Qui presentiamo un protocollo per analizzare l'ultrastruttura dei megacariociti in situ utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM). I midolli ossei murini vengono raccolti, fissati, incorporati in resina epossidica e tagliati in sezioni ultrassteste. Dopo la colorazione di contrasto, il midollo osseo viene osservato al microscopio TEM a 120 kV.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Sul posto Esplorazione della megacariopoiesi murina usando la microscopia elettronica a trasmissione
In questo articolo
Sommario
Abstract
La differenziazione e la maturazione dei megacariociti avvengono in stretta associazione con i componenti cellulari ed extracellulari del midollo osseo. Questi processi sono caratterizzati dalla graduale comparsa di strutture essenziali nel citoplasma dei megacariociti come un nucleo poliploide e polilobulato, una rete di membrana interna chiamata sistema di membrana di demarcazione (DMS) e i granuli densi e alfa che si troveranno nelle piastrine circolanti. In questo articolo, descriviamo un protocollo standardizzato per lo studio ultrastrutturale in situ dei megacariociti murini utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), consentendo l'identificazione delle caratteristiche chiave che definiscono il loro stadio di maturazione e la densità cellulare nel midollo osseo. I midollo osseo vengono lavati, fissati, disidratati in etanolo, incorporati in resina plastica e montati per generare sezioni trasversali. Sezioni semisottili e sottili sono preparate rispettivamente per osservazioni istologiche e TEM. Questo metodo può essere utilizzato per qualsiasi cellula del midollo osseo, in qualsiasi struttura EM e ha il vantaggio di utilizzare campioni di piccole dimensioni che consentono la combinazione di diversi approcci di imaging sullo stesso topo.
Introduzione
I megacariociti sono cellule poliploidi specializzate di grandi dimensioni, localizzate nel midollo osseo, responsabili della produzione piastrinica1. Hanno origine da cellule staminali ematopoietiche attraverso un intricato processo di maturazione, durante il quale i precursori dei megacariociti aumentano progressivamente di dimensioni, mentre subiscono estesi cambiamenti morfologici concomitanti nel citoplasma e nel nucleo2. Durante la maturazione, i megacariociti sviluppano una serie di elementi strutturali distinguibili tra cui: un nucleo polilobulato, invaginazioni della membrana superficiale che formano il sistema ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le norme europee 2010/63/UE e il Comitato CREMEAS per l'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di Strasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). Il protocollo è schematicamente mostrato nella Figura 1.
1. Raccolta e fissazione del midollo osseo ( Figura 1A)
ATTENZIONE: Questa procedura include sostanze cancerogene, mutagene e/o tossiche e viene eseguita sotto un cappuccio di estrazione chimica. Indossare adeguati dispositivi di ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Istologia del midollo osseo
L'osservazione dell'istologia blu toluidina del midollo osseo al microscopio ottico è la chiave per analizzare rapidamente l'architettura complessiva del tessuto in termini, ad esempio, di compattezza dei tessuti, continuità dei microvasi e dimensioni e forma dei megacariociti (Figura 1D). Viene eseguito prima di sezioni ultrassanteli per determinare la necessità di tagliare più in profondità nel blocco del midollo osseo. A cau.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
L'esame diretto dei megacariociti nel loro ambiente nativo è essenziale per comprendere la megacariopoiesi e la formazione piastrinica. In questo manoscritto, forniamo un metodo di microscopia elettronica a trasmissione che combina il lavaggio del midollo osseo e la fissazione per immersione, consentendo di sezionare in situ le caratteristiche morfologiche dell'intero processo di morfogenesi dei megacariociti che si svolge nel midollo osseo.
Il rossore del midollo osseo è un passaggio.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), dall'Unione Europea attraverso il Fondo Europeo di Sviluppo Regionale (FESR) e dalla Sovvenzione ANR-17-CE14-0001-01 a H.d.S.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2,4,6-Tri(dimetilamminometil)fenolo (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarosio tipo LM-3 Microscopia elettronica agar a basso punto di fusione | Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Cloruro di calcio esaidrato | Merck, Germania | 2083 | |
| Griglie in rame 200 mesh a barra sottile | Oxford Instrument, Agar Scientifics, Inghilterra | T200-CU | |
| Acido dimetilarsinico sale di sodio triidrato | Merck, Germania | 8.20670.0250 | |
| Anidride dodecenilsuccina (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Lama di rasoio inossidabile a doppio taglio | Microscopia elettronica Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Etanolo assoluto | VWR International, Francia | 20821296 | |
| Filter carta, diametro 90 mm | Whatman, Inghilterra | 512-0326 | |
| Stampo piatto in silicone per inclusione | Oxford Instrument, Agar Scientific, Inghilterra | G3533 | |
| Glutaraldeide 25% | Microscopia elettronica Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Piastra riscaldante Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Coltello diamantato Histo 45° | Diatome, Svizzera | 1044797 | |
| Microscopio JEOL 2100 Plus TEM | JEOL, Giappone | EM-21001BU | |
| Citrato di piombo - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| Resina LX-112 | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Cloruro di magnesio esaidrato | Sigma, Francia | M2393-100g | |
| Mezzo di montaggio - Poli(metacrilato-co-metilmetacrilato) | Microscopia elettronica Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Anidride metilica nadica (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Tetrossido di osmio 2% | Merck, Germania | 19172 | |
| Ossido di propilene (1,2-epossipropano) | Sigma, Francia | 82320-250ML | |
| Soluzione iniettabile salina 0,9% NaCl | C.D.M Lavoisier, Francia | MA 575 420 6 | |
| Bisturi Lama in acciaio chirurgico | Swann-Morton, | Inghilterra.0508 | |
| Tetraborato di sodio - Borace | Sigma, Francia | B-9876 | |
| Saccarosio | Merck, Germania | 84100-1KG | |
| Filtro per siringa 0,2µ m | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Blu di toluidina | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotomo Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Acetato di uranile | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
Riferimenti
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
