È ormai riconosciuto che l'ambiente tridimensionale delle cellule può svolgere un ruolo importante nel loro comportamento, maturazione e/o differenziazione. Questo protocollo descrive un modello di coltura cellulare tridimensionale progettato per studiare l'impatto del contenimento fisico e dei vincoli meccanici sui megacariociti.
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Articolo metodologico
Coltura di megacariociti in idrogel 3D a base di metilcellulosa per migliorare la maturazione cellulare e studiare l'impatto della rigidità e del confinamento
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ambiente 3D che porta sia al confinamento che ai vincoli meccanici è sempre più riconosciuto come un importante determinante del comportamento cellulare. La cultura 3D è stata così sviluppata per affrontare meglio la situazione in vivo. I megacariociti si differenziano dalle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) nel midollo osseo (BM). Il BM è uno dei tessuti più molli del corpo, confinato all'interno dell'osso. Essendo l'osso scarsamente estensibile alla scala cellulare, i megacariociti sono contemporaneamente sottoposti a una debole rigidità e ad un elevato confinamento. Questo protocollo presenta un metodo per il recupero degli HSPC negativi al lignaggio di topo (Lin-) mediante selezione immunomagnetica e la loro differenziazione in megacariociti maturi in un mezzo 3D composto da metilcellulosa. La metilcellulosa non è reattiva nei confronti dei megacariociti e la sua rigidità può essere regolata a quella del midollo osseo normale o aumentata per imitare un midollo fibrotico patologico. Il processo di recupero dei megacariociti per ulteriori analisi cellulari è anche dettagliato nel protocollo. Sebbene l'estensione del proplatelet sia impedita all'interno dell'ambiente 3D, è descritto di seguito come risospendare i megacariociti in mezzo liquido e quantificare la loro capacità di estendere i proplatelet. I megacariociti cresciuti in idrogel 3D hanno una maggiore capacità di formare proplatelet rispetto a quelli coltivati in un ambiente liquido. Questa coltura 3D permette i) di differenziare i progenitori verso i megacariociti che raggiungono uno stato di maturazione più elevato, ii) di ricapitolare fenotipi che possono essere osservati in vivo ma passano inosservati nelle colture liquide classiche, e iii) di studiare le vie di trasduzione indotte dai segnali meccanici forniti da un ambiente 3D.
Introduzione
Le cellule del corpo sperimentano un complesso microambiente 3D e sono soggette all'interazione tra segnali chimici e meccanofisici tra cui rigidità dal tessuto e confinamento dovuto alle cellule vicine e alla matrice circostante 1,2,3. L'importanza della rigidità e del confinamento per il comportamento cellulare è stata riconosciuta solo negli ultimi decenni. Nel 2006, il lavoro seminale di Engler et al. 4 ha evidenziato l'importanza dell'ambiente meccanico per la differenziazione cellulare. Gli autori hanno dimostrato che la variazione della rigidità....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti devono essere eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Tutti i protocolli visualizzati nel video sono stati eseguiti in stretta conformità con la legge europea e le raccomandazioni del comitato di revisione dell'Etablissement Français du Sang (EFS). Una prima versione di questo protocollo è stata originariamente pubblicata nel 2018 in Methods in Molecular Biology 8.
NOTA: la Figura 1 presenta una vista schematica dell'intero processo. Questo processo include 1) dissezione ossea, recupero del midollo e iso....
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Risultati
I dati ottenuti utilizzando questo protocollo sono stati originariamente pubblicati su Blood nel 20169.
Secondo il protocollo, le cellule sono state seminate in mezzo idrogel liquido o metilcellulosa. Le cellule in mezzo liquido sono tutte sedimentate sul fondo del pozzo, a contatto con la superficie plastica rigida e talvolta con altre cellule. Al contrario, le cellule incorporate nell'idrogel di metilcellulosa sono distribuite in modo omogeneo nel gel e sono isolate d.......
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Discussione
Nel decennio precedente, la meccanobiologia ha suscitato sempre più interesse in molte aree della biologia. Ora è comunemente riconosciuto che l'ambiente meccanico che circonda le cellule svolge un ruolo nel loro comportamento, sottolineando l'importanza di studiare come i megacariociti percepiscono e rispondono ai segnali meccanici extracellulari. È difficile misurare con precisione la rigidità del tessuto del midollo osseo in situ11, soprattutto se consideriamo il midollo rosso ematopoi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Fabien Pertuy e Alicia Aguilar che inizialmente hanno sviluppato questa tecnica in laboratorio, così come Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Strasburgo) che ha caratterizzato le proprietà viscoelastiche dell'idrogel di metilcellulosa. Questo lavoro è stato sostenuto da ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) e da una sovvenzione ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher è una destinataria della Fondation pour la Recherche Médicale (numero di sovvenzione FRM FDT202012010422).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Aghi calibro 18 | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| aghi calibro 21 | BD Microlance | 301155 | |
| aghi calibro 23 | Terumo | AN*2332R1 | |
| Neeldes calibro 25 | BD Microlance | 300400 | |
| piastre di coltura a 4 pozzetti | Thermo Scientific | 144444 | |
| siringhe da 5 ml | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels dotati di schede filtranti | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuga | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco' sterile s soluzione salina tamponata con fosfato |
| Magneti EasySep | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Topo Progenitore ematopoietico Kit di isolamento delle cellule | staminali Stem Cell Technologies | 19856A | anticorpi biotinilati (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7... 4) e perline magnetiche rivestite di streptavidina |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetale Siero Bovino Healthcare | Life Science | SH30071.01 | |
| Siringhe Luer lock 1 mL | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | o 309628 siringhe da BD MEDICAL |
| Luer lock siringhe | connettori Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R& Amp; D systems | HSC001 | |
| Vetrini rivestiti in polilisina | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10.000 unità/mL di penicillina, 10.000 &; g/mL di streptomicina e 29,2 mg/mL di glutammina |
| Siero di ratto | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Irudina ricombinante | Transgögrave; ne | rHV2-Lys47 | |
| Trombopoietina umana ricombinante (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10.000 unità/mL |
| Provette plastique da 10 mL a fondo tondo | Falcon | 352054 | |
| polistirene da 5 mL a fondo tondo |
Riferimenti
- Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblasto....
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Ristampe e permessi
