Method Article

Adattamenti specifici della miosina dei saggi di motilità basati sulla microscopia a fluorescenza in vitro

DOI:

10.3791/62180

⸱

February 4th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui viene presentata una procedura per esprimere e purificare la miosina 5a seguita da una discussione sulla sua caratterizzazione, utilizzando sia l'ensemble che la singola molecola in saggi basati sulla microscopia a fluorescenza in vitro, e come questi metodi possono essere modificati per la caratterizzazione della miosina 2b non a forma di molecola.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le proteine della miosina si legano e interagiscono con l'actina filamentosa (F-actina) e si trovano negli organismi attraverso l'albero filogenetico. La loro struttura e le proprietà enzimatiche sono adattate alla particolare funzione che eseguono nelle cellule. La miosina 5a cammina processivamente sulla F-actina per trasportare melanosomi e vescicole nelle cellule. Al contrario, la miosina 2b nonmuscolare funziona come un filamento bipolare contenente circa 30 molecole. Sposta F-actina di polarità opposta verso il centro del filamento, dove le molecole di miosina lavorano in modo asincrono per legare l'actina, impartire un colpo di potenza e dissociarsi prima di ripetere il ciclo. La miosina 2b nonmuscolare, insieme alle sue altre isoforme di miosina 2 non muscolari, ha ruoli che includono l'adesione cellulare, la citochinesi e il mantenimento della tensione. La meccanochimica delle miosine può essere studiata eseguendo saggi di motilità in vitro utilizzando proteine purificate. Nel test del filamento di actina planante, le miosine sono legate a una superficie di copertura del microscopio e traslocano F-actina etichettata fluorescentemente, che può essere tracciata. Nel test di motilità a singola molecola/insieme, tuttavia, la F-actina è legata a un coverslip e si osserva il movimento di molecole di miosina etichettate fluorescentmente sulla F-actina. In questo rapporto, viene delineata la purificazione della miosina 5a ricombinante da cellule Sf9 utilizzando la cromatografia di affinità. Successivamente, delineiamo due saggi basati sulla microscopia a fluorescenza: il test del filamento di actina planante e il test di motilità invertita. Da questi saggi, parametri come le velocità di traslocazione dell'actina e le lunghezze e le velocità di esecuzione delle singole molecole possono essere estratti utilizzando il software di analisi delle immagini. Queste tecniche possono anche essere applicate per studiare il movimento di singoli filamenti delle isoforme di miosina 2 non-movimento, qui discusse nel contesto della miosina 2b non-muscolare. Questo flusso di lavoro rappresenta un protocollo e un insieme di strumenti quantitativi che possono essere utilizzati per studiare la dinamica della singola molecola e dell'insieme delle miosine nonmuscolari.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le miosine sono proteine motorie che esercitano forza sui filamenti di actina utilizzando l'energia derivata dall'idrolisi dell'adenosina trifosfato (ATP)1. Le miosine contengono un dominio della testa, del collo e della coda. Il dominio della testa contiene la regione di legame con l'actina e il sito di legame e idrolisi dell'ATP. I domini del collo sono composti da motivi QI, che si legano a catene leggere, calmodulina o proteine simili a calmoduline2,3. La regione della coda ha diverse funzioni specifiche per ogni classe di miosine, tra cui, ma non solo, la dimerizzazione di due catene pesanti, il legame delle molecole di carico e la regolazione della miosina tramite interazioni autoinibitorie con i domini della testa1.

Le proprietà mobili della miosina variano notevolmente tra le classi. Alcune di queste proprietà includono il rapporto di servizio (la frazione del ciclo meccanico della miosina in cui la miosina è legata all'actina) e la processività (la capacità di un motore di fare più passi sul suo binario prima del distacco)4. Le oltre 40 classi di miosine sono state determinate sulla base di analisi di sequenza5,6,7,8. Le miosine di classe 2 sono classificate come "convenzionali" poiché sono state le prime ad essere studiate; tutte le altre classi di miosine sono, quindi, classificate come "non convenzionali".

La miosina 5a (M5a) è una miosina di classe 5 ed è un motore processivo, il che significa che può fare più passi lungo l'actina prima di dissociarsi. Ha un elevato rapporto di servizio, che indica che trascorre gran parte del suo ciclo meccanico legato all'actina9,10,11,12,13,14. In comune con altre miosine, la catena pesante contiene un dominio motorio N-terminale che include sia un sito di idrolisi dell'actina che un sito di idrolisi dell'ATP seguito da una regione del collo che funge da braccio a leva, con sei motivi QI che si legano alle catene leggere essenziali (ELC) e alla calmodulina (CaM)15. La regione della coda contiene α bobine arrotolate elicoidali, che dimerizzano la molecola, seguite da una regione di coda globulare per legare il carico. La sua cinetica riflette il suo coinvolgimento nel trasporto dei melanosomi nei melanociti e del reticolo endoplasmatico nei neuroni di Purkinje16,17. M5a è considerato il prototipo del motore di trasporto merci18.

Le miosine di classe 2, o le miosine convenzionali, includono le miosine che alimentano la contrazione della muscolatura scheletrica, cardiaca e liscia oltre alle isoforme di miosina 2 (NM2) non muscolare, NM2a, 2b e 2c19. Le isoforme NM2 si trovano nel citoplasma di tutte le cellule e hanno ruoli condivisi nella citochinesi, nell'adesione, nella morfogenesi tissutale e nella migrazione cellulare19,20,21,22. Questo articolo discute i protocolli convenzionali della miosina nel contesto della miosina 2b nonmuscolare (NM2b)23. NM2b, rispetto a M5a, ha un basso rapporto di servizio ed è enzimaticamente più lento con un Vmax di 0,2 s-123 rispetto al Vmax di M5a di ≈18 s-124. In particolare, i costrutti NM2b troncati con due teste non si muovono facilmente processivamente sull'actina; piuttosto, ogni incontro con l'actina si traduce in un colpo di potenza seguito dalla dissociazione della molecola25.

NM2b contiene due catene pesanti di miosina, ciascuna con un dominio della testa globulare, un braccio a leva (con un ELC e una catena leggera regolatoria (RLC)) e un dominio di asta / coda a spirale α-elicoidale, lungo circa 1.100 amminoacidi, che dimerizza queste due catene pesanti. L'attività enzimatica e lo stato strutturale di NM2b sono regolati dalla fosforilazione del RLC23. NM2b non fosforilato, in presenza di ATP e forze ioniche fisiologiche (circa 150 mM di sale), adotta una conformazione compatta in cui le due teste rendono partecipe un'interazione asimmetrica e la coda si ripiega indietro sopra le teste in due punti23. In questo stato, la miosina non interagisce fortemente con l'actina e ha un'attività enzimatica molto bassa. Dopo la fosforilazione RLC da parte della miosina chinasi a catena leggera calmodulina-dipendente (MLCK) o chinasi proteica associata a Rho, la molecola si estende e si associa ad altre miosine attraverso la regione della coda per formare filamenti bipolari di circa 30 molecole di miosina23. La già citata fosforilazione del RLC porta anche ad un aumento dell'attività ATPasi attivata da actina di NM2b di circa quattro volte26,27,28. Questa disposizione del filamento bipolare, con molti motori a miosina ad ogni estremità, è ottimizzata per ruoli nella contrazione e nel mantenimento della tensione, dove i filamenti di actina con polarità opposte possono essere spostati l'uno rispetto all'altro23,29. Di conseguenza, NM2b ha dimostrato di agire come un insieme di motori quando interagisce con l'actina. Il gran numero di motori all'interno di questo filamento consente ai filamenti NM2b di muoversi processivamente sui filamenti di actina, rendendo possibile la processività del filamento in vitro per caratterizzare29.

Mentre sono stati fatti progressi nella comprensione del ruolo delle miosine nella cellula, è necessario comprendere le loro caratteristiche individuali a livello proteico. Per comprendere le interazioni dell'actomiosina a un semplice livello di interazione proteina-proteina, piuttosto che all'interno di una cellula, possiamo esprimere e purificare le miosine ricombinanti per l'uso in studi in vitro. I risultati di tali studi informano quindi i meccanobiologi sulle proprietà biofisiche di specifiche miosine che alla fine guidano processi cellulari complessi12,13,14,25,29. Tipicamente, questo si ottiene aggiungendo un tag di affinità a un costrutto di miosina a lunghezza intera o troncato e purificando tramite cromatografia di affinità29,30,31. Inoltre, il costrutto può essere progettato per includere un fluoroforo geneticamente codificabile o un tag per l'etichettatura delle proteine con un fluoroforo sintetico. Aggiungendo una tale etichetta fluorescente, è possibile eseguire studi di imaging a singola molecola per osservare la meccanica e la cinetica della miosina.

Dopo la purificazione, la miosina può essere caratterizzata in diversi modi. L'attività dell'ATPasi può essere misurata con metodi colorimetrici, fornendo informazioni sul consumo energetico complessivo e sull'affinità con l'actina del motore in diverse condizioni32. Per conoscere la meccanochimica della sua motilità, sono necessari ulteriori esperimenti. Questo documento descrive in dettaglio due metodi in vitro basati sulla microscopia a fluorescenza che possono essere utilizzati per caratterizzare le proprietà mobili di una proteina della miosina purificata.

Il primo di questi metodi è il test del filamento di actina planante, che può essere utilizzato per studiare quantitativamente le proprietà dell'insieme dei motori della miosina, nonché per studiare qualitativamente la qualità di un lotto di proteinapurificata 33. Sebbene questo documento discuta l'uso della microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per questo test, questi esperimenti possono essere eseguiti efficacemente utilizzando un microscopio a fluorescenza ad ampio campo dotato di una fotocamera digitale, comunemente presente in molti laboratori34. In questo test, uno strato saturante di motori a miosina è attaccato a un coverslip. Ciò può essere realizzato utilizzando nitrocellulosa, anticorpi, membrane, superfici derivatizzate da SiO2(come il trimetilorilclorosilano), tra gli altri29,33,35,36,37,38. I filamenti di actina etichettati fluorescentemente vengono passati attraverso la camera di copertura, su cui l'actina si lega alla miosina attaccata alla superficie. Dopo l'aggiunta di ATP (e chinasi nello studio di NM2), la camera viene emersa per osservare la traslocazione dei filamenti di actina da parte delle miosine legate alla superficie. Il software di tracciamento può essere utilizzato per correlare la velocità e la lunghezza di ciascun filamento di actina planante. Il software di analisi può anche fornire una misura del numero di filamenti di actina sia in movimento che stazionari, che può essere utile per determinare la qualità di un determinato preparato di miosina. La proporzione di filamenti in stallo può anche essere intenzionalmente modulata mediante il legame superficiale dell'actina ad altre proteine e misurata per determinare la dipendenza dal carico della miosina39. Poiché ogni filamento di actina può essere spinto da un gran numero di motori disponibili, questo saggio è molto riproducibile, con la velocità finale misurata che è robusta a perturbazioni come alterazioni nella concentrazione di miosina iniziale o la presenza di fattori aggiuntivi nella soluzione. Ciò significa che può essere facilmente modificato per studiare l'attività della miosina in diverse condizioni, come fosforilazione alterata, temperatura, resistenza ionica, viscosità della soluzione e gli effetti del carico indotto dai ladri superficiali. Sebbene fattori come le "teste morte" di miosina fortemente leganti incapaci di idrolisi dell'ATP possano causare filamenti di actina in stallo, esistono diversi metodi per mitigare tali problemi e consentire misurazioni accurate. Le proprietà cinetiche della miosina variano notevolmente tra le classi e, a seconda della miosina specifica utilizzata, la velocità di scorrimento del filamento di actina in questo test può variare da meno di 20 nm/ s (miosina 9)40,41e fino a 60.000 nm / s(characean miosina 11)42.

Il secondo saggio inverte la geometria del saggio del filamento di actina planante12. Qui, i filamenti di actina sono attaccati alla superficie del coverslip e viene visualizzato il movimento di singole molecole di M5a o di singoli filamenti bipolari di NM2b. Questo test può essere utilizzato per quantificare le lunghezze e le velocità di corsa di singole molecole di miosina o filamenti su actina. Un coverslip è rivestito con un composto chimico che blocca il legame non specifico e contemporaneamente funzionalizza la superficie, come la biotina-polietilenglicole (biotina-PEG). L'aggiunta di derivati avidici modificati innesca quindi la superficie e l'actina biotinilata viene fatta passare attraverso la camera, risultando in uno strato di F-actina stabilmente legato al fondo della camera. Infine, la miosina attivata ed etichettata fluorescentemente (tipicamente 1-100 nM) viene fatto scorrere attraverso la camera, che viene quindi cioè cioè per osservare il movimento della miosina sui filamenti stazionari di actina.

Queste modalità rappresentano metodi veloci e riproducibili che possono essere impiegati per esaminare la dinamica delle miosine non muscolari e muscolari. Questo rapporto delinea le procedure per purificare e caratterizzare sia M5a che NM2b, che rappresentano rispettivamente miosine non convenzionali e convenzionali. Questo è seguito da una discussione di alcuni degli adattamenti specifici della miosina, che possono essere eseguiti per ottenere una cattura di successo del movimento nei due tipi di test.

Espressione e biologia molecolare
Il cDNA per la miosina di interesse deve essere clonato su un vettore pFastBac1 modificato che codifica per un tag FLAG-terminale C (DYKDDDDK) se esprime M5a-HMM, o un tag FLAG N-terminale se esprime la molecola a lunghezza intera di NM2b23,43,44,45,46. I tag FLAG C-terminali su NM2b provocano un'affinità indebolita della proteina per la colonna di affinità FLAG. Al contrario, la proteina N-terminale contrassegnata con FLAG di solito si lega bene alla colonna di affinità FLAG23. La proteina N-terminalemente marcata mantiene l'attività enzimatica, l'attività meccanica e la regolazione dipendente dalla fosforilazione23.

In questo articolo, è stato utilizzato un costrutto di meromiosina pesante M5a (HMM) con un GFP tra il tag FLAG e il C-terminus della catena pesante di miosina. Si noti che, a differenza di NM2b, M5a-HMM può essere taggato e purificato con tag FLAG N o C-terminal e in entrambi i casi il costrutto risultante sarà attivo. La catena pesante M5a è stata troncata all'amminoacido 1090 e contiene un linker di tre amminoacidi (GCG) tra la GFP e la regione a spirale dell'M5a47. Non è stato aggiunto alcun linker aggiuntivo tra il GFP e il tag FLAG. M5a-HMM è stato co-espresso con calmodulin. Il costrutto NM2b umano a lunghezza intera è stato co-espresso con ELC e RLC. L'N-termini del RLC è stato fuso con un GFP tramite un linker di cinque aminoacidi (SGLRS). Direttamente attaccato al flag-tag c'era un HaloTag. Tra l'HaloTag e l'N-terminus della catena pesante della miosina c'era un linker fatto di due amminoacidi (AS).

Entrambi i preparati di miosina sono stati purificati da un litro di coltura cellulare Sf9 infettata da baculovirus ad una densità di circa 2 x 106 cellule / mL. I volumi del baculovirus per ciascuna subunità dipendevano dalla molteplicità di infezione del virus determinata dalle istruzioni del produttore. Nel caso di M5a, le cellule sono state co-infettate con due diversi baculovirus: uno per calmodulin e uno per M5a catena pesante. Nel caso dell'NM2b, le cellule sono state co-infettate con tre diversi virus: uno per eLC, uno per RLC e uno per la catena pesante NM2b. Per i laboratori che lavorano con una varietà di miosine (o altre proteine multi-complesse), questo approccio è efficiente poiché consente molte combinazioni di catene pesanti e leggere e catene leggere comunemente usate come la calmodulina possono essere co-trasfettate con molte diverse catene pesanti di miosina. Tutto il lavoro cellulare è stato completato in un armadio di biosicurezza con una tecnica sterile adeguata per evitare la contaminazione.

Per l'espressione sia di M5a che di NM2b, le cellule Sf9 che producono le miosine ricombinanti sono state raccolte 2-3 giorni dopo l'infezione, tramite centrifugazione, e conservate a -80 °C. I pellet cellulari sono stati ottenuti centrifugando le cellule Sf9 co-infette a 4 °C per 30 minuti a 2.800 x g. Il processo di purificazione delle proteine è dettagliato di seguito.

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Protocol

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1. Purificazione delle proteine

  1. Lisi cellulare ed estrazione di proteine
    1. Preparare un buffer di estrazione 1,5x basato sulla tabella 1. Filtrare e conservare a 4 °C.
    2. Iniziare a scongelare i pellet cellulari sul ghiaccio. Mentre i pellet si scongelano, integrare 100 mL di tampone di estrazione con 1,2 mM di ditiotrireitolo (DTT), 5 μg / mL leupeptina, 0,5 μM fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) e due compresse inibitori della proteasi. Continua sul ghiaccio.
    3. Una volta che il pellet si è scongelato, aggiungere 1 mL del tampone di estrazione integrato per 10 mL di coltura cellulare. Ad esempio, se i pellet cellulari sono stati formati da 500 mL di coltura cellulare, aggiungere 50 mL di tampone di estrazione integrato al pellet.
    4. Sonicare i pellet cellulari mantenendoli sul ghiaccio. Per ogni pellet, utilizzare le seguenti condizioni: 5 s ON, 5 s OFF, durata di 5 min, potenza 4-5.
    5. Raccogliere tutto il l'omogeneizzato di lisi in un becher e aggiungere ATP (soluzione stock 0,1 M; pH 7,0) in modo tale che la concentrazione finale di ATP sia di 1 mM. Mescolare per 15 minuti in una stanza fredda. L'ATP dissocia la miosina attiva dall'actina, permettendole di separarla nella successiva fase di centrifugazione. È quindi essenziale procedere immediatamente al passaggio successivo per ridurre al minimo la possibilità di esaurimento dell'ATP e rilegamento all'actina.
    6. Centrifugare i lasati a 48.000 x g per 1 ora a 4 °C. Mentre ciò si verifica, iniziare a lavare 1-5 ml di un impasto al 50% di resina di affinità Anti-FLAG (per un pellet formato da 1 L di cellule) con 100 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), secondo le istruzioni del produttore. Ad esempio, per 5 ml di resina, lavare 10 ml di un liquame al 50%. Nella fase finale di lavaggio, risusciendi la resina con 1-5 ml di PBS con un volume sufficiente per creare un impasto al 50%.
    7. Dopo la centrifugazione del lisato, combinare il surnatante con il liquame di resina lavato e dondolare delicatamente nella cella frigorifera per 1-4 ore. Durante l'attesa, creare i buffer descritti nella Tabella 1 e tenerli sul ghiaccio.
  2. Preparazione della purificazione dell'affinità FLAG
    1. Centrifugare la soluzione nella fase 1.7 a 500 x g per 5 min a 4 °C. La resina sarà imballata nella parte inferiore del tubo. Senza disturbare la resina, rimuovere il surnatante.
    2. Spese di sospensione della resina in 50 mL di Tampone A come descritto nella Tabella 1 e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Senza disturbare la resina, rimuovere il surnatante.
    3. Spese di sospensione della resina in 50 mL di Tampone B come descritto nella Tabella 1 e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Ripetere ancora una volta questo passaggio e risuspenare la resina in 20 ml di tampone B. Quindi, mescolare accuratamente la resina e il tampone invertendo delicatamente il tubo a mano circa 10 volte.
  3. Eluizione e concentrazione delle proteine
    1. Preparare 30 ml di tampone di eluizione come descritto nella tabella 1 e lasciarlo raffreddare sul ghiaccio.
    2. Impostare la colonna di eluizione in una cella frigorifera. Versare delicatamente il liquame di resina nella colonna. Lavare la colonna con 1-2 volumi di colonna di Buffer B come pacchi di resina sul fondo, assicurandosi che la resina non si asciughi.
    3. Flusso 1 mL del tampone di eluizione attraverso la resina e raccogliere il flusso attraverso un tubo da 1,5 ml. Ripetere in modo tale che vengano raccolte frazioni 12, 1 ml.
    4. A questo punto, eseguire un test di Bradford grezzo sulle frazioni per determinare qualitativamente quali frazioni sono le più concentrate48. Su una fila di una piastra a 96 pozzetti, pipetta 60 μL 1x reagente Bradford. Quando le frazioni vengono raccolte, mescolare 20 μL di ciascuna frazione per pozzo. Una colorazione blu più scura indica le frazioni più concentrate.
    5. In un tubo da 50 ml, raccogliere la proteina rimanente convogliando delicatamente il tampone di eluizione rimanente attraverso la colonna, per rilasciare l'eventuale miosina rimanente legata alla resina nel flusso della colonna. Questo flusso sarà concentrato nella fase successiva. Assicurarsi che la resina venga quindi rigenerata per il riutilizzo e conservata secondo le istruzioni del produttore.
    6. Raggruppate le tre frazioni più concentrate e concentrate ulteriormente il flusso attraverso il tubo da 50 ml e le restanti frazioni da 1 mL utilizzando un tubo di concentrazione da 100.000 MWCO. Caricare il campione in pool sul tubo di concentrazione e centrifugare a 750 x g per 15 minuti a 4 °C e ripetere fino a quando tutte le proteine eluite sono state concentrate a un volume finale di circa 0,5-1 ml.
      NOTA: Questa dimensione dei pori consente la ritenzione delle molecole di miosina, che hanno masse diverse volte il peso molecolare tagliato. Le catene leggere rimangono strettamente legate ai domini motori durante questo periodo di concentrazione, come verificato eseguendo l'elettroforesi su gel SDS-PAGE sul prodotto finale.
  4. Dialisi e congelamento flash
    1. Fare 2 L di tampone di dialisi, come descritto nella tabella 1. Caricare il campione in una sacca o camera per dialisi e dializzarsi durante la notte nella cella frigorifera. Si noti che la composizione dei tamponi di dialisi differisce per NM2b e M5a.
      NOTA: Nel caso di NM2b, lo scopo di questa fase di dialisi è quello di formare filamenti di miosina nel tampone a bassa resistenza ionica. La sedimentazione di questi filamenti fornisce quindi un'ulteriore fase di purificazione e consente la concentrazione del campione. Ci sarà, quindi, un precipitato bianco visibile nella camera di dialisi il giorno successivo. Questi filamenti saranno raccolti per centrifugazione e depolimerizzati nella fase 5.1. Nel caso di M5a-HMM, dopo la dialisi notturna, la proteina sarà sufficientemente pura per l'uso nei test successivi. Ulteriori fasi di purificazione come la filtrazione su gel o la cromatografia a scambio ionico possono essere eseguite, se necessario. Per il recupero di M5a dopo la dialisi, andare al passaggio 5.2.
  5. Recupero della miosina dopo la dialisi
    1. Per NM2b, scaricare con cura l'intero campione dalla sacca o dalla camera di dialisi e centrifugare a 4 °C per 15 minuti a 49.000 x g per raccogliere i filamenti di miosina. Scartare il surnatante e aggiungere in modo incrementale il buffer di stoccaggio al pellet come descritto nella Tabella 1 fino a quando non si è dissolto. Il pipettaggio delicato su e giù aiuta a solubilizzare il pellet. Normalmente, questo non richiede più di 500 μL per tubo. Dopo aver assicurato che il pellet sia completamente disciolto nel tampone di stoccaggio ad alta resistenza ionica, è possibile eseguire un'ulteriore fase di centrifugazione (15 min a 49.000 x g)per rimuovere gli aggregati indesiderati, se necessario, poiché la miosina sarà ora non polymerizzata e rimarrà nel surnatante.
    2. Per M5a-HMM, raccogliere con cura l'intero campione dalla camera di dialisi e centrifugare a 4 °C per 15 minuti a 49.000 x g nel caso in cui siano presenti aggregati indesiderati. Prendi il surnatante.
  6. Determinazione della concentrazione e congelamento flash
    1. Per determinare la concentrazione del prodotto, misurare l'assorbanza utilizzando uno spettrofotometro a lunghezze d'onda 260, 280, 290 e 320 nm. Calcola la concentrazione in mg/mL (cmg/mL) con l'equazione 1, dove A280 rappresenta l'assorbimento a 280 nm e A320 rappresenta l'assorbimento a 320 nm. La concentrazione risultante in mg/mL può essere convertita in μM di molecole di miosina con l'equazione 2, dove M è il peso molecolare dell'intera proteina (comprese le catene pesanti, le catene leggere, i fluorofori e tutti i tag).
      cmg/mL = (A280 - A320) / ε (1)
      molecole μM = 1000cmg/mL/M (2)
      NOTA: se è necessaria una diluizione, deve essere eseguita in un buffer ad alta resistenza ionica. Il coefficiente di estinzione (ε) può essere determinato importando la sequenza aminoacidica della proteina in un programma come ExPASy. La resa tipica per m5a-HMM è di circa 0,5-1 mL di proteina 1-5 mg/mL e per l'INTERA lunghezza NM2b è di 0,5-1 mL di 0,5-2 mg/mL. Il coefficiente di estinzione per l'M5a-HMM utilizzato in questo documento era 0,671. Il coefficiente di estinzione per l'NM2b utilizzato in questo documento era 0,611.
    2. Conservare la miosina purificata in uno dei due modi. Aliquota tra 10-20 μL in un tubo a parete sottile, come un tubo di reazione a catena di polimerizzazione, e far cadere il tubo in un contenitore di azoto liquido per il congelamento flash. In alternativa, pipettare direttamente tra 20-25 μL di miosina in azoto liquido e conservare le perle congelate di proteine in tubi criogenici sterili. In entrambi i casi, i tubi risultanti possono essere conservati in -80 °C o azoto liquido per un uso futuro.
      NOTA: Poiché entrambi i saggi di motilità descritti di seguito richiedono quantità molto piccole di proteine, lo stoccaggio in piccole aliquote, come descritto, è economico.

2. Test del filamento di actina planante

  1. Preparazione coverslip
    1. Fare una soluzione di nitrocellulosa all'1% in acetato di amile.
    2. Ottenere un piatto di coltura del tessuto (150 x 25 mm) e aggiungere una carta da filtro circolare (diametro 125 mm) sul fondo del piatto.
    3. Caricare otto coperchi quadrati di spessore n. 1,5 da 22 mm su un rack e lavare con circa 2-5 ml di etanolo a prova di 200 seguito da 2-5 ml di acqua distillata (dH2O). Ripeti questo passaggio di lavaggio, terminando con acqua. Quindi, asciugare completamente i coperchi utilizzando una linea d'aria filtrata o una linea N2.
    4. Prendere un coperchio e pipettare lentamente 10 μL della soluzione di nitrocellulosa all'1% lungo un bordo dello slip. Quindi, con un movimento regolare, spalmarlo sul resto del coperchio usando il lato di una punta della pipetta da 200 μL con un lato liscio. Posizionare questo coverslip sulla piatta di coltura del tessuto con il lato della nitrocellulosa verso l'alto. Ripetere per i coverslip rimanenti e lasciarli asciugare durante la preparazione dei reagenti rimanenti e utilizzare coverslip entro 24 ore dal rivestimento.
  2. Preparazione della camera
    1. Pulire un vetrino per microscopio con una carta ottica per lenti per pulire i detriti di grandi dimensioni. Tagliare due pezzi di nastro biadesivo, lunghi circa 2 cm.
    2. Posizionare un pezzo lungo il centro del bordo lungo del vetrino del microscopio. Assicuratevi che il bordo del nastro sia allineato con il bordo della diapositiva. Posizionare il secondo pezzo di nastro a circa 2 mm sotto il primo pezzo di nastro in modo tale che i due siano paralleli e allineati. Questo crea una camera di flusso che può contenere circa 10 μL di soluzione (vedere Figura 1).
    3. Prendi una delle coperture rivestite di nitrocellulosa dalla Parte 1. Attaccare con attenzione il coperchio sul nastro in modo che il lato rivestito di nitrocellulosa stia facendo contatto diretto con il nastro (vedere Figura 1). Utilizzando una punta della pipetta, premere delicatamente verso il basso sull'interfaccia del nastro scorrevole per assicurarsi che il coperchio abbia aderito correttamente alla diapositiva. Tagliare il nastro in eccesso appeso sul bordo della diapositiva con una lama di rasoio.
  3. Preparazione dell'actina
    1. Produrre 20 μM di F-actina polimerizzando l'actina globulare (G-actina) in tampone di polimerizzazione (50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7,0)) a 4 °C durante la notte.
    2. Diluire F-actina a 5 μM nel tampone di motilità (20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)). Etichetta con almeno 1,2 volte l'eccesso molare di rodamina-falloidina. Lasciare (coperto in un foglio di alluminio) per almeno 2 ore sul ghiaccio. Questo può essere utilizzato per un massimo di 1-2 mesi, conservato sul ghiaccio.
  4. Esecuzione del test del filamento di actina planante myosin 5a
    NOTA: In questa sezione vengono forniti i dettagli del test di planata della miosina 5a (HMM).
    1. Preparare le soluzioni per la miosina 5a descritte nella Tabella 2 e tenerle sul ghiaccio.
    2. Flusso in 10 μL della miosina 5a (50-100 nM) attraverso la camera di flusso e attendere 1 min.
    3. Flusso in 10 μL di BSA da 1 mg/mL in 50 mM MB con 1 mM DTT (tampone "low salt"). Ripeti questo lavaggio altre due volte e attendi 1 minuto dopo il terzo lavaggio. Utilizzare l'angolo di una carta velina o di carta da filtro per far traspirare la soluzione attraverso il canale posizionando delicatamente l'angolo della carta all'uscita della camera di flusso.
    4. Lavare con 10 μL di 50 mM MB con 1 mM DTT. Ripeti questo lavaggio altre due volte.
    5. Flusso in 10 μL della soluzione di actina nera (5 μM F-actina, 1 μM calmodulina e 1 mM ATP in 50 mM MB con 1 mM DTT) per eliminare le "teste morte", come discusso nella sezione Discussione.
      1. Pipettare la soluzione con una siringa da 1 mL e un ago da 27 G per tagliare i filamenti di actina prima di introdurre la soluzione nella camera. Ripeti questo passaggio altre due volte e attendi 1 minuto dopo la terza volta. Sono sufficienti circa 20 eventi di pipettaggio.
      2. Per eseguire lo spin della "testa morta", aggiungere una quantità stechiometrica di F-actina alla miosina in presenza di 1 mM di ATP e 1 mM di MgCl2 ad una concentrazione salina di 500 mM. Quindi ultracentrifugare a 480.000 x g per 15 minuti a 4 °C. La miosina morta sarà nel pellet.
    6. Flusso in 50 μL di 50 mM MB con 1 mM DTT e 1 mM ATP per esaurire la camera di filamenti di actina liberi.
    7. Lavare con 10 μL di 50 mM MB con 1 mM DTT. Ripetere questo lavaggio altre due volte per esaurire la camera di qualsiasi ATP.
    8. Flusso in 10 μL di 20 nM di rodamina actina (Rh-Actina) soluzione contenente 1 mM DTT in 50 mM MB e attendere 1 minuto per consentire il rigore di legame dei filamenti di actina alla miosina 5a attaccata alla superficie del coperchio.
    9. Lavare con 10 μL di 50 mM MB con 1 mM DTT per lavare via i filamenti di Rh-Actina non legati alla superficie. Ripeti questo lavaggio altre due volte.
    10. Flusso in 30 μL di tampone finale.
    11. Registra le immagini su un microscopio a fluorescenza utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 561 nm per visualizzare Rh-Actin. Un tempo di esposizione appropriato è di 200 ms a 1,4 mW di potenza laser per una durata totale di acquisizione di 0,5-1 min.
      NOTA: assicurarsi che la velocità di acquisizione sia scalata in modo appropriato alla velocità dei filamenti in movimento. Una considerazione importante prima di raccogliere dati da utilizzare con i programmi di tracciamento è il frame rate di acquisizione. I movimenti subpixel tra i fotogrammi comporteranno una sovrastima della velocità e sono necessari movimenti di diverse centinaia di nanometri per ottenere valori accurati. Una velocità di acquisizione ottimale prevede lo scorrimento dell'actina per almeno un pixel di distanza tra i fotogrammi. Nel caso del microscopio TIRF utilizzato per l'imaging qui, questa soglia si traduce in 130 nm; pertanto, una miosina che dovrebbe viaggiare 1 μm/s deve essere considerata ad una velocità di 5 fotogrammi/s (intervallo 0,2 s) per raggiungere 200 nm di movimento mentre una miosina che dovrebbe viaggiare a 10 nm/s richiede 0,05 fotogrammi/s (intervalli di 20 s). I dati possono quindi essere sottocampionati in questa fase, se necessario (vedere Discussione per maggiori dettagli).
  5. Esecuzione del test del filamento di actina planante della miosina 2b nonmuscolare
    NOTA: In questa sezione vengono forniti i dettagli del test di planata della miosina 2b non a lunghezza intera. Il protocollo di analisi del filamento di actina planante della miosina 2b non-divertente è diverso dal protocollo della miosina 5a in determinati passaggi. Assicurarsi che vengano utilizzati i buffer corretti per ciascuno di questi passaggi. Ad esempio, il test NM2b richiede l'attacco della miosina al coverslip in un tampone salino alto, mentre l'M5a può essere collegato al coverslip in buffer salini alti o bassi. Inoltre, il test del filamento di actina planante M5a utilizza una concentrazione inferiore di miosina per mitigare la frequenza di rottura dei filamenti di actina durante l'acquisizione.
    1. Preparare le soluzioni per NM2b come descritto nella Tabella 2 e tenerle sul ghiaccio.
    2. Flusso in 10 μL della miosina non-muscolare 2b (0,2 μM) in 500 mM Motility Buffer (MB) (tampone "ad alto sale") e 1 mM ditiotreitolo (DTT) attraverso la camera di flusso e attendere 1 min.
      NOTA: Gli alti tamponi salini dissociano i filamenti di miosina e consentono l'attaccamento di singole molecole di miosina alla superficie, poiché la miosina 2b non collicolare può polimerizzare in filamenti a concentrazione ionica <150 mM.
    3. Flusso in 10 μL dell'albumina sierica bovina da 1 mg/mL (BSA) in 500 mM MB con 1 mM DTT (tampone "ad alto contenuto di sale") come descritto nella Tabella 2. Ripeti questo lavaggio altre due volte e attendi 1 minuto dopo il terzo lavaggio. Utilizzare l'angolo di una carta velina o carta da filtro per far traspirare la soluzione attraverso il canale.
    4. Lavare con 10 μL di 500 mM MB con 1 mM DTT come descritto nella Tabella 2. Ripeti questo lavaggio altre due volte.
    5. Flusso in 10 μL della soluzione di actina nera come descritto nella Tabella 2 per eliminare le "teste morte", come discusso ulteriormente nella sezione Discussione. La soluzione di actina nera contiene 5 μM di F-actina non etichettata, 1-10 nM MLCK, 1 mM ATP, 0,2 mM CaCl2,1 μM CaM e 1 mM DTT in 50 mM NaCl tampone di motilità per fosforilare la miosina 2b non-collicolare sulla superficie della camera.
      1. Pipettare la soluzione con una siringa da 1 mL e un ago da 27 G per tagliare i filamenti di actina prima di introdurre la soluzione nella camera. Ripeti questo passaggio altre due volte e attendi 1 minuto dopo la terza volta. Approssimativamente, sono sufficienti 20 eventi di pipettaggio.
    6. Flusso in 50 μL di 50 mM MB con 1 mM DTT e 1 mM ATP per esaurire la camera di filamenti di actina liberi.
    7. Lavare con 10 μL di 50 mM MB con 1 mM DTT. Ripetere questo lavaggio altre due volte per esaurire la camera di qualsiasi ATP.
    8. Flusso in 10 μL di 20 nM di soluzione di Rh-Actina contenente 1 mM DTT in 50 mM MB e attendere 1 minuto per consentire il rigore di legame dei filamenti di actina alla miosina 2b non collicolare attaccata alla superficie del coperchio.
    9. Lavare con 10 μL di 50 mM MB con 1 mM DTT per lavare via i filamenti di Rh-Actina non legati alla superficie. Ripeti questo lavaggio altre due volte.
    10. Flusso in 30 μL di tampone finale. Per il test del filamento di actina planante della miosina 2b non cerebrale, il tampone finale include anche calmodulina, CaCl2e chinasi a catena leggera della miosina per fornire la completa fosforilazione della miosina 2b non cerebrale durante l'imaging video. Lo 0,7% di metilcellulosa può anche essere incluso nel tampone finale se i filamenti di actina sono legati solo liberamente o non sono legati alla superficie. Questo è discusso ulteriormente nella sezione Discussione.
    11. Registra le immagini su un microscopio a fluorescenza utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 561 nm. Un tempo di esposizione appropriato è di 200 ms a 1,4 mW di potenza laser per una durata totale di acquisizione di 0,5 -3 min.
      NOTA: assicurarsi che la velocità di acquisizione sia scalata in modo appropriato alla velocità dei filamenti in movimento. Una considerazione importante prima di raccogliere dati da utilizzare con i programmi di tracciamento è il frame rate di acquisizione. I movimenti subpixel tra i fotogrammi comporteranno una sovrastima della velocità e sono necessari movimenti di diverse centinaia di nanometri per ottenere valori accurati. Una velocità di acquisizione ottimale prevede lo scorrimento dell'actina per almeno un pixel di distanza tra i fotogrammi. Nel caso del microscopio TIRF utilizzato per l'imaging qui, questa soglia si traduce in 130 nm; pertanto, una miosina che dovrebbe viaggiare 1 μm/s deve essere considerata ad una velocità di 5 fotogrammi/s (intervallo 0,2 s) per raggiungere 200 nm di movimento mentre una miosina che dovrebbe viaggiare a 10 nm/s richiede 0,05 fotogrammi/s (intervalli di 20 s). I dati possono quindi essere sotto-campionati in questa fase, se necessario (vedere Discussione per maggiori dettagli).

3. Saggio TIRF a singola molecola

  1. Preparazione coverslip
    1. Dividere la polvere di riserva in aliquote da 10 mg (in tubi da 1,5 mL) di metossi-Peg-silano (mPEG) e aliquote da 10 mg di biotina-Peg-silano (bPEG). Conservare a -20 °C in un contenitore sigillato e privo di umidità e utilizzare entro 6 mesi.
    2. Caricare otto coperchi quadrati da 22 mm di spessore n. 1,5 ore (alta precisione) su un rack e lavare con 2-5 ml di etanolo a prova di 200 seguito da 2-5 ml di acqua distillata. Ripeti questo passaggio di lavaggio, terminando con acqua. Quindi, asciugare completamente i coperchi utilizzando una linea d'aria o N2 e pulire al plasma con argon per 3 minuti.
    3. Posizionare i coperchi puliti su carta da filtro (90 mm) in una parabola per la coltura di tessuti (100 x 20 mm) e incubare in un forno a 70 °C eseguendo i seguenti passaggi.
      NOTA: La pulizia al plasma può essere sostituita con altri metodi di pulizia chimica49.
    4. Preparare la soluzione di etanolo all'80% con dH2O e regolare il pH a 2,0 usando HCl. Aggiungere 1 mL di questo a un'aliquota di 10 mg di mPEG e 1 mL a un'aliquota di 10 mg di bPEG. Vortice per dissolversi, che non dovrebbe richiedere più di 30 s.
    5. Prendere 100 μL della soluzione bPEG e aggiungere 900 μL di etanolo all'80% (pH 2,0). Questa soluzione è 1 mg/mL bPEG. Quindi, fare una soluzione di entrambi i PEG come segue, mescolando accuratamente.
      1. 200 μL di 10 mg/mL mPEG (concentrazione finale: 2 mg/mL).
      2. 10 μL di 1 mg/mL di bPEG (concentrazione finale: 10 μg/mL).
      3. 790 μL della soluzione di etanolo all'80% (pH 2,0).
    6. Togliere le coperture dal forno. Erogare con attenzione 100 μL della soluzione PEG sul centro di ogni coverslip, assicurandosi che solo la superficie superiore sia bagnata. Quindi, rimettere gli slip nel forno e incubare per 20-30 minuti.
    7. Quando le coperture iniziano ad assumere un aspetto bucato, con piccoli cerchi evidenti sulla superficie, rimuoverle dal forno.
    8. Lavare ogni coverslip con etanolo al 100%, asciugare con una linea d'aria e rimettere in forno. Incubare solo per il tempo necessario a creare le camere nel passaggio 2.
  2. Preparazione della camera
    1. Pulire un vetrino per microscopio per l'uso nella realizzazione della camera. Tagliare due pezzi di nastro biadesivo, lunghi circa 2 cm.
    2. Posizionare un pezzo lungo il centro del bordo lungo del vetrino del microscopio. Assicuratevi che il bordo del nastro sia allineato con il bordo della diapositiva. Posizionare il secondo pezzo di nastro a circa 2 mm sotto il primo pezzo di nastro in modo tale che i due siano paralleli e allineati.
    3. Prendi uno dei coverslip funzionalizzati dal forno (creato in 3.1). Attaccare con attenzione il coperchio sul nastro in modo che il lato rivestito con PEG sia rivolto verso il basso e faccia contatto diretto con il nastro, come mostrato nella Figura 1. Utilizzando una punta della pipetta, premere delicatamente verso il basso sull'interfaccia del nastro scorrevole per assicurarsi che il coperchio abbia aderito correttamente alla diapositiva.
    4. Tagliare il nastro in eccesso appeso sopra la diapositiva con una lama di rasoio. Queste camere possono essere utilizzate immediatamente o posizionate a coppie in un tubo da 50 ml e conservate in un congelatore a -80 °C per un uso futuro. È importante conservare immediatamente o la superficie si degraderà.
  3. Esecuzione del test al microscopio TIRF della miosina 5a
    1. Preparare le soluzioni per il saggio di motilità invertita della miosina 5a descritto nella Tabella 3 e tenerle sul ghiaccio.
    2. Lavare la camera con 10 μL di 50 mM MB con 1 mM DTT.
    3. Flusso in 10 μL di BSA da 1 mg/mL in 50 mM MB con 1 mM DTT. Ripeti questo lavaggio altre due volte e attendi 1 minuto dopo il terzo lavaggio. Utilizzare l'angolo di una carta velina o carta da filtro per far traspirare la soluzione attraverso il canale.
    4. Lavare con 10 μL di 50 mM MB con 1 mM DTT. Ripeti questo lavaggio altre due volte.
    5. Flusso in 10 μL della soluzione neutrAvidin in 50 mM MB con 1 mM DTT e attendere 1 min.
    6. Lavare con 10 μL di 50 mM MB con 1 mM DTT. Ripeti questo lavaggio altre due volte.
    7. Flusso in 10 μL di rodamina actina biotinilata (bRh-Actina) contenente 1 mM DTT in 50 mM MB e attendere 1 min. Per questa fase, utilizzare una punta della pipetta di grandi dimensioni ed evitare il pipettaggio su e giù per ridurre al minimo la cesoiatura dei filamenti di actina fluorescente per garantire che i filamenti di actina lunghi possano essere attaccati alla superficie (20-30 μm o più). Un'alternativa efficace è il taglio del cono di una punta di pipetta standard (con un'apertura di ≈1-1,5 mm).
    8. Lavare con 10 μL di 50 mM MB con 1 mM DTT. Ripeti questo lavaggio altre due volte.
    9. Flusso in 30 μL di tampone finale con 10 nM di miosina 5a aggiunta, quindi caricare immediatamente sul microscopio TIRF e registrare dopo aver trovato la messa a fuoco ottimale per la modalità di imaging TIRF. I tempi di esposizione tra 100-200 ms sono appropriati a 1,4 mW di potenza laser per l'actina e la miosina marcata con GFP. Un tempo di acquisizione appropriato per l'analisi della velocità è di 3 minuti.
  4. Esecuzione del test al microscopio TIRF della miosina nonmuscolare 2b
    NOTA: In questa sezione vengono forniti i dettagli del saggio TIRF della miosina 2b nonmuscolare utilizzando filamenti polimerizzati e fosforilati. È incluso un protocollo dettagliato (paragrafi 4.1-4.3) per la fosforilazione e la polimerizzazione della miosina-2b non-muscolo in un tubo.
    1. Per fosforilare l'NM2b purificato, fare una miscela di chinasi 10x con le seguenti condizioni: 2 mM CaCl2, 1 μM CaM, 1-10 nM MLCK e 0,1 mM ATP. Questo può essere portato a volume con 500 mM MB con 10 mM DTT. Aggiungere la miscela di chinasi 10x alla miosina con un rapporto volumetrico di 1:10 e lasciare che questa incuba per 20-30 minuti a temperatura ambiente. Tipicamente, la concentrazione di miosina per questo passaggio è di 1 μM.
    2. Per polimerizzare la miosina fosforilata in filamenti, abbassare la concentrazione salina di NM2b a 150 mM NaCl. Per fare ciò, creare un buffer di motilità 1x (1x MB) senza sale diluendo il 4x MB quattro volte in dH2O. Questo 1x MB può essere utilizzato per abbassare la concentrazione di sale perché l'NM2b è stato congelato in un tampone salino da 500 mM.
    3. Per ogni 3 μL di NM2b di riserva, aggiungere 7 μL di 1x MB per abbassare la concentrazione di sale a 150 mM NaCl e incubare sul ghiaccio per 20-30 minuti per formare filamenti NM2b.
      NOTA: L'ordine nei punti 4.1-4.3 non è cruciale finché l'NM2b è fosforilato e la concentrazione finale di sale è di 150 mM. L'incubazione dell'ordine di 30 min-1 h consente un tempo sufficiente per la completa fosforilazione e polimerizzazione.
    4. Preparare le soluzioni per il saggio di motilità invertita della miosina 2b non a causa dei vari, descritto nella Tabella 3, e tenerle sul ghiaccio.
    5. Lavare la camera con 10 μL di 150 mM MB con 1 mM DTT.
    6. Flusso in 10 μL di BSA da 1 mg/mL in 150 mM MB con 1 mM DTT Ripetere questo lavaggio altre due volte e attendere 1 minuto dopo il terzo lavaggio. Utilizzare l'angolo di una carta velina o carta da filtro per far traspirare la soluzione attraverso il canale.
    7. Lavare con 10 μL di 150 mM MB con 1 mM DTT. Ripeti questo lavaggio altre due volte.
    8. Flusso in 10 μL della soluzione neutrAvidin in 150 mM MB con 1 mM DTT e attendere 1 min.
    9. Lavare con 10 μL di 150 mM MB con 1 mM DTT. Ripeti questo lavaggio altre due volte.
    10. Flusso in 10 μL di bRh-Actina e attendere 1 min. Per questo passaggio, utilizzare una punta della pipetta di grande diametro ed evitare il pipettaggio su e giù per ridurre al minimo il taglio dei filamenti di actina fluorescente, per garantire che i filamenti di actina lunghi possano essere attaccati alla superficie (20-30 μm o più). Un'alternativa efficace è il taglio del cono di una punta di pipetta standard.
    11. Lavare con 10 μL di 150 mM MB con 1 mM DTT. Ripeti questo lavaggio altre due volte.
    12. Flusso in 10 μL della soluzione di miosina 2b non collicolare (circa 30 nM) e attendere 1 min.
    13. Lavare con 10 μL di 150 MB con 1 mM DTT. Ripeti questo lavaggio altre due volte.
    14. Flusso in 30 μL di tampone finale, quindi caricare immediatamente sul microscopio TIRF e registrare dopo aver trovato la messa a fuoco ottimale per la modalità di imaging TIRF. I tempi di esposizione tra 100-200 ms sono appropriati a 1,4 mW di potenza laser per l'actina e la miosina marcata con GFP. Un tempo di acquisizione appropriato per l'analisi della velocità è di 3 minuti.

4. Analisi delle immagini

  1. Analisi delle immagini per il test del filamento di actina planante
    NOTA: Le immagini possono essere analizzate utilizzando il software e i manuali collegati nell'Elenco dei materiali. È importante notare che il programma qui descritto richiede stack TIFF per l'analisi. Il processo per l'analisi del test del filamento di actina planante è ilseguente 50.
    1. Carica gli stack di filmati non elaborati in una struttura di cartelle specificata e inserisci la directory più in alto delle cartelle dei filmati nel programma.
      NOTA: il programma analizza i file in questa directory e sottodirectory, trattando le directory di livello più basso come repliche. Verranno prodotte statistiche medie per ciascun gruppo di repliche. In questo caso, è stato utilizzato un singolo film per ogni miosina. Quando si caratterizza una nuova miosina o si indaga su una nuova condizione sperimentale, si consiglia di analizzare i filmati da tre campi visivi (FOV) per camera per un totale di tre camere e di ripetere questo flusso di lavoro per tre preparazioni della miosina oggetto di indagine.
    2. Utilizzare lo script "stack2tifs" insieme alla frequenza fotogrammi immessa dall'utente per convertire ogni stack TIFF in una cartella contenente una serie di singoli file TIFF e un file di metadati.txt corrispondente contenente l'ora di inizio di ciascun fotogramma. Per i dati non in formato stack TIFF, è necessario prima applicare una conversione utilizzando software come quelli elencati nella Tabella dei materiali.
      Nota : questo script è la parte del pacchetto software. Le informazioni dello script possono essere trovate qui: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. Utilizzare il parametro -px, ovvero la dimensione dei pixel (in nm) durante l'acquisizione. In questo caso, la dimensione dei pixel è 130 nm. Utilizzare i parametri -xmax e -ymax per ridimensionare gli assi per gli output del grafico a dispersione. Questi corrispondono alla lunghezza del filamento tracciato più lungo e alla velocità massima tracciata (in nm/s).
      NOTA: si tratta di valori stimati e possono essere impostati su valori superiori al previsto per garantire che i dati siano contenuti nel grafico. Dopo l'analisi, i dati grezzi possono anche essere esportati per l'uso in altri software statistici o grafici per la visualizzazione e l'analisi.
    4. Utilizzare il parametro -minv, che è un parametro di taglio della velocità minima, per definire i filamenti che non si muovono e possono, quindi, essere esclusi dall'analisi. Per una miosina lenta come NM2b, questo parametro deve essere basso (in questo esempio, 5 nm/s) per evitare di tagliare i veri movimenti di scorrimento. Per una miosina veloce come M5a, questo parametro può essere più alto (in questo esempio, 100 nm/s) per applicare un filtro più rigoroso, pur mantenendo la vera distribuzione della velocità di scorrimento.
    5. Utilizzare il parametro -pt cutoff per identificare il movimento regolare. Per ogni finestra di campionamento, viene calcolato un valore equivalente a 100 x Velocità Deviazione Standard/Velocità Media. Le tracce con valori superiori al cutoff, hanno velocità più variabili e sono escluse da ulteriori analisi. In questo esempio è stato utilizzato un valore limite di 33. Le tracce con valori più elevati hanno velocità più variabili e sono escluse da ulteriori analisi.
    6. Utilizzate -maxd per impostare una distanza massima di collegamento consentita tra i fotogrammi. Questa è una distanza fotogramma-fotogramma calcolata spostata dal centroide del filamento in unità di nm. Può essere utile per escludere movimenti sporadici o collegamenti errati tra filamenti. Negli esempi riportati di seguito, il parametro è stato lasciato sul valore predefinito di 2.000 nm.
  2. Analisi delle immagini per il test al microscopio TIRF
    NOTA: Il processo di analisi del test TIRF a singola molecola sul software di imaging specificamente elencato nella Tabella dei materiali è il seguente29.
    1. Fare clic e trascinare il video al microscopio registrato nell'area di lavoro del software per aprirlo51. Quindi, dividere i canali di acquisizione. Clicca su Immagine > Colore > Canali divisi.
      NOTA: In caso di apprezzabile deriva dello stadio durante l'acquisizione, le immagini devono essere stabilizzate per correggere la deriva strumentale sul piano di imaging. In questo caso, non è stata utilizzata alcuna compensazione per la deriva dell'asse Z poiché il microscopio utilizzato per ottenere questi dati stabilizza bene il fuoco Z. Per stabilizzare l'immagine sul programma di analisi delle immagini, installare il plug-in stabilizzatore appropriato collegato all'elenco dei materiali. Lo stabilizzatore d'immagine assume posizioni fisse per gli oggetti nell'immagine e utilizza una media mobile dei fotogrammi precedenti come riferimento. La procedura consigliata è quindi quella di iniziare con il canale contenente immagini di actina etichettata, poiché questa è in una posizione fissa.
    2. Clicca su Plugin,quindi trova Stabilizzatore d'immagine; assicurarsi che l'opzione Traduzione sia selezionata e mantenere le impostazioni predefinite. Seleziona la casella accanto a Coefficienti di trasformazione del registro. L'applicazione di questo passaggio log consente di applicare i parametri di spostamento calcolati all'altro canale nel passaggio successivo. Attendere il completamento del processo.
    3. Quindi, apri il canale con la miosina etichettata e applica la stabilizzazione facendo clic su Plugin > Image Stabilizer Log Applier. Se le immagini di actina non possono essere acquisite durante la stessa acquisizione a causa della necessità di imaging a velocità più elevata in un singolo canale, la deriva stabilizza la pila di immagini selezionando una regione che contiene oggetti statici come un marcatore fiduciale biotinilato o fluorofori legati in modo non specifico alla superficie della biotina-PEG. Questa regione può essere ritagliata dallo stack originale e stabilizzata, seguita dall'applicazione dei valori di spostamento risultanti allo stack originale.
      NOTA: In pratica, la deriva osservata negli esperimenti di motilità sarà trascurabile rispetto al moto delle miosine che si muovono a diverse centinaia di nm/s, ma per le miosine più lente questa diventa una considerazione importante.
    4. Quindi, apri TrackMate, fai clic su Plugin; quindi, nel suo menu a discesa fai clic su Tracking e infine su TrackMate. A questo punto, l'analisi dell'immagine è soggetta ad ottimizzazione in base ai parametri del fluoroforo e alle condizioni di saggio. Tuttavia, i parametri di partenza ideali sono i seguenti.
      1. Impostazioni di calibrazione: mantenere tutti i valori predefiniti.
      2. Rilevatore: rilevatore LoG.
      3. Diametro BLOB stimato: 0,5-1,0 micron.
      4. Soglia: 25-200. (Questo può essere determinato facendo clic su Anteprima dopo aver scelto un numero per vedere se i punti rilevati corrispondono al filmato e regolando in modo appropriato.)
      5. Soglia iniziale: non impostata.
      6. Visualizza: HyperStack Displayer.
      7. Imposta filtri su punti: non impostati.
      8. Tracker: semplice tracker LAP.
        NOTA: questi dipendono dalla frequenza dei fotogrammi e dalla velocità della miosina e devono essere abbastanza grandi da collegare posizioni successive escludendo connessioni indesiderate tra particelle diverse.
      9. Distanza massima di collegamento: 1,0 micron.
      10. Distanza massima di chiusura del gap: 1,0 micron.
      11. Gap gap massimo di chiusura del telaio: 1.
      12. Impostare i filtri sulle tracce: Spostamento traccia (>0,39 per includere solo i punti che si muovono più di 3 pixel), Macchie nelle tracce (>3 per includere solo le tracce con almeno 3 punti). Altri filtri come Minimal Velocity possono essere introdotti per escludere i punti che si bloccano per lunghi periodi. I risultati del filtraggio devono essere controllati mediante ispezione visiva delle tracce per garantire che le tracce spurie (cioè il movimento della miosina sullo sfondo che non si trova lungo una traccia di actina) vengano rimosse mantenendo le tracce associate all'actina.
    5. Una volta visualizzata la schermata Opzioni di visualizzazione, fare clic su Analisi per i relativi output. Salva le tre tabelle prodotte (Statistiche traccia, Collegamenti nelle statistiche traccia e Spot nelle statistiche traccia). La tabella Track Statistics conterrà i dati di velocità e spostamento che possono quindi essere successivamente analizzati per caratterizzare una nuova proteina o gli effetti di una determinata condizione sperimentale, ad esempio.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La purificazione della miosina può essere valutata eseguendo l'elettroforesi gel-elettroforesi riducente sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) come mostrato in Figura 2. Mentre questa cifra rappresenta la miosina finale post-dializzato, SDS-PAGE può essere eseguita su aliquote dalle varie fasi della procedura di purificazione per identificare eventuali prodotti persi dal surnatante. Myosin 5a HMM ha una banda nella gamma 120-130 kDa e la miosina nonmuscolare a lunghezza intera 2b ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui viene presentato un flusso di lavoro per la purificazione e la caratterizzazione in vitro della miosina 5a e della miosina 2b nonmuscolare. Questo insieme di esperimenti è utile per quantificare le proprietà meccanochimiche dei costrutti di miosina purificati in modo rapido e riproducibile. Sebbene le due miosine mostrate qui siano solo due esempi specifici tra le molte possibilità, le condizioni e le tecniche possono essere applicate, con qualche personalizzazione, alla maggior parte delle miosine e a molte altre pr...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il Dr. Fang Zhang per l'assistenza tecnica nella preparazione dei reagenti utilizzati per la raccolta di questi dati. Questo lavoro è stato supportato dal NHLBI / NIH Intramural Research Program finanzia HL001786 a J.R.S.

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Materials

Scatola di controllo ambientale per microscopio<Unità laser a quattro mani File:TrackMate-manual.pdf

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL SiringaBD309628
2 M CaCl2 SoluzioneVWR10128-558
2 M MgCl2 SoluzioneVWR10128-298
27 Ago di misuraBecton Dickinson309623
5 M NaCl SolutionKD MedicalRGE-3270
Acido aceticoThermoFisher Scientific984303
Amyl AcetateLadd Research Industries10825
Anti-FLAG M2 Affinity GelMillipore SigmaA2220
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdfATPMillipore SigmaA7699<
strong>Biotinilate G-ActinCytoskeleton, Inc.AB07
Albumina sierica bovinaMillipore Sigma5470
bPEG-silaneLaysan Bio, IncBiotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent ConcentrateBio-Rad5000006
CalmodulinPMID: 2985564
CatalasiMillipore SigmaC40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFMThermoFisher Scientific 11496015http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Carta da filtro circolare - Saggio di scorrimentocircolare Millipore SigmaWHA1001125
- Saggio invertitoMillipore SigmaWHA1001090
cOmplete, Compresse di inibitori della proteasi senza EDTAMillipore Sigma5056489001Questo deve essere conservato a 4 °C. Le compresse possono essere utilizzate direttamente o possono essere ricostituite come soluzione madre 25x sciogliendo 1 compressa in 2 mL di acqua distillata. La soluzione risultante può essere conservata a 4 ° C per 1-2 settimane o almeno 12 settimane a -20 °C.
Tubi di concentrazione (100.000 MWCO)EMD Millipore CorporationUFC910024Il MWCO del tubo non è necessariamente "taglia unica", purché il MWCO sia inferiore al peso molecolare totale della proteina da purificare. L'NM2b qui contenuto è stato concentrato con un tubo da 100.000 MWCO e l'M5a è stato concentrato con un tubo da 30.000 MWCO.
Coomassie Brilliant Blue R-250 DyeThermoFisher Scientific20278
Coverslip RackMillipore SigmaZ688568-1EA
strong>Coverslips: Gliding Acting Filament AssayVWR International48366-227
Coversles: Inverted Motility Assay Azer ScientificES0107052
(3500 Dalton MCWO)Fischer Scientific08-670-5AIl diametro del tubo per dialisi può variare, ma il MWCO dovrebbe essere lo stesso. L'NM2b qui utilizzato è stato dializzato in una provetta per dialisi da 18 mm. I tubi possono essere conservati in una soluzione alcolica al 20% a 4 °C.
DL-DithiothreitolMillipore SigmaD0632
Double-Sided TapeOffice Depot909955
DYKDDDDDK PeptideGenScriptRP10586Può essere sciolto in un tampone contenente 0,1 M di NaCl, 0,1 mM di EGTA, 3 mM di NaN3 e 10 mM di MOPS (pH 7,2) fino a una concentrazione finale di 50 mg/mL. Questo può essere memorizzato a -20 ° C come 300 µ L aliquote.
EGTAMillipore SigmaE4378
Colonna di eluizioneBio-Rad761-1550Questi possono essere riutilizzati. Per la pulizia, sciacquare la colonna con 2-3 volumi di PBS e acqua distillata. Raffreddare la colonna a 4 gradi C prima dell'uso.
EtanoloFischer ScientificA4094
G-actinaPMID: 4254541stock di G-actina può essere conservato a 200 μ M nel liquido N2.
GlucosioMillipore SigmaG8270
Glucosio ossidasiMillipore SigmaG2133
Soluzione tampone glicina, 100 mM, pH 2-2,5, 1 LSanta Cruz Biotechnologysc-295018
HaloTagPromegaG100A
HClMillipore Sigma320331
KClFischer ScientificP217-500<
strong>Large-Orifice Pipet TipsFischer Scientific02-707-134
Leupeptin Protease InhibitorThermoFisher Scientific78435
Mark12 Scala standard non colorataThermoFisher ScientificLC5677
MetanoloMillipore SigmaMX0482
MetilcellulosaMillipore SigmaM0512
Vetrini per microscopioFischer Scientific12-553-10
MOPSFischer ScientificBP308-100
mPEG-silaneLaysan Bio, IncMPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain KinasePMID: 23148220MLCK con tag FLAG può essere purificato nello stesso modo in cui la miosina con tag FLAG è stata purificata qui.
NaN3Millipore SigmaS8032
NeutrAvidinThermoFisher Scientific31050
NitrocellulosaLadd Research Industries10800
NuPAGE 4 al 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15 pozzettiThermoFisher ScientificNP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)ThermoFisher ScientificNP0007
Soluzione salina tamponata con fosfato, pH 7,4ThermoFisher Scientific10010023
PMSFMillipore Sigma78830Il PMSF può essere prodotto come soluzione madre 0,1 M in isopropanolo e conservato in 4 °C. L'aggiunta di isopropanolo provoca la precipitazione dei cristalli, che può essere disciolta agitando a temperatura ambiente. Immediatamente prima dell'uso, il PMSF può essere aggiunto goccia a goccia a una soluzione di agitazione rapida fino a una concentrazione finale di 0,1 mM.
Lamette da barbaOffice Depot397492
Rhodamine-PhalloidinThermoFisher ScientificR415Stock può essere diluito in metanolo al 100% fino a una concentrazione finale di 200 μM.
Sf9 MediaThermoFisher Scientific12658-027Questo deve essere conservato a 4°C. La sua durata di conservazione è di 18 mesi dalla data di produzione.
Piastra per coltura tissutale - Saggio di scorrimentoCorning353025Ogni piastra per coltura tissutale può contenere circa nove vetrini.
Piatto per coltura tissutale - Saggio invertitoCorning353003Ogni piatto per coltura tissutale può contenere circa quattro vetrini.
Liscio 200 µ L Puntali per pipetteThomas Scientific1158U38
EQUIPMENT
CentrifugeThermoFisher Scientific75006590
MicroscopioNikonModello: Eclipse Ti con sistema H-TIRF con obiettivo TIRF 100x (N.A. 1.49)
Fotocamera per microscopioAndorModello: Fotocamera EMCCD iXon DU888 (formato sensore 1024 x 1024)
/strong>Tokai HITCustom Thermobox
Unità laser per microscopioNikonLU-n4 con laser a stato solido per 405 nm, 488 nm, 561 nm e 640 nm
Centrifuga da banco MidThermoFisher ScientificModello: CR3i
Misonix SonicatorMisonixXL2020
Optima Max-Xp Tabletop UltracentrifugeBeckman Coulter393315
Plasma-CleanerDiener electronic GmbH + Co. KGSystem Tipo: Sonda per sonicatore Zepto
(3,2 mm)Qsonica4418
Incubatore standardBinderModello: 56
Waverly Tube MixerWaverlyTR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (versione 1.01)http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurementsFAST è disponibile per sistemi basati su Mac OSX e Linux.
Image Stabilizer Pluginhttps://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMatehttps://imagej.net/TrackMate
Imaging SoftwareNIS Elements (pacchetto AR)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md
Carta da filtro < Tubo per dialisi

References

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