Fette polmonari tagliate con precisione come strumento efficiente per studi ex vivo sulla struttura dei vasi polmonari e sulla contrattilità

Sommario

Qui viene presentato un protocollo per preservare la contrattilità vascolare del tessuto polmonare murino PCLS, risultante in una sofisticata immagine tridimensionale della vascolarizzazione polmonare e delle vie aeree, che può essere conservata fino a 10 giorni che è suscettibile di numerose procedure.

Abstract

La visualizzazione del tessuto polmonare murino fornisce preziose informazioni strutturali e cellulari riguardanti le vie aeree e la vascolarizzazione sottostanti. Tuttavia, la conservazione dei vasi polmonari che rappresenta veramente le condizioni fisiologiche presenta ancora delle sfide. Inoltre, la delicata configurazione dei polmoni murini comporta sfide tecniche nella preparazione di campioni per immagini di alta qualità che preservano sia la composizione cellulare che l'architettura. Allo stesso modo, i saggi di contrattilità cellulare possono essere eseguiti per studiare il potenziale delle cellule di rispondere ai vasocostrittori in vitro, ma questi saggi non riproducono l'ambiente complesso del polmone intatto. In contrasto con questi problemi tecnici, il metodo PCLS (Precision-Cut Lung Slice) può essere applicato come alternativa efficiente per visualizzare il tessuto polmonare in tre dimensioni senza pregiudizi regionali e fungere da modello di contrattilità surrogata dal vivo per un massimo di 10 giorni. Il tessuto preparato utilizzando PCLS ha conservato la struttura e l'orientamento spaziale, rendendolo ideale per studiare i processi patologici ex vivo. La posizione delle cellule endogene tdTomato-labeled in PCLS raccolte da un modello murino tdTomato reporter inducibile può essere visualizzata con successo mediante microscopia confocale. Dopo l'esposizione a vasocostrittori, PCLS dimostra la conservazione sia della contrattilità dei vasi che della struttura polmonare, che può essere catturata da un modulo time-lapse. In combinazione con le altre procedure, come western blot e analisi dell'RNA, PCLS può contribuire alla comprensione completa delle cascate di segnalazione che sono alla base di un'ampia varietà di disturbi e portano a una migliore comprensione della fisiopatologia nelle malattie vascolari polmonari.

Introduzione

I progressi nella preparazione e nell'imaging del tessuto polmonare che preserva i componenti cellulari senza sacrificare la struttura anatomica forniscono una comprensione dettagliata delle malattie polmonari. La capacità di identificare proteine, RNA e altri composti biologici mantenendo la struttura fisiologica offre informazioni vitali sulla disposizione spaziale delle cellule che possono ampliare la comprensione della fisiopatologia in numerose malattie polmonari. Queste immagini dettagliate possono portare a una migliore comprensione delle malattie vascolari polmonari, come l'ipertensione dell'arteria polmonare, se applicate a modelli animali, portando potenzial....

Protocollo

Tutta la cura degli animali era in conformità con le linee guida del Boston Children's Hospital e i protocolli approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee. I topi utilizzati in questo studio sono topi wild type C57/B6 e topi incrociati Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare in anticipo la soluzione tampone fosfato (1x PBS) e la soluzione di agarose al 2% necessaria durante l'esperimento.
   1. Mescolare 2 g di polvere di agarose in 100 ml di acqua autoclavata. Riscaldarlo nel microonde alcuni secondi alla volta fino a quando la soluzione è chiara.
   2. Porre la soluzione a ba....

Risultati

Quando viene aggiunto alle cellule o ai tessuti, il reagente di vitalità viene modificato dall'ambiente riducente del tessuto vitale e diventa rosa / rosso, diventando altamente fluorescente. I cambiamenti di colore rappresentativi rilevati dal giorno 0-1 e dal giorno 9-10 sono dimostrati nella Figura 3. Come notato, la soluzione è iniziata blu e si è trasformata in rosa durante la notte, dimostrando vitalità. Il cambiamento di colore si verifica in genere entro 1-4 ore; tuttavia, potrebbe e.......

Discussione

In questo manoscritto, viene descritto un metodo avanzato per produrre immagini ad alta risoluzione del tessuto polmonare murino che preserva la struttura vascolare e ottimizza la flessibilità sperimentale, in particolare utilizzando l'applicazione di PCLS per ottenere microslice di tessuto polmonare che possono essere visualizzate in tre dimensioni con contrattilità preservata della vascolarizzazione. Utilizzando il reagente di vitalità, il protocollo dimostra che le fette accuratamente preparate e conservate possono ma.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,5 cc di eparina frazionata in siringa	BD	100 unità USP per mL
1X PBS	Corning	21-040-CM
20 1/2 pollice gauge aghi con estremità smussata per incannulamento della trachea	Cml Supply	90120050D
Siringa da 30 cc	BD	309650
Anti soluzione	Gibco	15240096
Microtomo a lama vibrante automatizzato		VT1200S
Reagente per la vitalità cellulare (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Confocale	Zeiss	880
Dulbecco' s Modified Eagle Medium e GLutaMAX, integrati con il 10% di FBS, l'1% di Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endotelina-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Mortaio e pestello	Amazon
RIPA tampone di lisi ed estrazione	Thermoscientific	89900
Sutura chirurgica 6/0	FST	18020-60
Reagente TRIzol	Invitrogen, Thermofisher	15596026
Agarosio ultrapuro a basso punto di fusione	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Set per la raccolta del sangue alato (ago a farfalla) 25-30G	BD	25-30G

Leica