, assicurarsi che vi sia un segnale stabile con pulsatilità moderata.
  13. Scollegare tutte le sonde, posizionare con cura l'animale in posizione supina, assicurando la posizione della sonda non influenzata. Assicurarsi che almeno 4-5 ricercatori eseguano questa manovra.
  14. Ricollegare le sonde e ricontrollare la qualità del segnale.
  15. Collegare i canali di uscita dell'hardware laser-Doppler all'amplificatore e all'hardware e al software di acquisizione sincronica per registrare ulteriormente il flusso laser/Doppler contemporaneamente ai segnali macroemodinamici.
  16. Calibrare il flusso come da unità (PU) con calibrazione a 2 punti.
    1. Premere Invio per aprire il menu e selezionare l'impostazione di uscita analogica.
    2. Utilizzare il fattore di conversione visualizzato (5,0 V = 1000 PU) per calibrare Flux con calibrazione a 2 punti da utilizzare con il software di acquisizione sincronica.
    3. Selezionare Ritorna per tornare al menu precedente e selezionare Misurazione per continuare con la misurazione.
    4. Aprire il software di acquisizione sincronica. Selezionare zero tutti gli ingressi dal menu Setup. Collegare tutti gli ingressi con i dispositivi e le sonde utilizzati.
    5. Eseguire la calibrazione a 2 punti per Flux facendo clic sul menu a discesa del canale Flux. Selezionare la calibrazione a 2 punti. Impostare la conversione delle unità su on e selezionare BPU come unità. Per il punto 1, impostare 0 V su 0 BPU. Per il punto 2, impostare 5.0 V su 1000 BPU. Selezionare Imposta unità per tutti e nuovi dati. Premere OK per chiudere il menu.
  17. Avviare il drenaggio continuo del liquido cerebrospinale con una pressione target di 10 mmHg e un volume di drenaggio di 20 mL·h-1.

3. Posizionamento del catetere

  1. Esporre entrambe le arterie femorali.
  2. Ligatare la parte distale dell'arteria femorale destra, occludere temporaneamente il lume prossimale dell'arteria usando un anello vascolare, eseguire un taglio di 2 mm del vaso usando una forbice di Potts e introdurre il filo guida.
  3. Introdurre ulteriormente il filo guida, garantendo un inserimento privo di resistenza ed evitando qualsiasi attorcigliamento del filo; introdurre il catetere sul filo.
  4. Fissare il catetere con punti di sutura.
  5. Garantire la corretta posizione mediante aspirazione del sangue arterioso verificato con analisi dei gas ematici e misurazione del segnale arterioso dopo una corretta connessione alla pressione sanguigna e monitoraggio trans-cardiopolmonare hard- e software.
  6. Posizionare una sonda di flusso da 5 mm sull'arteria femorale sinistra e testare la qualità del segnale collegandosi al flussometro.
  7. Chiudere entrambi gli inguini con punti di sutura.
  8. Esporre l'arteria carotide destra e la vena giugulare interna destra per il posizionamento di 8 guaine introduttrici Fr.
  9. Per il posizionamento del catetere, procedere nello stesso modo descritto ai punti 3.2-3.4.
  10. Collegare il lume laterale della guaina introduttrice dell'arteria carotidea al monitoraggio della pressione di base e all'hardware di termodiluizione polmonare per la misurazione della pressione arteriosa.
  11. Introdurre un catetere a punta di pressione nell'aorta ascendente e verificare la posizione collegandosi all'amplificatore e all'acquisizione sincronica hard e software.
  12. Posizionare un catetere dell'arteria polmonare Swan-Ganz attraverso la guaina venosa nell'arteria polmonare gonfiando il palloncino con aria a 20 cm di profondità e inserendolo delicatamente fino a quando non si vede una pressione del cuneo nella curva emodinamica. Sgonfiare il palloncino e tirare indietro il catetere di 2 cm. Garantire una qualità del segnale soddisfacente della pressione dell'arteria polmonare. Collegare i termistori al monitoraggio della pressione di base e all'hardware di termodiluizione polmonare.
  13. Utilizzare la guida ecografica per il posizionamento percutaneo di un catetere venoso centrale da 12 Fr. 5 Lumen per la somministrazione del farmaco e la misurazione della pressione venosa centrale nella vena giugulare destra esterna. Utilizzare l'approccio a 6 fasi per il posizionamento ecografico38
  14. Collegare il lume distale del catetere alla pressione sanguigna e al software di monitoraggio trans-cardiopolmonare. Passare tutti i farmaci e le infusioni al catetere venoso centrale. Utilizzare un lume diverso per analgesici, fluidi e catecolamine e risparmiare il grande lume per la somministrazione di colloidi durante le fasi di carico del volume.

4. Preparazione chirurgica

  1. Eseguire una mini-laparotomia, mobilitare la vescica, inserire un catetere foley per il drenaggio delle urine, gonfiare il palloncino con soluzione salina e fissare il catetere con suture a sacca.
  2. Collegare il catetere a una sacca per la raccolta delle urine che mostra la quantità di urina in ml.
  3. Aumentare il FiO2 a 1,0 e ri-somministrare 0,1 mg·kg-1 pancuronio per via endovenosa.
  4. Eseguire una sternotomia mediana utilizzando l'elettrocauterizzazione per la preparazione fino allo sterno. Sezionare delicatamente lo sterno dal tessuto circostante. Eseguire il posizionamento retrosternale di un impacco per prevenire lesioni.
  5. Interrompere la ventilazione e dividere l'osso con una sega oscillante. Continuare la ventilazione e ridurre FiO2 a 0,3. Utilizzare l'elettrocauterizzazione per ridurre il sanguinamento e sigillare lo sterno con cera ossea.
  6. Mobilitare con attenzione l'apice del polmone sinistro e dividere la parte laterale sinistra del diaframma per facilitare l'esposizione chirurgica.
  7. Esporre l'aorta discendente prossimale al tronco celiaco mediante delicata retrazione del polmone sinistro, garantendo una ventilazione indisturbata ed evitando traumi al polmone sinistro (Figura 2A) e dividere il tessuto circostante (Figura 2B). Somministrare 7 mL·kg-1 colloide idrossietilico-amido se è necessaria la stabilizzazione emodinamica.
  8. Posizionare una presa intorno all'aorta discendente per garantire una corretta esposizione (Figura 2C).
  9. Collegare una sonda di flusso attorno all'aorta toracica discendente (Figura 2D). Garantire la corretta qualità del segnale collegandosi al modulo di flusso e all'acquisizione sincronica hard e software. Utilizzare il gel di contatto per migliorare la qualità del segnale, se necessario.
  10. Attaccare un anello del vaso attorno all'aorta discendente, distale alla sonda di flusso per contrassegnare l'area di serraggio della croce aortica.

5. Valutazione e acquisizione dati

  1. Azzerare tutti i cateteri e i cateteri di livello utilizzando linee piene di liquido poste al giusto livello atriale.
  2. Posizionare gli elettrodi ECG ad ago e collegarli all'acquisizione sincronica rigida e al software.
  3. La valutazione della termodiluizione trans-cardiopolmonare e le misurazioni del flusso aortico e della pressione sono state precedentemente descritte 34.
  4. Per la misurazione della gittata cardiaca utilizzando la termodiluizione dell'arteria polmonare, eseguire 3 iniezioni con 10 ml di soluzione salina fredda e notare il valore medio visualizzato dall'hardware di monitoraggio di base.
  5. Avviare il software laser-Doppler semplicemente premendo Starte impostare un segno per ogni fase di misurazione etichettando attentamente i passaggi da M0 a M5.

6. Protocollo sperimentale

  1. Eseguire misurazioni di base (M0).
  2. Eseguire l'ottimizzazione emodinamica utilizzando fasi di carico volumetrico di 7 mL·kg-1 colloide idrossietilico-amido. Eseguire ogni fase di caricamento del volume nell'arco di 5 minuti utilizzando infusioni pressurizzate. Dopo aver completato ogni fase di caricamento del volume, consentire 5 minuti per l'equilibrio. Iniziare il carico di volume fino a quando l'aumento della gittata cardiaca è <15%.
  3. Ripetere le misurazioni (M1) dopo il completamento dell'ottimizzazione emodinamica.
  4. Indurre ischemia/riperfusione per un totale di 48 min di cross-clamping aortico sopra-celiaco posizionando un morsetto aortico sulla zona segnata.
  5. Applicare il serraggio aortico in ordine crescente di intervalli di 1, 2, 5, 10 e 30 minuti per migliorare la sopravvivenza degli animali durante il protocollo di studio.
  6. Continuare il cross-clamping aortico dopo ogni intervallo dopo un massimo di 5 minuti o dopo la normalizzazione del flusso dell'arteria femorale.
  7. Eseguire l'occlusione manuale dell'afflusso della vena cava inferiore per prevenire aumenti della pressione sanguigna di > 100 mmHg di pressione arteriosa media.
  8. Somministrare iniezioni in bolo di noradrenalina o epinefrina durante la fase di serraggio, se necessario, per prevenire diminuzioni della pressione arteriosa media inferiore a 40 mmHg.
  9. Ripetere le misurazioni alla fine dell'intervallo di serraggio di 30 minuti prima della riperfusione (M2).
  10. Aprire gradualmente il morsetto per garantire la stabilità emodinamica. Chiudere il morsetto se la pressione sanguigna scende troppo rapidamente e consentire la stabilizzazione.
  11. Somministrare 7 mL·kg-1 di colloidi idrossietil-amido e ulteriori iniezioni in bolo di 10-20 μg di noradrenalina e/o epinefrina per la stabilizzazione. Somministrare 2 ml kg-1 di bicarbonato di sodio all'8,4% se il pH scende al di sotto di 7,1. Garantire una corretta regolazione della frequenza respiratoria per garantire normocapnia.
  12. Ripetere le misurazioni 1 ora dopo la riperfusione (M3).
  13. Ripetere l'ottimizzazione emodinamica come descritto al punto 6.2 e ripetere le misurazioni (M4).
  14. Eseguire le misurazioni finali 4,5 ore dopo l'induzione di ischemia/riperfusione (M5).

7. Eutanasia

  1. Somministrare 40 mmol di cloruro di potassio per via endovenosa per l'eutanasia per indurre fibrillazione ventricolare e asistolia.
  2. Terminare la ventilazione e rimuovere tutti i cateteri.

8. Prelievo di organi

  1. Posizionare l'animale in posizione prona e rimuovere le sonde ad ago e il drenaggio.
  2. Esporre la colonna vertebrale mediante incisione cutanea e rimozione del tessuto muscolare utilizzando un bisturi e una pinza.
  3. Utilizzare una sega oscillante per dividere il paramediano dell'arco vertebrale su entrambi i lati e rimuovere la parte dorsale dell'osso vertebrale spostando attentamente il processo spinoso lateralmente per allentare le connessioni rimanenti.
  4. Utilizzare una pinza per sollevare con cura il midollo spinale dalle estremità caudali a quelle craniche e utilizzare un bisturi per tagliare i nervi spinali per rimuovere il midollo spinale.
  5. Conservare il midollo spinale in formalina al 4% fino a un ulteriore utilizzo per la valutazione istopatologica o la quantificazione della microsfera.

9. Analisi statistica

  1. Utilizzare software statistico.
  2. Garantire la distribuzione normale mediante l'ispezione di istogrammi e variabili di trasformazione del log, se necessario.
  3. Sottoporre le variabili dipendenti - flusso del midollo spinale, gittata cardiaca, frequenza cardiaca, volume dell'ictus, pressione arteriosa sistolica, pressione arteriosa media, pressione arteriosa diastolica, pressione venosa centrale, resistenza vascolare sistemica - nonché microperfusione del midollo spinale superiore e inferiore valutata con microsfere fluorescenti se lo si desidera - ad analisi di modelli misti lineari generali, utilizzando la routine GENLINMIXED per dati continui con una funzione di collegamento di identità.
  4. Utilizzare le regolazioni di base.
  5. Specificate modelli con effetti fissi per la linea di base e il punto di misurazione variabili. Considerare il punto di misurazione come misure ripetute all'interno degli animali.
  6. Riportare i valori p degli effetti fissi per il punto di misurazione per ciascun parametro.
  7. Per l'analisi della microsfera fluorescente del midollo spinale, utilizzare la regione (midollo spinale inferiore, midollo spinale superiore) in aggiunta come effetto fisso e interazione tra regione e punto di misurazione per valutare le interazioni tra regioni e punto di misurazione e riportare i valori p di effetti fissi anche per l'interazione.
  8. Calcola le medie marginali aggiustate al basale con intervallo di confidenza (CI) del 95% per tutte le variabili dipendenti nei punti di misurazione M1-M5, seguite da confronti a coppie tramite test di differenza meno significativi.
  9. Esprimere le variabili come media (IC 95%). Esprimere il peso dell'animale come deviazione media ± standard.
  10. Presentare valori p non rettificati.

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Risultati

Tutti e sei gli animali sono sopravvissuti fino al completamento del protocollo. Il peso degli animali era di 48,2 ± 2,9 kg; cinque animali erano maschi e un animale era femmina. L'inserimento della sonda dell'ago del midollo spinale e la misurazione del flusso del midollo spinale erano fattibili in tutti gli animali.

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Discussione

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Dichiarazioni

Constantin J.C. Trepte ha ricevuto un premio onorario per le conferenze di Maquet. Tutti gli altri autori non dichiarano conflitti di interesse. Questo studio è stato supportato dalla European Society of Anaesthesiology Young Investigator Start-Up Grant 2018.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare Lena Brix, V.M.D, Institute of Animal Research, Hannover Medical School, così come la signora Jutta Dammann, Facility of Research Animal Care, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Germania, per aver fornito cure pre e perioperatorie agli animali e la loro assistenza tecnica sulla manipolazione degli animali. Gli autori desiderano inoltre ringraziare il Dr. Daniel Manzoni, Dipartimento di Chirurgia Vascolare, Hôpital Kirchberg, Lussemburgo, per la sua assistenza tecnica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Misuratore di portata CardioMedMedistim AS, Oslo, NorvegiaCM4000per sonda di flusso dell'arteria femorale
Sonda di flusso CardioMed, 5mmMedistim AS, Oslo, NorvegiaSonda di flusso dell'arteria femorale
Sonda di COnfidence, Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USAMA16PAUFlow-Probe Aorta
16 mm liner
DIVA Sevoflurane VaporDrä ger Medical, Lü beck, GermaniaVapor
Hotline Livello 1 ScaldaliquidiSmiths Medical Germany GmbH, Grasbrunn, GermaniaHL-90-DE-230Scaldaliquidi
Infinity DeltaDrä ger Medical, Lü beck, GermaniaHardware di monitoraggio di base
Infinity HemoDrä ger Medical, Lü beck, GermaniaHardware per il monitoraggio della pressione di base e la termodiluizione polmonare
LabChart ProADInstruments Ltd., Oxford, Regno Unitov8.1.16Software sincronico per laser-Doppler, pressione sanguigna, ECG e acquisizione del flusso sanguigno
LiquoGuard 7Mö ller Medical GmbH, Fulda, Germaniadrenaggio del liquido cerebrospinale
Catetere a pressione con micropunta Millar (5F, singolo, curvo, 120 cm, PU/WD)ADInstruments Ltd., Oxford, Regno UnitoCatetere a punta di pressioneSPR-350
Orta VMS LDFMoor Instruments, Devon, Regno UnitoDesignated Laser-Doppler
Hardware moor VMS Research SoftwareMoor Instruments, Devon, Regno UnitoModulo di flusso perivascolare software Laser-Doppler designato
Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USATS 420Modulo di flusso per sonda di flusso Aorta
PiCCO 2, versione scientificaGetinge AB, Gö teborg, Sveziav. 6.0Monitoraggio della pressione sanguigna e transcardiopolmonare Hard- e software
PiCCO 5 Fr. 20cmGetinge AB, Gö teborg, SveziaLinea arteriosa con punta a termistore 
PowerLabADInstruments Ltd., Oxford, Regno UnitoPL 3516Laser-Doppler sincronico, pressione sanguigna, ECG e acquisizione del flusso sanguigno
Hardware QuadBridgeAmpADInstruments Ltd., Oxford, Regno UnitoFE 224Amplificatore a ponte a quattro canali per laser-Doppler e acquisizione invasiva della pressione sanguigna
SilverlineSpiegelberg, Amburgo, GermaniaELD33.010.02Drenaggio
del liquido cerebrospinalePacchetto software statistico SPSS IBM SPSS Statistics Inc., Armonk, New York, USAv. 27Software
Sistema di riscaldamento TwinwarmMoeck & Moeck GmbH, Amburgo, Germania12TW921DESistema di riscaldamento
Coperta riscaldante universale IIMoeck & Moeck GmbH, Amburgo, GermaniaCoperta riscaldante906
VP 3 Sonda, lunghezza 8 mm (prodotta singolarmente)moor Instruments, Devon, Regno UnitoSonda laser-Doppler
ZeusDrä ger Medical, Lü beck, GermaniaMacchina per anestesia
Misuratore di portata PS100051 Sistema di statistico

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