Dimostriamo come utilizzare un nuovo strumento di analisi del tracciamento delle nanoparticelle per stimare la distribuzione dimensionale e la concentrazione totale di particelle di vescicole extracellulari isolate dal tessuto adiposo perigonadale di topo e dal plasma umano.
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Articolo metodologico
Analisi di tracciamento delle nanoparticelle per la quantificazione e la determinazione delle dimensioni delle vescicole extracellulari
In questo articolo
Sommario
Abstract
I ruoli fisiologici e fisiopatologici delle vescicole extracellulari (EV) sono diventati sempre più riconosciuti, rendendo il campo EV un'area di ricerca in rapida evoluzione. Esistono molti metodi diversi per l'isolamento dei veicoli elettrici, ognuno con vantaggi e svantaggi distinti che influenzano la resa a valle e la purezza dei veicoli elettrici. Pertanto, caratterizzare la preparazione EV isolata da una determinata fonte con un metodo scelto è importante per l'interpretazione dei risultati a valle e il confronto dei risultati tra i laboratori. Esistono vari metodi per determinare le dimensioni e la quantità di veicoli elettrici, che possono essere alterati da stati patologici o in risposta a condizioni esterne. L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) è una delle tecnologie di spicco utilizzate per l'analisi ad alto rendimento di singoli veicoli elettrici. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la quantificazione e la determinazione delle dimensioni dei veicoli elettrici isolati dal tessuto adiposo perigonadale del topo e dal plasma umano utilizzando una tecnologia rivoluzionaria per NTA che rappresenta i principali progressi nel campo. I risultati dimostrano che questo metodo può fornire dati riproducibili e validi sulla concentrazione totale di particelle e sulla distribuzione delle dimensioni per veicoli elettrici isolati da fonti diverse utilizzando metodi diversi, come confermato dalla microscopia elettronica a trasmissione. L'adattamento di questo strumento per NTA affronterà la necessità di standardizzazione nei metodi NTA per aumentare il rigore e la riproducibilità nella ricerca EV.
Introduzione
Le vescicole extracellulari (EV) sono piccole (0,03-2 μm) vescicole legate alla membrana secrete da quasi tutti i tipi di cellule1. Sono spesso indicati come "esosomi", "microvescicole" o "corpi apoptotici" a seconda del loro meccanismo di rilascio e della dimensione2. Mentre inizialmente si pensava che gli EV fossero semplicemente un mezzo per eliminare i rifiuti dalla cellula per mantenere l'omeostasi3, ora sappiamo che possono anche partecipare alla comunicazione intercellulare tramite il trasferimento di materiale molecolare - tra cui DNA, RNA (mRNA, microRNA), lipidi e proteine
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Protocollo
Tutto il lavoro con questi campioni è stato eseguito in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e del Comitato di revisione istituzionale. Una panoramica schematica del metodo NTA è illustrata nella Figura 2.
Figura 2: Panoramica del metodo NTA utilizzando lo strumento di tracciamento delle particelle. Il campione viene preparato e inserito nello strumento. Il soft....
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Risultati
Prima di questa dimostrazione, la calibrazione dello strumento è stata prima testata per garantire la validità dei dati acquisiti misurando la distribuzione dimensionale degli standard di perline di polistirene. Abbiamo testato la distribuzione dimensionale di perle da 100 nm e 400 nm utilizzando i parametri di registrazione predefiniti e le impostazioni di elaborazione consigliate in questo protocollo (Figura 8).
Per lo standard di perline di polistirene da 100 n.......
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Discussione
Qui, dimostriamo un protocollo per NTA di veicoli elettrici per misurare la distribuzione dimensionale di un'ampia gamma di dimensioni delle particelle contemporaneamente e misurare la concentrazione totale di EV in un campione polidisperso. In questo studio, il tessuto adiposo perigonadale di topo e il plasma umano sono stati utilizzati come fonte di veicoli elettrici. Tuttavia, gli EV isolati da altri tessuti o fluidi biologici come siero, urina, saliva, latte materno, liquido amniotico e surnatante di coltura cellular.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori hanno dichiarato che non ci sono conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Riconosciamo Jeffrey Bodycomb, Ph.D. di HORIBA Instruments Incorporated per il suo aiuto nella calibrazione dello strumento.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1X dPBS | VWR | 02-0119-1000 | Per diluire campioni |
| 100 nm perlina standard | Thermo Scientific | 3100A | Per testare la calibrazione ViewSizer 3000 |
| 400 nm perlina standard | Thermo Scientific | 3400A | Per testare la calibrazione ViewSizer 3000 |
| Unità di filtro centrifugo | Amicon | UFC901024 | Per filtrare il diluente PBS |
| Provette di raccolta, 2 mL | Qiagen | 19201 | Per l'isolamento delle vescicole extracellulari del plasma umano |
| Spolverino ad aria compressa | DustOff | DPSJB-12 | Per pulire le cuvette |
| Inserto per cuvette | HORIBA | Scientific-Fornito | con l'acquisto di ViewSizer 3000 |
| Maschera per cuvette | HORIBA Scientific-Per | allineare l'ancoretta magnetica durante il posizionamento degli inserti all'interno della cuvetta; Fornito con l'acquisto di ViewSizer 3000 | |
| Acqua deionizzata | VWR | 02-0201-1000 | Per pulire le cuvette |
| Computer desktop con monitor, tastiera, mouse e tutti i cavi necessari | Fornito da Dell | con l'acquisto di ViewSizer 3000 | |
| Etanolo (70-100%) | Millipore Sigma-Per | pulire le cuvette | |
| Sistema ExoQuick ULTRA | Biosciences | EQULTRA-20A-1 | Per l'isolamento di vescicole extracellulari di plasma umano Fiale |
| scintillazione in vetro con coperchi | Thermo Scientific | B780020 | Per pulire le cuvette |
| Strumento "Hook" | Excelta-Fornito | con l'acquisto di ViewSizer 3000 | |
| Panno in microfibra privo di lanugine | Texwipe | TX629 | Per pulire le cuvette e coprire la superficie di lavoro |
| Provette per microcentrifuga, 2 mL | Eppendorf | 22363344 | Per l'isolamento di vescicole extracellulari di plasma umano |
| Barra di agitazione | Sp Scienceware | F37119-0005 | |
| Suprasil Cuvetta al quarzo con tappo | Agilent Technologies | AG1000-0544 | Inizialmente fornito con l'acquisto di ViewSizer 3000 |
| ViewSizer 3000 | HORIBA Strumento | di tracciamento delle nanoparticelle |
Riferimenti
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Hessvik, N. P., Llorente, A.
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Ristampe e permessi
