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Articolo metodologico

Rilevazione di glicosaminoglicani mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide e colorazione dell'argento

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DOI:

10.3791/62319

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25 febbraio 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Medical Scientist Training Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Chemistry and Chemical Biology, Rensselaer Polytechnic Institute, 4Department of Health Sciences, Curtin University, 5Department of Medicine, Denver Health Medical Center

In questo articolo

Sommario

Questo rapporto descrive le tecniche per isolare e purificare i glicosaminoglicani solfati (GAG) da campioni biologici e un approccio di elettroforesi su gel di poliacrilammide per approssimarne le dimensioni. I GAG contribuiscono alla struttura dei tessuti e influenzano i processi di segnalazione attraverso l'interazione elettrostatica con le proteine. La lunghezza del polimero GAG contribuisce alla loro affinità di legame per i ligandi affini.

Abstract

I glicosaminoglicani solfati (GAG) come l'eparina solfato (HS) e il solfato di condroitina (CS) sono onnipresenti negli organismi viventi e svolgono un ruolo fondamentale in una varietà di strutture e processi biologici di base. Come polimeri, i GAG esistono come una miscela polidispersa contenente catene di polisaccaridi che possono variare da 4000 Da a ben oltre 40.000 Da. All'interno di queste catene esistono domini di solfatazione, che conferiscono un modello di carica negativa che facilita l'interazione con residui caricati positivamente di ligandi proteici affini. I domini solfatati dei GAG devono essere di lunghezza sufficiente per consentire queste interazioni elettrostatiche. Per comprendere la funzione dei GAG nei tessuti biologici, lo sperimentatore deve essere in grado di isolare, purificare e misurare le dimensioni dei GAG. Questo rapporto descrive una tecnica pratica e versatile basata sull'elettroforesi su gel di poliacrilammide che può essere sfruttata per risolvere differenze di dimensioni relativamente piccole tra i GAG isolati da una varietà di tipi di tessuto biologico.

Introduzione

I glicosaminoglicani (GAG) sono una famiglia diversificata di polisaccaridi lineari che sono un elemento onnipresente negli organismi viventi e contribuiscono a molti processi fisiologici di base1. GAG come eparina solfato (HS) e condroitin solfato (CS) possono essere solfatati in posizioni distinte lungo la catena dei polisaccaridi, impartendo domini geografici di carica negativa. Questi GAG, quando legati a proteine della superficie cellulare note come proteoglicani, si proiettano nello spazio extracellulare e si legano a ligandi affini, consentendo la regolazione dei processi di segnalazione cis- (ligando attaccato alla stessa cellula) e trans- (ligando attaccato alla cellula vicina)2. Inoltre, i GAG svolgono anche ruoli critici come elementi strutturali in tessuti come la membrana basale glomerulare3,il glicocalyx4 endoteliale vascolare e il glicocalyx epiteliale polmonare5e nei tessuti connettivi come la cartilagine6.

La lunghezza delle catene di polisaccaridi GAG varia sostanzialmente a seconda del suo contesto biologico e può essere dinamicamente allungata, scissa e modificata da un sistema di regolazione enzimatico altamente complesso7. È importante sottolineare che la lunghezza delle catene polimeriche GAG contribuisce in modo sostanziale alla loro affinità di legame per i ligandi e, successivamente, alla loro funzione biologica8,9. Per questo motivo, la determinazione della funzione di un GAG endogeno richiede l'apprezzamento delle sue dimensioni. Sfortunatamente, a differenza delle proteine e degli acidi nucleici, esistono pochissime tecniche prontamente disponibili per rilevare e misurare i GAG, il che ha storicamente portato a un'indagine relativamente limitata sui ruoli biologici di questa diversa famiglia di polisaccaridi.

Questo articolo descrive come isolare e purificare i GAG dalla maggior parte dei tessuti biologici e, inoltre, descrive come utilizzare l'elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) per valutare la lunghezza dei polimeri isolati con un discreto grado di specificità. A differenza di altri approcci glicemici altamente complessi (e spesso basati sulla spettrometria di massa), questo metodo può essere impiegato utilizzando apparecchiature e tecniche di laboratorio standard. Questo approccio pratico può, quindi, espandere la capacità degli investigatori di determinare il ruolo biologico dei GAG nativi e la loro interazione con ligandi contestualmente importanti.

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Protocollo

Tutti i campioni biologici analizzati in questo protocollo sono stati ottenuti da topi, secondo protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Colorado.

1. Isolamento del solfato di eparina

  1. Delipidazione di campioni di tessuto
    NOTA: La delipidazione è un passaggio facoltativo per i tessuti ricchi di grasso.
    1. Fare una miscela 1: 1 di metanolo e diclorometano. Preparare circa 500 μL per campione; pezzi di tessuto più grandi possono richiedere fino a 1 ml.
    2. Posizionare ogni campione di tessuto in un piccolo contenitore di vetro con un coperchio per la delipidazione.
      NOTA: La massa del campione può variare in base al tessuto di interesse e alle esigenze sperimentali. 50 mg o meno sono in genere sufficienti per un'adeguata resa GAG, ma una certa ottimizzazione può essere richiesta dall'utente finale.
    3. Aggiungere 500 μL della soluzione di metanolo:diclorometano a ciascun contenitore di vetro e mescolare. Assicurarsi che tutti i campioni di tessuto solido siano completamente immersi nel solvente.
      NOTA: utilizzare pipette sierologiche o tubi conici di plastica per miscelare e maneggiare la soluzione di metanolo/diclorometano; altre materie plastiche possono dissolversi.
    4. Posizionare i campioni su uno shaker (in un rack fissato) in una cappa chimica e agitare delicatamente per 1 ora.
    5. Agitare i campioni per mescolare e centrifugare a 17.000 x g per 5 minuti a 4 °C.
    6. Pipettare con cura la frazione organica del solvente (surnatante). Questa è la frazione lipidica - non contiene GAG e può essere scartata.
      NOTA: Cerca di non disturbare il tessuto poiché piccoli pezzi potrebbero andare persi. È preferibile lasciare parte dello strato organico nel contenitore del campione, piuttosto che rischiare la perdita del campione.
    7. Lasciare aperto il coperchio del contenitore di vetro e lasciarlo evaporare per una notte nel cofano. Cambia il tubo per il passaggio successivo poiché quei tubi non sopravviveranno a un'ulteriore elaborazione.
    8. Una volta che la miscela di solvente è completamente evaporata, procedere alla disintegrazione meccanica (se il campione residuo è >50 mg) o alla digestione dell'Actinasi E (< 50 mg).
  2. Disintegrazione meccanica del tessuto solido (opzionale; per campioni di tessuto più grandi)
    NOTA: La maggior parte dei pezzi più piccoli di tessuto solido (circa 50 mg o meno) dovrebbe dissolversi completamente durante la fase di digestione. Tuttavia, campioni più grandi richiederanno la disintegrazione meccanica.
    1. Flash-freeze campioni di interesse posizionandoli in un tubo di polipropilene di dimensioni appropriate e posizionando il tubo chiuso in azoto liquido. Lasciare che il campione si congeli fino a completo solidità.
    2. Usando un mortaio pulito e un pestello, macinare i campioni congelati in una consistenza simile alla polvere.
    3. Procedere direttamente alla digestione dell'Actinasi E (Fase 1.4).
  3. Dissaliziazione e concentrazione del campione
    NOTA: questa è una fase facoltativa e richiesta solo per i campioni di tessuto liquido diluito (ad esempio, liquido di lavaggio bronco-alveolare (BALF) o plasma).
    1. Raggruppare campioni liquidi in gruppi sperimentali appropriati (ad esempio, per replica biologica o gruppo sperimentale)
    2. Posizionare il volume totale del campione in una colonna filtrante centrifuga da 500 μL con un cut-off a peso molecolare (MWCO) di 3.000 Da.
    3. Girare per 30 minuti a 14.000 x g a temperatura ambiente. Ripetere se necessario se il volume del campione desiderato supera la capacità della colonna del filtro centrifugo.
    4. Lavare ogni colonna 3 volte con 400 μL di acqua deionizzata e filtrata. Scartare il flusso attraverso.
    5. Invertire il filtro e ruotare per 1 minuto a 2.000 x g in tubi di raccolta freschi e opportunamente etichettati. Congelare a -80 °C o procedere al passaggio successivo.
  4. Actinasi E digestione
    NOTA: questo passaggio è necessario per digerire e infine rimuovere i contaminanti proteici dal campione.
    1. Mescolare i campioni 1:1 con Actinase E ricombinante alla concentrazione desiderata di 10 mg/ml. Aggiungere il volume appropriato di 10x concentrato tampone di digestione. Concentrazione finale desiderata: 0,005 M acetato di calcio e 0,01 M acetato di sodio, pH 7,5. Ad esempio: 190 μL di campione liquido, 190 μL di Actinasi E da 20 mg/mL, 20 μL da 0,05 M acetato di calcio, 0,1 M acetato di sodio.
    2. Agitare delicatamente i campioni per mescolare, quindi digerire per 48-72 ore a 55 °C (fino a 7 giorni per il tessuto intero).
    3. Riscaldare a 80 °C per 15-20 minuti per riscaldare l'inattivazione dell'Actinasi E.
    4. Congelare il campione a -80 °C o continuare con il punto 1.5.
  5. Dissaliziazione e concentrazione del campione
    NOTA: Se nel campione biologico è prevista una bassa massa del GAG di interesse, o se è auspicabile la conservazione dei reagenti consumabili (cioè colonne di filtro centrifugo), i campioni possono essere raggruppati per produrre un singolo concentrato per gruppo sperimentale (ad esempio, per replica biologica o gruppo sperimentale).
    1. Posizionare il volume totale del campione in una colonna filtrante centrifuga da 500 μL con un MWCO di 3.000 Da.
    2. Girare per 30 minuti a 14.000 x g a temperatura ambiente. Ripetere se necessario, se il volume di campione desiderato supera la capacità della colonna del filtro centrifugo.
    3. Lavare ogni colonna 3 volte con 400 μL di acqua deionizzata e filtrata. Scartare il flusso attraverso.
    4. Invertire il filtro e ruotare per 1 minuto a 2.000 x g in tubi di raccolta freschi e opportunamente etichettati (generalmente inclusi con le colonne del filtro centrifugo). Congelare a -80 °C o procedere al passaggio successivo.
  6. Essiccazione
    1. Posizionare i campioni disciolti dal punto 1.5.5 in un concentratore a vuoto rotazionale durante la notte o liofilizzare i campioni come descritto di seguito.
    2. Congelare accuratamente i campioni durante la notte a -80 °C o immergendo in azoto liquido.
    3. Forare i coperchi del campione con un ago da 18 G e posizionare nella camera del liofilizzatore. Aggiungere asciugamani di carta per l'imballaggio secondo necessità.
    4. Fissare la camera del liofilizzatore al liofilizzatore e liofilizzatore durante la notte (almeno -40 °C, 0,135 Torr)
  7. Colonna di scambio cationico
    1. Campioni essiccati in soluzione essiccata fino a 400 μL di urea 8 M, soluzione CHAPS al 2% (o, se si accumulano campioni, riconsegregati fino a un massimo di (400/n) μL, dove n = il numero di campioni nel pool desiderato. Utilizzare il minor numero possibile di soluzione detergente.
    2. Equilibrare la colonna di scambio cationico (IEX) con 400 μL di urea 8 M, soluzione CHAPS al 2%. Girare per 5 minuti a 2.000 x g a temperatura ambiente.
    3. Caricare 400 μL di campioni/campioni raggruppati nella colonna IEX. Girare per 5 minuti a 2.000 x g.
    4. Lavare 3x con 400 μL di 8 M di urea, soluzione CHAPS al 2%. Gira per 5 minuti a 2.000 x g ogni volta.
    5. Elute 3x con 400 μL di 0,2 M NaCl. Girare per 5 minuti a 2.000 x g ciascuno. Questa è la frazione a bassa affinità - questa può essere conservata per scopi di controllo qualità, se lo si desidera.
    6. Elute 3x con 400 μL di 2,7 M (16%) NaCl. Girare per 5 minuti a 2.000 x g ciascuno. Questa frazione conterrà i glicosaminoglicani isolati di interesse - tienilo tutto!
    7. Per dissalare ogni frazione eluita, aggiungere metanolo fino all'80 vol% e incubare a 4 °C durante la notte. Ruotare ogni campione per 5 minuti a 2.000 x g. Recuperare il residuo solido in quanto questo viene essiccato glicosaminoglicano disasato.
      NOTA: in alternativa, saltare questo passaggio e procedere al passaggio 1.8 per disacrosare l'eluato senza metanolo.
  8. Dissaliziazione e concentrazione del campione
    1. Se necessario, raggruppare le frazioni eluite (da 1.7.6) in gruppi sperimentali appropriati (ad esempio, per replica biologica o gruppo sperimentale).
    2. Posizionare il volume totale del campione in una colonna filtrante centrifuga da 500 μL con un MWCO di 3.000 Da.
    3. Girare per 30 minuti a 14.000 x g a temperatura ambiente. Ripetere se necessario, se il volume di campione desiderato supera la capacità della colonna del filtro centrifugo.
    4. Lavare ogni colonna 3 volte con 400 μL di acqua deionizzata e filtrata. Scartare il flusso attraverso. Procedere direttamente al passaggio 1.9.
  9. Digestione della condroitina
    NOTA: lo scopo di questo passaggio è rimuovere i GAG non di interesse per l'utente finale. In questo caso, la condroitinasi viene utilizzata per rimuovere la condroitina. Nei tessuti utilizzati per generare risultati rappresentativi (liquido di lavaggio bronco-alveolare e polmone intero), la digestione del solfato di condroitina lascia eparina solfato come gag residuo primario. Gli utenti finali potrebbero dover aggiungere ulteriori fasi di digestione a seconda dei loro obiettivi sperimentali.
    1. Caricare 350 μL di tampone di digestione (50 mM di acetato di ammonio con 2 mM di cloruro di calcio regolato a pH 7,0) sulla colonna del filtro centrifugo senza toccare la membrana.
    2. Aggiungere 5 μL di condroitinasi ABC ricombinante.
    3. Posizionare la provetta dei campioni in un forno a 37 °C e incubare per 1 ora.
    4. Capovolgere la colonna e posizionare in tubi di raccolta opportunamente etichettati. Girare per 1 min a 2000 x g.
    5. Riscaldare i campioni a 80 °C per 15-20 minuti per inattivare la condroitinasi ABC.
  10. Dissaliziazione e concentrazione del campione
    1. Se necessario, raggruppare i campioni di condroitina digeriti dal passo 1.9.5 in gruppi sperimentali appropriati (ad esempio, per replica biologica o gruppo sperimentale)
    2. Posizionare il volume totale del campione in una colonna filtrante centrifuga da 500 μL con un MWCO di 3.000 Da.
    3. Girare per 30 minuti a 14.000 x g a temperatura ambiente. Ripetere se necessario se il volume del campione desiderato supera la capacità della colonna del filtro centrifugo.
    4. Lavare ogni colonna 3 volte con 400 μL di acqua deionizzata e filtrata. Scartare il flusso attraverso.
    5. Invertire il filtro e ruotare per 1 minuto a 2.000 x g in tubi di raccolta freschi e opportunamente etichettati. Congelare a -80 °C o procedere al passaggio successivo.
  11. Essiccazione
    NOTA: in questa fase, l'essiccazione è necessaria in modo che i campioni possano essere risuscisi nella minor quantità possibile di acqua e tampone corrente.
    1. Posizionare i campioni digeriti di condroitina dal punto 1.10.5 direttamente in un concentratore di vuoto rotazionale durante la notte o liofilizzare come segue:
    2. Congelare accuratamente i campioni durante la notte a -80 °C o immergendo in azoto liquido.
    3. Forare i coperchi del campione con un ago da 18 G e posizionare nella camera del liofilizzatore. Aggiungere asciugamani di carta per l'imballaggio secondo necessità.
    4. Fissare la camera del liofilizzatore al liofilizzatore e liofilizzatore durante la notte (almeno 40 °C, 0,135 Torr)

2. Elettroforesi su gel di poliacrilammide di glicosaminoglicani isolati e purificati

  1. Preparare in anticipo le soluzioni necessarie per l'elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) (Tabella 1).
    NOTA: Selezionare la percentuale di acrilammide della soluzione di gel risolutivo in base alle dimensioni dei glicosaminoglicani che si prevede siano nel campione. Il 15% è raccomandato per la risoluzione di frammenti più grandi (più di 30 subunità disaccaridi in lunghezza); 22% per frammenti più piccoli (<20 subunità di disaccaridi in lunghezza).
  2. Inserire la cassetta vuota nel serbatoio PAGE. Gettare il gel risolutivo come segue: In un tubo da 15 mL, mescolare 10 mL di soluzione di gel risolutivo, 60 μL di persolfato di ammonio al 10% (deve essere preparato al momento) e 10 μL di TEMED (aggiungere TEMED per ultimo). Capovolgere delicatamente il tubo 2-3x. Utilizzare la pipetta per aggiungere rapidamente la soluzione di 10 ml di cui sopra alla cassetta. Sovrapporre con 2 ml di acqua deionizzata e filtrata e lasciare polimerizzare il gel risolutivo per 30 min.
    NOTA: il seguente protocollo PAGE è stato ottimizzato per un sistema PAGE verticale che utilizza cassette di fusione spesse 13,3 x 8,7 cm (larghezza x lunghezza) 1,0 mm con un volume totale di circa 12 ml. Altri sistemi di cassette possono essere utilizzati, ma possono richiedere l'ottimizzazione da parte dell'utente finale.
  3. Dopo che il gel risolutivo si è completamente polimerizzato, scartare l'acqua sovrapposta e gettare il gel impilante come segue: in un tubo da 15 ml, mescolare 3 mL della soluzione di gel impilante, 90 μL di persolfato di ammonio al 10% (deve essere preparato al momento), 3 μL di TEMED (aggiungere TEMED per ultimo).
  4. Capovolgere delicatamente il tubo 2-3x. Utilizzare una pipetta per aggiungere rapidamente la soluzione di gel impilabile sul gel risolutivo solidificato; riempire la cassetta fino all'orlo. Pettine completamente inserito incluso con il set-up. Lasciare polimerizzare il gel impilante per 30 minuti.
  5. Una volta che il gel si è polimerizzato, assicurarsi che la striscia di nastro venga rimossa dal fondo della cassetta e riporre la cassetta nel gruppo del serbatoio PAGE.
  6. Riempire le camere superiore e inferiore con il buffer della camera superiore e inferiore, rispettivamente.
  7. Sciogliere i campioni essiccati dal punto 1.11.4 nel volume minimo necessario di acqua deionizzata e filtrata (al massimo, il 50% del volume dei pozzi nel gel PAGE). Mescolare 1:1 con il buffer di caricamento del campione. Caricare i campioni e le "scale" oligosaccaridiche HS (vedi Tabella 1) nel gel.
  8. Pre-eseguire il gel per 5 minuti a 100 V. Quindi eseguire il gel a 200 V per 20-25 minuti (per un gel risolutivo poliacrilammide al 15%), 40-50 minuti (per un gel risolutivo poliacrilammide al 18%), 90-100 minuti (per gel risolutivo poliacrilammide al 22%).
    NOTA: potrebbe essere necessaria una certa ottimizzazione del tempo di esecuzione di 200 V. Il rosso fenolo migra davanti agli oligosaccaridi dell'eparina che sono 2 subunità polimeriche di lunghezza (cioè grado di polimerizzazione 2 o dp2); bromophenol blue migra davanti a dp10-dp14. I migliori risultati si ottengono quando la tensione viene applicata in modo tale che la banda rossa fenole migri quasi, ma non del tutto, sul fondo del gel. Regola il tempo di esecuzione di conseguenza.

3. Protocollo di colorazione dell'argento

  1. Preparare in anticipo tutte le soluzioni necessarie per la colorazione dell'argento (Tabella 2).
    NOTA: non toccare direttamente il gel PAGE fino a quando non è stato macchiato, sviluppato e posto in soluzione di arresto. Invece, manipola il gel usando strumenti di plastica o vetro puliti. Maneggiare direttamente il gel comporterà distorsioni dell'impronta digitale e altri artefatti visibili sul gel dopo la colorazione.
  2. Una volta completata la corsa, smontare la cassetta ed estrarre il gel in un contenitore pulito, medio-grande, riempito con acqua deionizzata e filtrata.
    NOTA: per evitare di maneggiare direttamente il gel, utilizzare la punta della pipetta o altro oggetto di plastica per staccare delicatamente il gel dalla cassetta mentre è immerso in acqua. Il gel può essere fragile - maneggiare con attenzione.
    1. Scartare l'acqua. Macchiare il gel in soluzione di colorazione blu Alcian per 5 minuti.
    2. Scartare la macchia blu alcian. Risciacquare/lavare rapidamente 2-3 volte con acqua deionizzata e filtrata fino a quando la maggior parte della soluzione colorante blu Alcian non è stata rimossa.
    3. Lasciare smacchiare in acqua deionizzata e filtrata per una notte sul bilanciere. Assicurarsi che vi sia un ampio volume di acqua deionizzata e filtrata per garantire che qualsiasi macchia residua venga completamente lavata via dal gel durante la notte.
    4. Gel di lavaggio in metanolo al 50% (40 min totali, cambio soluzione 2-3x).
    5. Lavare il gel in acqua deionizzata e filtrata per 30 min. Scartare l'acqua e ripetere altre 3 volte per un totale di 2 ore, sostituendo l'acqua ogni volta.
    6. In un contenitore fresco e pulito, macchiare il gel per 30 minuti in soluzione colorante di nitrato d'argento.
    7. Risciacquare / lavare rapidamente 2-3 volte in acqua deionizzata e filtrata per rimuovere completamente la soluzione colorante all'argento.
    8. Lavare per 30 minuti in acqua deionizzata e filtrata. Scartare l'acqua e ripetere 2 volte per un totale di 90 minuti, sostituendo ogni volta il bagno d'acqua.
    9. Scartare l'acqua e aggiungere la soluzione in via di sviluppo.
    10. Una volta aggiunta la soluzione di sviluppo, osservare attentamente il gel e osservare l'aspetto delle fasce. A seconda della qualità della macchia e della massa del campione caricato, lo sviluppo può richiedere da pochi secondi a diversi minuti.
    11. Non appena le bande desiderate sono visibili, scartare immediatamente la soluzione di sviluppo e lavare brevemente con la soluzione di arresto.
    12. Scartare la soluzione di arresto lavare e sostituirla con una soluzione di arresto fresco. Lasciare in ammollo per 1 ora su un bilanciere o shaker.
    13. Lavare in acqua deionizzata e filtrata durante la notte (tuttavia, il gel può essere ripreso immediatamente dopo aver interrotto il lavaggio con soluzione).

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Risultati

Il blu alciano è usato per macchiare i GAG solfati 10; questo segnale è amplificato dall'uso di una successiva macchia d'argento 11. La Figura 1 fornisce una dimostrazione visiva del processo di sviluppo della colorazione dell'argento. Come dimostrato, il segnale blu di Alcian che rappresenta i GAG separati dall'elettroforesi viene amplificato quando l'agente in via di sviluppo penetra nel gel di poliacrilammide. In genere, il processo di svilu...

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Discussione

I GAG svolgono un ruolo centrale in molti processi biologici diversi. Una delle funzioni principali dei GAG solfati (come HS e CS) è quella di interagire e legarsi ai ligandi, che possono alterare le funzioni di segnalazione a valle. Un importante determinante dell'affinità di legame GAG ai ligandi affini è la lunghezza della catena polimerica GAG 8,9,14. Per questo motivo, è importante che i ricercatori siano in grado di defini...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato da F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL ed EPS)

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Accuspin Micro17 microcentrifuga da bancothermoFisher Scientific13-100-675Qualsiasi combinazione di microcentrifuga da banco/rotore in grado di raggiungere 14000 xG è appropriata
Acrilammide (solido)thermoFisher ScientificBP170-100Grado di elettroforesi
Actinasi ESigma AldrichP5147Miscela di proteasi da S. griseus
Alcian Blue 8GX (solido)thermoFisher ScientificAC400460100
Acetato di ammonio (solido)thermoFisher ScientificA639-500Grado di biologia molecolare
Idrossido di ammonio (liquido)thermoFisher ScientificA669S-500certificato ACS
Persolfato di ammonio (solido)thermoFisher ScientificBP179-25grado di elettroforesi
Barnstead GenPure Pro Water Sistema di purificazioneThermoFisher Scientific10-451-217PKGQualsiasi sistema di deionizzazione/purificazione dell'acqua è un sostituto accettabile
Acido borico (solido)thermoFisher ScientificA73-500Grado di biologia molecolare
Blu di brofenolo (solido)thermoFisher ScientificB392-5
Acetato di calcio (solido)ThermoFisher Scientific18-609-432Cloruro
calcio (solido)ThermoFisher ScientificAC349610250per biologia molecolare
(3-((3-colamidopropil)-1-propansulfonato)ThermoFisher Scientific28299
Condroitinasi ABCSigma AldrichC3667
Cassetta vuota Criterion per PAGE (spessore 1,0 mm, 12+2 pozzetti)Bio-Rad3459901Qualsiasi sistema a cassetta di colata PAGE di 1,0 mm di spessore sarà sufficiente
Criterion PAGE Cell system (cella e alimentatore)Bio-Rad1656019qualsiasi sistema PAGE su gel verticale comparabile funzionerà)
Diclorometano (liquido)thermoFisher ScientificAC610931000certificato ACS
EDTA sale disodico (solido)thermoFisher Scientific02-002-786Molecular grado biologico
Acido acetico glaciale (liquido)thermoFisher ScientificA35-500Certificato ACS
Glicina (solido)thermoFisher ScientificG48-500Grado di elettroforesi
Eparanasi I/IIISigma AldrichH3917Da Flavobacterium heparinum
Decasaccharide derivato dall'eparina (dp10)galen scientificHO10
Eparina derivato esasaccabro (dp6)Galeno scientificoHO06
Eparina derivato oligosaccaride (dp20)galenico scientificoHO20
Acido cloridrico (liquido)thermoFisher ScientificA466-250
LiofilizzanteLabconco7752020Qualsiasi liofilizzatore in grado di raggiungere -40C e 0,135 Torr funzionerà; può anche essere sostituito con concentratore a vuoto rotazionale
Metanolo (liquido)thermoFisher ScientificA412-500Certified ACS
Molecular Imager Gel Doc XR SystemBio-Rad170-8170Qualsiasi sistema di imaging su gel comparabile è un sostituto accettabile
N,N'-metilene-bis-acrilammide (solido)thermoFisher ScientificBP171-25Grado di elettroforesi
Rosso fenolo (solido)thermoFisher ScientificP74-10Colonna
scambio ionico Q Mini HVivapureVS-IX01QH24deve avere un volume di carico minimo di 0,4 ml, un pH di lavoro di 2-12 e selettività per gruppi ionici con pKa di 11
Nitrato d'argento (solido)ThermoFisher ScientificCertificato S181-25
ACS Acetato di sodio (solido)ThermoFisher ScientificS210-500Grado di biologia molecolare
Cloruro di sodio (solido)thermoFisher ScientificS271-500Grado di biologia molecolare
Idrossido di sodio (solido)thermoFisher ScientificS392-212
Saccarosio (solido)thermoFisher ScientificBP220-1Grado di biologia molecolare
TEMED (N,N,N',N'-tetrametilendiammina)thermoFisher ScientificBP150-20Elettroforesi Tris
base (solido)thermoFisher ScientificBP152-500di grado di biologia molecolare
, 0,5 ml, 3000 Da taglio del peso molecolareAmiconUFC500324È possibile utilizzare unità filtranti di volume maggiore, a seconda delle dimensioni del campione.
Urea (solida)ThermoFisher Scientific29700
Vacufuge PlusEppendorf22820001Qualsiasi concentratore rotazionale sottovuoto funzionerà; può essere sostituito con liofilizzatore
Unità filtrante sottovuoto, monouso, 0,22uM pori PES, 500mL volumethermoFisher Scientific569-0020Volumi alternativi e materiali filtranti accettabili
di Detergente CHAPS a per acido libero La colonna a scambio ionico Filtri ultra centrifughi

Riferimenti

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