Isolamento dei progenitori dei megacariociti di topo

Quentin Kimmerlin; Manuela Tavian; Christian Gachet; François Lanza; Nathalie Brouard

doi:10.3791/62498

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Articolo metodologico

Isolamento dei progenitori dei megacariociti di topo

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DOI:

10.3791/62498

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20 maggio 2021

Quentin Kimmerlin¹ , Manuela Tavian² , Christian Gachet¹ , François Lanza¹ , Nathalie Brouard¹

¹Université de Strasbourg, INSERM UMR S1255, EFS Grand-EST, ²UMR-S1113 –IRFAC, Université de Strasbourg

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Sommario

Questo metodo descrive la purificazione mediante citometria a flusso di MEP e MKp da topi femori, tibie e ossa pelviche.

Abstract

I megacariociti del midollo osseo sono grandi cellule poliploidi che assicurano la produzione di piastrine nel sangue. Derivano da cellule staminali ematopoietiche attraverso la megacariopoiesi. Le fasi finali di questo processo sono complesse e coinvolgono classicamente i progenitori bipotenti megacariociti-eritrociti (MEP) e i progenitori unipotenti dei megacariociti (MKp). Queste popolazioni precedono la formazione di megacariociti in buona fede e, come tali, il loro isolamento e caratterizzazione potrebbero consentire l'analisi robusta e imparziale della formazione di megacariociti. Questo protocollo presenta in dettaglio la procedura per raccogliere cellule ematopoietiche dal midollo osseo di topo, l'arricchimento dei progenitori ematopoietici attraverso l'esaurimento magnetico e infine una strategia di selezione cellulare che produce popolazioni MEP e MKp altamente purificate. In primo luogo, le cellule del midollo osseo vengono raccolte dal femore, dalla tibia e anche dalla cresta iliaca, un osso che contiene un numero elevato di progenitori ematopoietici. L'uso di ossa della cresta iliaca aumenta drasticamente il numero totale di cellule ottenute per topo e contribuisce quindi a un uso più etico degli animali. Un esaurimento del lignaggio magnetico è stato ottimizzato utilizzando perle magnetiche a 450 nm che consentono una selezione cellulare molto efficiente mediante citometria a flusso. Infine, il protocollo presenta la strategia di etichettatura e gating per la cernita delle due popolazioni progenitrici di megacariociti altamente purificate: MEP (Lin^-Sca-1^-c-Kit⁺CD16/32^-CD150⁺CD9^dim) e MKp (Lin^- Sca-1^-c-Kit⁺CD16/32^-CD150⁺CD9^bright ). Questa tecnica è facile da implementare e fornisce materiale cellulare sufficiente per eseguire i) caratterizzazione molecolare per una conoscenza più approfondita della loro identità e biologia, ii) saggi di differenziazione in vitro, che forniranno una migliore comprensione dei meccanismi di maturazione dei megacariociti, o iii) modelli in vitro di interazione con il loro microambiente.

Introduzione

Le piastrine del sangue sono prodotte dai megacariociti. Queste grandi cellule poliploidi si trovano nel midollo osseo e come per tutte le cellule del sangue sono derivate da cellule staminali ematopoietiche (HSC)¹. La via classica di produzione dei megacariociti nel midollo osseo ha origine da HSC e prevede la generazione di diversi progenitori che limitano progressivamente il loro potenziale di differenziazione². Il primo progenitore che firma l'impegno per la linea megacariocitica è il Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitor (MEP), un progenitore bipotente in grado di produrre sia cellule eritroidi che megacariociti