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Articolo metodologico

Co-coltura di cellule simili a staminali di glioblastoma su neuroni modellati per studiare la migrazione e le interazioni cellulari

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DOI:

10.3791/62213

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24 febbraio 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1University Bordeaux, INSERM, LAMC, U1029, 33600, Pessac, France, 2Univ. Bordeaux, CNRS, Interdisciplinary Institute for Neuroscience, IINS, UMR 5297, Bordeaux, France, 3Alvéole, Bordeaux, France, 4University Bordeaux, CNRS, IBGC, UMR5095, 33000, Bordeaux, France

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un saggio di co-coltura facile da usare per analizzare la migrazione del glioblastoma (GBM) sui neuroni modellati. Abbiamo sviluppato una macro nel software FiJi per una facile quantificazione della migrazione cellulare GBM sui neuroni, e abbiamo osservato che i neuroni modificano la capacità invasiva delle cellule GBM.

Abstract

I glioblastomi (GBM), gliomi maligni di IV grado, sono uno dei tipi più leciti di cancro umano a causa delle loro caratteristiche aggressive. Nonostante i significativi progressi nella genetica di questi tumori, come le cellule GBM invadano il parenchima cerebrale sano non è ben compreso. In particolare, è stato dimostrato che le cellule GBM invadono lo spazio peritumorale attraverso percorsi diversi; l'interesse principale di questo documento è il percorso lungo i tratti di materia bianca (WMT). Le interazioni delle cellule tumorali con i componenti delle cellule nervose peritumorali non sono ben caratterizzate. Qui è stato descritto un metodo che valuta l'impatto dei neuroni sull'invasione cellulare del GBM. Questo articolo presenta un saggio avanzato di co-coltura in vitro che imita l'invasione wmt analizzando la migrazione delle cellule staminali GBM sui neuroni. Il comportamento delle cellule GBM in presenza di neuroni viene monitorato utilizzando una procedura di tracciamento automatizzato con software open source e ad accesso libero. Questo metodo è utile per molte applicazioni, in particolare, per studi funzionali e meccanicistici nonché per analizzare gli effetti degli agenti farmacologici che possono bloccare la migrazione cellulare GBM sui neuroni.

Introduzione

I gliomi maligni primari, compresi i GBM, sono tumori devastanti, con un tasso medio di sopravvivenza da 12 a 15 mesi riportato per i pazienti affetti da GBM. La terapia attuale si basa su una grande resezione della massa tumorale e sulla chemioterapia accoppiata alla radioterapia, che estende il tasso di sopravvivenza solo di pochi mesi. I fallimenti terapeutici sono intimamente correlati allo scarso parto di farmaci attraverso la barriera ematica (BBB) e alla crescita invasiva in spazi perivascolari, meningi e lungo le WMT1. L'invasione perivascolare, chiamata anche co-opzione vascolare, è un processo ben studiato, e i meccanismi molecolari stanno iniziando ad essere chiariti; tuttavia, il processo di invasione cellulare GBM lungo le MMM non è ben compreso. Le cellule tumorali migrano nel cervello sano lungo le strutture secondarie2 diScherer . Infatti, quasi un secolo fa, Hans-Joachim Scherer descrisse le rotte invasive del GBM, che ora sono indicate come satellitosi perineuronale, satellitosi perivascolare, diffusione subpiale e invasione lungo la WMT (Figura 1A).

Alcune chemiochine e i loro recettori, come il fattore 1α derivato dalle cellule stromali (SDF1α) e il recettore della chemiochina con motivo C-X-C 4 (CXCR4), ma non il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), sembrano essere implicati nell'invasione WMT3. Più recentemente, un asse TRANSCELLULAR NOTCH1-SOX2 ha dimostrato di essere un percorso importante nell'invasione WMT delle cellule GBM4. Gli autori hanno descritto come le cellule staminali GBM invadano il parenchima cerebrale su neuroni parzialmente non mielinati, suggerendo la distruzione delle suone di mielina da parte delle cellule GBM. Una pietra miliare è stata raggiunta nel 2019 quando tre articoli sono stati pubblicati inconsacrazione sulla rivista Nature, sottolineando il ruolo dell'attività elettrica nello sviluppo del glioma5,6. Il lavoro seminale di Monje e collaboratori fa luce sul ruolo centrale dell'attività elettrica nella secrezione di neuroligin-3, che promuove lo sviluppo del glioma.

Winkler e collaboratori hanno descritto le connessioni tra cellule GBM (microtubi) cruciali in passaggi invasivi e, ultimamente, interazioni tra cellule GBM e neuroni attraverso sinapsi di neuroglioma appena descritte. Queste strutture favoriscono la stimolazione glutattergica dei recettori dell'acido α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazolepropionico (AMPA) situati nella membrana cellulare GBM, che promuove lo sviluppo e l'invasione del tumore. L'invasione delle cellule tumorali è un processo centrale nella diffusione di metastasi o focolai secondari distanti, come osservato nei pazienti affetti da GBM. Diversi fattori sono stati identificati come importanti nell'invasione gbm come la trombospondina-1, un fattore di crescita beta trasformante (proteina matricellulare regolata da TGFβ o il recettore delle chemiochine CXCR3)7,8.

Qui, è stato descritto un modello biomimetico semplificato per lo studio dell'invasione GBM, in cui i neuroni sono modellati su tracce di laminina, e le cellule GBM sono seminate su di essa, come singole cellule o come sferoidi (Figura 1B). Le due impostazioni sperimentali sono finalizzate a ricapitolare l'invasione sui neuroni, che si osserva in GBM9,10,11. Tali modelli sono stati sviluppati in passato come biomateriali in nanofibra allineati (elettrofilatura a guscio centrale) che consentono di studiare la migrazione cellulare modulando le proprietà meccanicheo chimiche 12. Il modello di co-coltura descritto in questo articolo consente una migliore comprensione di come le cellule GBM fuggono sui neuroni definendo nuove vie molecolari coinvolte in questo processo.

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Protocollo

Il consenso scritto informato è stato ottenuto da tutti i pazienti (dall'ospedale haukeland di Bergen, Norvegia, secondo le normative del comitato etico locale). Questo protocollo segue le linee guida dei comitati etici per la ricerca umana e animale dell'Università di Bordeaux. I ratti gravidi venivano ospitati e trattati nella struttura animale dell'Università di Bordeaux. L'eutanasia di un ratto incinta a tempo E18 è stata eseguita utilizzando CO2. Tutte le procedure sugli animali sono state fatte secondo le linee guida istituzionali e approvate dal comitato etico locale. Tutti i prodotti commerciali sono referenziati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione delle diapositive modellate

  1. Preparazione del substrato per il micropatterning
    1. Trattare le coperture circolari in vetro da 18 mm con l'attivazione aria/plasma per 5 minuti. Posizionare le copertine in una camera chiusa con 100 μL di (3-amminopropil) trietossisilano in un essiccatore per 1 h.
    2. Incubare con 100 mg/mL di poli (glicole etilenico)-succinimidil valerato (peso molecolare 5.000 (Peg-SVA)) in tampone di carbonato da 10 mM, pH > 8, per 1 h. Risciacquare ampiamente con acqua ultrapura e asciugare sotto una cappa chimica.
      NOTA: In questa fase, il campione può essere conservato a 4 °C al buio per un ulteriore utilizzo.
    3. Aggiungere il fotoinizio, cloruro di 4-benzoilbenzil-trimetilammonio (PLPP), a 14,7 mg/mL in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
      NOTA: Può essere utilizzata anche una forma concentrata di PLPP, un gel PLPP. Si traduce in un tempo di illuminazione ultravioletto (UV) più breve necessario per degradare il pennello PEG (100 mJ/ mm2).
  2. Deposizione gel fotoiniziatore
    1. Preparare una miscela di 3 μL di gel PLPP e 50 μL di etanolo assoluto da depositare al centro dello scivolo. Posizionare il campione sotto una cappa chimica fino alla completa evaporazione dell'etanolo assoluto.
      NOTA: In questa fase, il campione può essere conservato a 4 °C al buio per un ulteriore utilizzo.
  3. Micropatterning di vetri
    1. Montare il coverslip in una camera Ludin e posizionarlo sullo stadio motorizzato di un microscopio dotato di un sistema di messa a fuoco automatica.
    2. Caricare immagini corrispondenti ai micropattern previsti nel software. Applicare questi parametri: replicazione 4 x 4 volte, spaziatura di 200 μm, dose UV di 1.000 mJ/mm2. Dopo la sequenza automatica di illuminazione UV, sciacquare il PLPP con più lavaggi PBS.
      NOTA: Se è stato utilizzato il gel PLPP, rimuoverlo con lavaggi estesi con acqua deionizzata, asciugare in un flusso di N2e conservare a 4 °C.
    3. Incubare con laminina (50 μg/mL in PBS) per 30 min. Lavare ampiamente con PBS.
      NOTA: Una soluzione fluorescente di proteina fluorescente verde purificata (GFP, 10 μg/mL in PBS) può essere miscelata con laminina per visualizzare i micropattern mediante microscopia a fluorescenza.

2. Preparazione di neuroni e cellule GBM per la co-coltura

  1. Coltura dei neuroni ippocampali del ratto embrionale
    1. Sezionare l'ippocampo dei ratti embrionali (E18) e trasferire il tessuto nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)/1 mM 4-(2-idrossietil)-1-piperazinaetanosilfuronica (HEPES)/soluzione di penicillina-streptomicina in un tubo da 15 ml. Rimuovere la soluzione in eccesso senza asciugare l'ippocampo.
    2. Aggiungere 5 mL di acido tetraacetico tripsideina-etilendiammina (EDTA) integrato con penicillina (10.000 unità/mL)/streptomicina (10.000 μg/mL) e 1 mM HEPES e incubare per 15 min a 37 °C. Lavare 2 volte con la soluzione HBSS/HEPES/penicillina-streptomicina e lasciare che il tessuto rimanga in questa soluzione per 2-3 minuti.
    3. Dissociare il tessuto utilizzando due pipette Pasteur lucidate a fiamma, pipettando su e giù 10 volte con ogni tessuto, facendo attenzione a ridurre al minimo la schiuma. Contare le celle e valutare la fattibilità della sospensione cellulare. Placcare i neuroni su coverlips micropatterned come indicato di seguito.
      NOTA: Il tasso di vitalità cellulare è dell'85-90% dopo l'estrazione.
  2. Coltura cellulare per neuroni su coverlips micropatterned
    1. Reidratare i vetri micropatterned con PBS e incubare il mezzo completo di coltura cellulare neuronale.
    2. Semina i neuroni ippocampali ottenuti dai ratti E18 Sprague-Dawley direttamente sopra il coverslip in vetro micropatterned ad una densità di 50.000 cellule per cm2 in mezzo neurobasale (NBM) arricchito con il 3% di siero di cavallo. Posizionare i neuroni micropatterned nell'incubatore (37 °C, 5% CO2) per 48 h.
      NOTA: Dopo ~6 ore, i neuroni ippocampali primari possono essere visti aderire ai micropattern laminini.
  3. Co-coltura di cellule staminali GBM umane su neuroni
    NOTA: Per questo studio, le cellule GBM derivate da pazienti con membrana GFP e pomodoro nucleare sono state coltivate secondo i precedenti protocollipubblicati 10.
    1. Man mano che le cellule a forma di sferoide crescono in sospensione, centrifuga la sospensione per 5 minuti a 200 × g. Lavare gli sferoidi con 5 mL di PBS e incubare le cellule con 0,5 mL del reagente di dissociazione cellulare (vedi tabella dei materiali)per 5 minuti a 37 °C.
    2. Aggiungere 4,5 mL di NBM completo (completato con integratore B27, eparina, fattore di crescita dei fibroblasti 2, penicillina e streptomicina, come descrittoin precedenza 8), e contare le cellule utilizzando una tecnica di conteggio automatico.
    3. Semina 1.000 cellule GBM sulla coltura neuronale micropatterned in NBM arricchita con siero di cavallo al 3%. Incubare la piastra a 37 °C, 5% CO2e 95% di umidità.

3. Imaging cellulare vivo

  1. Subito dopo la semina cellulare GBM, posizionare il campione sul palco di un microscopio invertito dotato di camera termostato. Eseguire immagini a celle dal vivo al microscopio dotato di uno stadio motorizzato per la registrazione di più posizioni utilizzando una cassetta degli attrezzi di acquisizioni multidimensionali nel software. Acquisire immagini GFP/Pomodoro a campo luminoso ed epifluorescenza ogni 5 minuti su 12 h con un obiettivo 20x in un ambiente di temperatura (37 °C) e controllato a gas (5% CO2).

4. Analisi delle immagini

NOTA: utilizzando fiji, lo stack di immagini bidimensionale (2D) è stato pre-elaborato o elaborato semi-automaticamente utilizzando uno strumento fatto in casa e intuitivo (disponibile a questo indirizzo: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), che è scritto in linguaggio macro IJ1 (Figura 2A). Il flusso di lavoro e le procedure automatizzate sono riassunti nella figura 2B.

  1. Analisi della rete neuronale (Figura 2Bi)
    1. Selezionare un'immagine dello stack. Fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento Rete per aprire la finestra di dialogo Opzioni corrispondente e regolare le impostazioni (ad esempio, Soglia = Triangolo, Li, Huang..., Sfocatura gaussianae Filtri mediani = 1, 2, 3...) per produrre una segmentazione precisa delle immagini. Quindi, fare clic su OK.
    2. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sullo strumento Rete per attivare automaticamente la procedura seguente.
      1. Duplicare l'immagine selezionata e dividerla in tre canali di colore (Rosso-Grigio-Verde).
      2. Selezionate il canale grigio (campo luminoso) ed eseguire il miglioramento dell'estensione di contrasto (CSE) per migliorare la separazione tra aree diverse. Utilizzate il rilevatore di spigoli Sobel (SED) per eseguire l'operazione di convoluzione di elaborazione del segnale 2D già raggruppata sotto il comando Trova spigolo (Find Edge).
      3. Per il doppio filtraggio (F), applicate una sfocatura gaussiana e un filtro mediano per ridurre il rumore e smussare il segnale dell'oggetto. Converti in maschera (CM) eseguendo algoritmi di soglia adattati per ottenere un'immagine binaria (BIN-grey) con pixel neri (area cella) e pixel bianchi (sfondo). Scheletrare (Sk) l'area cellulare in una rete semplice (NET) e filtrare le particelle (EP) in un'immagine NET rimuovendo piccole particelle non in rete.
      4. Per i canali rosso e verde (nucleo e membrana), eseguire il doppio filtraggio, convertire in Maschera utilizzando il metodo di soglia adattato e consentire a BIN-green di determinare la morfologia delle cellule con il comando Analizza particelle.
      5. Unisci tutti i canali usando la loro regione di interesse (ROI) con l'operatore OR (combine) e riadatta il colore iniziale in una semplice immagine RGB.
  2. Analisi della motilità a cella singola (Figura 2Bii)
    1. Fate clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento Rilevamento celle singole (Single Cell Tracking) per aprire la finestra di dialogo Opzioni corrispondente e regolate le impostazioni (ad esempio, Tipo trail = Nucleo o Membrana, Soglia = Triangolo, Li, Huang..., Proiezione Z = Intensità massima, Fette sommate..., Sfocatura gaussiana e Filtri mediani = 1, 2, 3...) per produrre una segmentazione precisa delle immagini. Quindi, fare clic su OK.
    2. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sullo strumento Rilevamento celle singole per attivare automaticamente la procedura seguente.
      1. Rimuovere il canale grigio. Applicare una proiezione Z sullo stack, che genererà un'immagine corrispondente a uno stack di immagini in base all'ora (T-stack). Filtrare due e convertire in Maschera le tracce lasciate dalle celle. Rimuovere piccole particelle nell'immagine BIN-rosso/verde.
      2. Utilizzando il ROI, selezionare ogni contorno della traccia di cella e selezionare la casella Ignora rilevamento bordi nella finestra di dialogo Opzioni per ignorare questo passaggio di pre-elaborazione per i passaggi successivi.
      3. Isolare il canale rosso (Tipo trail = Nucleo) nella pila originale. Selezionare un ROI e rimuovere l'area esterna. Filtrare due ruote tutte le immagini e convertirsi in Maschera (rosso BIN). Determinare la posizione X/Y baricentro di ogni nucleo binarizzato.
    3. Utilizzando una macro già pubblicata per il software per foglidi calcolo 13, calcolare lo spostamento quadrato medio, il rapporto direzionalità e la velocità media per questa cella.
  3. Analisi del tracciamento a più celle (Figura 2Biii)
    1. Fate clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento Tracciamento (Tracking) per aprire la finestra di dialogo Opzioni corrispondente e regolare le impostazioni (ad esempio, Soglia = Triangolo, Li, Huang..., Sfocatura gaussiana e Filtri mediani = 1, 2, 3...) per produrre una segmentazione precisa delle immagini. Quindi, fare clic su OK.
    2. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sullo strumento Rilevamento per attivare automaticamente la procedura seguente.
      1. Rimuovere il canale grigio.
      2. Dividere i canali rosso e verde, filtrare due e convertire in Mask.
      3. Unisci i canali usando Image Calculator... comando con l'operatore AND, lasciando solo il segnale del nucleo trovato nelle membrane.
        NOTA: Diversi plugin nelle Figi possono essere utilizzati per determinare la posizione X/Y di diverse celle in questa immagine binaria pre-e-elaborazione contemporaneamente (vedere la Tabella dei Materiali).
    3. Utilizzando una macro13 descritta in precedenza, calcolare il plottaggio della traiettoria, lo spostamento quadrato medio, il rapporto direzionalità e la velocità media per queste celle.
  4. Migrazione sferoide sul tappetino neurale (Figura 2Biv)
    1. Fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento Migrazione per aprire la finestra di dialogo Opzioni corrispondente e regolare le impostazioni (ad esempio, Soglia = Triangolo, Li, Huang..., Sfocatura gaussiana e Filtri mediani = 1, 2, 3...) per produrre una segmentazione precisa delle immagini. Quindi, fare clic su OK.
    2. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sullo strumento Di migrazione per attivare automaticamente la procedura seguente.
      1. Rimuovere il canale rosso.
      2. Dividi i canali verde e grigio.
      3. Per il canale grigio, disegnare manualmente il contorno del tappetino neuronale e misurarne l'area.
      4. Per il canale verde, filtrare due filtri e convertire in Mask. Rimuovere l'area esterna al modello (BIN) e determinare l'area della cella binarizzata per ogni immagine.
        NOTA: I parametri sopra descritti vengono calibrati modificandone i valori facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sull'icona di interesse. Questa elaborazione può essere eseguita manualmente. Tuttavia, per un gran numero di immagini (circa un centinaio per acquisizioni), canali (generalmente 3 canali) e fasi di elaborazione, sarebbe preferibile uno strumento automatizzato o semi-automatizzato.

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Risultati

I neuroni modellati co-coltivati con cellule GBM fluorescenti sono stati preparati come descritto nella sezione del protocollo e sono stati eseguiti esperimenti di tracciamento. Le cellule GBM hanno rapidamente modificato la loro forma durante la migrazione sui neuroni (Figura 1B: pannello 6 e Video 1). Le cellule migrarono lungo le estensioni neuronali, in un movimento casuale (Video 1). Le cellule GBM fluorescenti e i neuroni non fluoresce...

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Discussione

I glioblastomi invadono ampiamente il parenchima usando diverse modalità: co-opzione dei vasi sanguigni circostanti, invasione interstiziale o invasione sulleRM 18. Quest'ultima modalità non è ben caratterizzata in letteratura a causa della difficoltà di trovare modelli adatti in vitro o in vivo relativi all'invasione WMT. Qui, è stato proposto un modello semplificato in cui i neuroni roditori coltivati sono stati modellati su superfici rivestite di laminina, e le cellule fluores...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole è supportato da Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon è un destinatario di una borsa di studio presso l'ospedale universitario di Tolosa (CHU Toulouse).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
(3-amminopropil) trietossisilanoSigma440140-100MLIl gruppo amminico è utile per la bioconiugazione di mPEG-SVA
96-well round-bottom plateSarstedt2582624Utilizzato per preparare sferoidi
AccutaseGibcoA11105-01Conservato a -20 ° C (a lungo termine) o 4 gradi C (a breve termine), enzima di dissociazione della sfera
B27Gibco12587Conservato a -20 ° C, scongelare prima dell'uso
Fattore di crescita dei fibroblasti di basePeprotech100-18BConservato a -20 ° C, scongelare prima dell'uso
Countess Cell Counting ChamberSlidesInvitrogenC10283Utilizzato per il conteggio delle cellule
Vetrini coprioggettiMarienfeld111580Substrato per colture cellulari
Cartucce essiccantiSigmaZ363456-6EAUtilizzato per ridurre la mostura durante il trattamento con (3-aminopropil) trietossisilano
DPBS 10xPan BiotechP04-53-500Conservato a 4 ° C
Fiji software, MTrack2 macroImageJUtilizzato per analizzare le immagini
Pallone 75 cm²Falcon10497302
HBSSSigmaH8264-500ML
Eparina sodicaSigmaH3149-100KUConservato a 4 gradi C
Laminin114956-81-9Promuove l'adesione neuronale
Caricamento del softwaredei micropattern previsti
MetaMorph SoftwareMolecular Devices LLCNASoftware di automazione per microscopia
MetilcellulosaSigmaM0512Diluito in NBM per una concentrazione finale del 2%
Terreno neurobasaleGibco21103-049Conservato a 4 gradi; C
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)microscopio invertito dotato di tavolino motorizzato 
Penicillina - StreptomicinaGibco15140-122Conservato a 4 gradi C
PLPPAlveoloPLPPclassic_1mlFotoiniziatore utilizzato per degradare la spazzola PEG
Poli(glicole etilenico)-succinimidil valerato (mPEG-SVA)Laysan BioVA-PEG-VA-5000-5gUtilizzato come rivestimento antivegetativo
PRIMOAlveolePRIMO1Dispositivo digitale a microspecchi (DMD) Apparecchio di proiezione UV Blu
di tripano 0,4%ThermoFisherT10282Utilizzato per il conteggio delle cellule
Tripsina-EDTASigmaT4049-100MLUtilizzato per staccare le cellule aderenti
Leonardo

Riferimenti

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