L'epitelio intestinale conferisce non solo assorbimento dei nutrienti, ma protezione contro le sostanze nocive. La giunzione intercellulare apicale più epiteliale, cioè la giunzione stretta, regola la permeabilità paracellulare del soluto e degli ioni. Qui viene descritto un protocollo per la preparazione di fogli mucosi e la valutazione della selettività ionica di giunzioni strette utilizzando la tecnica della camera di Ussing.
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Articolo metodologico
Valutazione funzionale della barriera a giunzione stretta intestinale e della permeabilità agli ioni nel tessuto nativo mediante la tecnica della camera di Ussing
In questo articolo
Sommario
Abstract
La tecnica della camera di Ussing fu inventata per la prima volta dallo scienziato danese Hans Ussing nel 1951 per studiare il trasporto transcellulare di sodio attraverso la pelle di rana. Da allora, questa tecnica è stata applicata a molti tessuti diversi per studiare i parametri fisiologici del trasporto attraverso le membrane. Il metodo della camera di Ussing è preferibile ad altri metodi perché è possibile utilizzare il tessuto nativo, rendendolo più applicabile a ciò che sta accadendo in vivo. Tuttavia, poiché viene utilizzato tessuto nativo, la produttività è bassa, il tempo è limitato e la preparazione dei tessuti richiede abilità e formazione. Queste camere sono state utilizzate per studiare specifiche proteine trasportatrici in vari tessuti, comprendere la fisiopatologia della malattia come nella fibrosi cistica, studiare il trasporto e l'assorbimento dei farmaci e soprattutto hanno contribuito alla comprensione del trasporto dei nutrienti nell'intestino. Dato l'intero processo di trasporto epiteliale di un tessuto, non solo le vie transepiteliali, ma anche le vie paracellulari sono importanti. Le giunzioni strette sono un fattore determinante della permeabilità paracellulare specifica del tessuto attraverso l'intestino. In questo articolo, la tecnica della camera di Ussing sarà utilizzata per valutare la permselectività paracellulare degli ioni misurando la conduttanza transepiteliale e i potenziali di diluizione.
Introduzione
Il metodo della camera di Ussing è stato sviluppato per la prima volta dallo scienziato danese Hans Ussing. Ussing lo ha usato per la prima volta per misurare la corrente di cortocircuito del trasporto di sodio attraverso la pelle di rana dopo che è stato osservato che naCl poteva essere trasportato attraverso la pelle contro un forte gradiente di concentrazione1. Il suo sistema consisteva nella pelle di rana montata tra due camere con accesso a entrambi i lati della pelle. Ogni camera conteneva la soluzione di Ringer che veniva fatta circolare e aerata. Due stretti ponti di suoneria di agar situati vicino alla pelle e collegati a elettrodi sat....
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Protocollo
Tutti gli animali utilizzati in questi esperimenti sono stati mantenuti nella struttura di cura degli animali presso l'Università di Shizuoka e gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida per la ricerca sugli animali stabilite dall'Università di Shizuoka. Tutti gli esperimenti sono stati condotti con l'approvazione del Comitato per la cura e l'uso degli animali presso l'Università di Shizuoka (permessi n. 205272 e n. 656-2303).
1. Preparazione degli elettrodi NaCl
NOTA: Gli elettrodi utilizzati in questi esperimenti sono costituiti da NaCl concentrato o KCl. Gli elettrodi KCl/calomelano sono acquista....
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Risultati
I risultati mostrati in questo documento sono risultati che facevano parte di un progetto più ampio che è stato completato (vedi rif.4,23,24).
La conduttanza elettrica transepiteliale dell'intestino tenue è diminuita nei topi Cldn15-/-.
La conduttanza transmucosa al basale (in condizioni di cortocircuito) del s.......
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Discussione
In questo esperimento, le camere di Ussing sono state utilizzate per misurare i parametri elettrici di base e il potenziale di diluizione di NaCl nell'intestino tenue di topi Cldn15-/- e WT. È molto importante quando si eseguono esperimenti con camera di Ussing verificare che la preparazione della membrana utilizzata negli esperimenti sia praticabile. Questo di solito viene fatto aggiungendo glucosio o l'attivatore dell'adenilato ciclasi forskolin e vedendo se c'è un aumento appropriato di Is.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno potenziali conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato da 17K00860 (a HH) e 19K20152 (a NI). WH desidera ringraziare la Otsuka Toshimi Scholarship Foundation per il suo sostegno finanziario dal 2018 al 2021.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| #3 tubo in polietile | Hibiki | diametro esterno 1,0 mm; diametro interno 0,5 mm# | |
| 7 tubo in polietile | Hibiki | diametro esterno 2,3 mm; diametro interno 1,3 mm | |
| Siringa di bloccaggio da 10 mL | Terumo | SS-10LZ | Le siringhe di bloccaggio sono necessarie per evitare che l'ago si stacchi durante il riempimento |
| ago da 19 g | Terumo | NN-1938R | Si prega di prestare attenzione quando si lavora con gli aghi e di smaltirli in un contenitore per oggetti taglienti |
| Ago da 23 g | Terumo | NN-2332R | Si prega di prestare attenzione quando si lavora con gli aghi e smaltirli in un contenitore per oggetti taglienti |
| Punzone da 5 mm | NA | NA Utilizzare | per praticare fori nella carta da filtro e |
| negli aghi per agopuntura | Seirin | NS | Utilizzato come perni di dissezione per fissare il tessuto alla piastra di dissezione |
| Agar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
| Clip a coccodrillo | NA | NA Collega | l'elettrodo all'amplificatore |
| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
| D(-)-Mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | Viene utilizzato per correggere la differenza di osmolalità nel tampone HEPES di diluizione |
| D(+)-Glucosio | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
| Kit | Avrai bisogno, forbici e pinze curve | ||
| Piastre | Abbiamo utilizzato piastre di coltura cellulare da 10 cm e ricoperte di gomma siliconica | ||
| DMSO | Sigma | 472301-500ML | Per fare lo stock di forskolina |
| Registratore elettrico | TOA Electronics | PRR-5041 | Altri registratori elettrici equivalenti sono disponibili in commercio |
| Amplificatore a morsetto di tensione epiteliale | Nihon Kohden | CEZ9100 | Sono disponibili altri amplificatori equivalenti |
| carta da filtro commerciale, tagliati in quadrati | NA | NA | Perforato con un punzone da 5 mm, utilizzato per contenere la preparazione intestinale |
| pinze fini | Fast Gene | FG-B50476 | Per la dissezione smussata dello strato muscolare |
| Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Produci 10 mM di stock in DMSO, la concentrazione finale sarà 10 & micro; M |
| HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
| Indometacina | Sigma | I7338-5G | Produci uno stock di 1 mM in 21 mM NaHCO3, la concentrazione finale è 10 & micro; M |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/elettrodo al calomelano | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
| L(+)-Glutammina | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
| Gas misto (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Utilizzato per il gorgogliamento della soluzione Ringer e delle camere quando si utilizza la soluzione Ringer | |
| NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
| Elettrodo NaCl | NA | NA | Elettrodi fatti a mano che richiedono NaCl concentrato e filo d'argento |
| NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
| O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Utilizzato per le camere di gorgogliamento quando si utilizza il parafilm tampone HEPES | |
| Bemis | PM-996 | Utilizzato per aiutare a sigillare il | |
| pHmetro | DKK-TOA Corp | HM-305 | tampone HEPES deve essere regolato a pH 7,4 a 37 gradi ° C |
| Elettrodo pHmetro | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
| gomma siliconica | Shinetsu Chemical | KE-12 | Utilizzato per riempire piastre di dissezione |
| filo | Utilizzato per la produzione di elettrodi NaCl Piccoli | ||
| barattoli con coperchi di plastica | NA | NA Uso | per elettrodi NaCl |
| stereomicroscopio | Zeiss | Stemi 305 | Uno stereomicroscopio consente di vedere la profondità, in modo da poter sezionare il tessuto più facilmente |
| Tris (base Trizma) | Sigma | T1503-1KG | Preparare una soluzione 1M per regolare il pH dei tamponi HEPES Camere di |
| Ussing | Sanki Kagaku Kougei | Queste camere sono camere di Ussing a perfusione continua su misura con un diametro della finestra di 5 mm | |
| Pompa dell'acqua e sistema di riscaldamento | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | NTT-110 |
Riferimenti
- Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
- Field, M.
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Ristampe e permessi
