Articolo metodologico

Profilazione della modifica H3K4me3 negli impianti utilizzando la scissione sotto target e tagmentazione

3.8K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/62534

⸱

22 aprile 2022

 ,  ,  , 
1College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, 2Central Laboratory, State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 3State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Cotton Hybrid R & D Engineering Center (the Ministry of Education), College of Agriculture, Nanjing Agricultural University, 4Hainan Institute of Zhejiang University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La scissione sotto bersagli e tagmentazione (CUT&Tag) è un'efficiente strategia di profilazione epigenomica della cromatina. Questo protocollo presenta una raffinata strategia CUT&Tag per la profilazione delle modificazioni istoniche negli impianti.

Abstract

La regolazione epigenomica a livello cromatico, comprese le modificazioni del DNA e degli istoni, i comportamenti dei fattori di trascrizione e gli RNA non codificanti con le loro proteine reclutate, portano al controllo temporale e spaziale dell'espressione genica. Cleavage under targets and tagmentation (CUT&Tag) è un metodo di legame enzimatico in cui la proteina cromatina specifica viene prima riconosciuta dal suo anticorpo specifico, e quindi l'anticorpo lega una proteina di fusione A-transposasi (pA-Tn5), che scinde la cromatina mirata in situ dall'attivazione degli ioni magnesio. Qui, forniamo il nostro protocollo CUT&Tag precedentemente pubblicato utilizzando nuclei intatti isolati da foglie di cotone allortetraploid con modifica. Questo protocollo passo-passo può essere utilizzato per la ricerca epigenomica nelle piante. Inoltre, le modifiche sostanziali per l'isolamento dei nuclei vegetali sono fornite con commenti critici.

Introduzione

I siti del DNA legante il fattore di trascrizione e la cromatina aperta associata ai segni di modificazione degli istoni svolgono ruoli funzionali critici nella regolazione dell'espressione genica e sono i principali obiettivi della ricerca epigenetica1. Convenzionalmente, il saggio di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) accoppiato con il sequenziamento profondo (ChIP-seq) è stato utilizzato per l'identificazione a livello di genoma di specifici bersagli dell'istone della cromatina o del DNA con proteine specifiche ed è ampiamente adottato nel campo dell'epigenetica2. La tecnologia CUT&Tag (Cleavage under targets and tagmentation) è stata originariamente sviluppata dall'Henikoff Lab per catturare i frammenti di DNA affiliati alle proteine in tutto il genoma5. Rispetto a ChIP, CUT&Tagcan genera librerie di DNA ad alta risoluzione e sfondo eccezionalmente basso utilizzando un piccolo numero di cellule con una procedura semplificata3. Ad oggi, metodi per l'analisi delle regioni della cromatina con specifiche modificazioni istoniche utilizzando CUT&Tag sono stati stabiliti in cellule animali4,5. In particolare, CUT&Tag a singola cellula (scCUT&Tag) è stato sviluppato con successo anche per tessuti e cellule umani6. Tuttavia, a causa della complessità della parete cellulare e dei metaboliti secondari, CUT&Tag è ancora tecnicamente impegnativo per i tessuti vegetali.

In precedenza, abbiamo riportato un protocollo CUT&Tag che utilizza nuclei intatti isolati da foglie di cotone allotetraploidi4. Per dimostrare l'efficienza dell'isolamento dei nuclei e della cattura del DNA utilizzando il tessuto vegetale, la procedura di profilazione è presentata qui. I passaggi principali includono l'isolamento dei nuclei intatti, l'incubazione in situ con l'anticorpo per la modifica della cromatina, l'incubazione della transposasi, l'integrazione dell'adattatore e la preparazione della libreria del DNA. La risoluzione dei problemi si concentra sulla preparazione della libreria CUT&Tag per l'isolamento dei nuclei dell'impianto e il controllo qualità.

In questo studio, presentiamo una raffinata strategia CUT&Tag per le piante. Non solo forniamo un protocollo passo-passo per la profilazione H3K4me3 nelle foglie di cotone, ma forniamo anche una metodologia ottimizzata per l'isolamento dei nuclei vegetali, compresa la strategia per selezionare la concentrazione di detergente per una corretta lisi cellulare e la strategia per filtrare i nuclei. In questo protocollo aggiornato sono inclusi anche passaggi dettagliati con commenti critici.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Preparare la trasposasi e le soluzioni stock (Giorno 1)

NOTA: In questa parte, gli adattatori oligonucleotidici sono complessati con trasposasi Tn5 per rendere attiva la transposasi.

  1. Primer diluiti (primer A, primer B e primer C) a 100 μM di concentrazione utilizzando il tampone di ricottura (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (fare riferimento alla Tabella 1 per le informazioni sulla sequenza dei primer e alla Tabella 2 per le ricette per le soluzioni di lavoro). Conservare a -20 °C fino all'uso.
  2. Impostare le seguenti due reazioni in tubi PCR: Reazione 1 (adattatore AB), 10 μL di primer A da 100 μM, 10 μL da 100 μM primer B; Reazione 2 (adattatore AC), 10 μL di primer A da 100 μM, 10 di primer C da μL 100 μM.
  3. Ricottura degli adattatori nella macchina PCR utilizzando il seguente programma: coperchio termico (102 °C), 75 °C per 15 min, 60 °C per 10 min, 50 °C per 10 min, 40 °C per 10 min, 25 °C per 30 min.
    NOTA: Gli adattatori sono molecole di DNA parzialmente a doppio filamento (concentrazione = 50 pmol/μL).
  4. Impostare la seguente reazione in un tubo centrifuga da 1,5 mL: 10 μL di trasposasi pA-Tn5 (500 ng/μL o 7,5 pmol/μL), 0,75 μL di adattatore AB (50 pmol/μL), 0,75 μL di adattatore AC (50 pmol/μL), 7 μL di buffer di accoppiamento. Pipettare 20x delicatamente per mescolare bene e incubare a 30 °C a bagnomaria per 1 ora. Concentrazione finale di transposasi = 4 pmol/μL. Conservare a -20 °C fino all'uso.
    NOTA: Rapporto molare dell'adattatore AB: adattatore AC: transposasi = 0,5:0,5:1.
  5. Preparare le soluzioni stock secondo le ricette fornite nella Tabella 2 e in autoclave o filtrare le soluzioni stock per sterilizzare.
  6. Autoclave e sterilizzare forbici, carta da filtro, un setaccio in acciaio inossidabile, un mortaio, pestelli, ecc.

2. Isolamento dei nuclei (Giorno 2)

  1. Pre-raffreddare la centrifuga a 4 °C. Per ogni 1 g di materia prima (foglie di cotone), preparare 25 mL di tampone di isolamento nucleare A (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 mL di tampone di isolamento nucleare B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL di tampone di lavaggio nucleare (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidina, cocktail inibitore della proteasi 0,1%), 1 mL di tampone anticorpale (50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidina, 1 mg/mL BSA, cocktail inibitore della proteasi 0,1%, 0,05% p/v digitonina). Lasciare riposare i tubi sul ghiaccio fino all'uso.
  2. Macinare le foglie fresche (~1 g) in azoto liquido in polvere fine e trasferirle in un tubo da 50 ml contenente 25 mL di tampone di isolamento nucleare refrigerato A.
  3. Mescolare delicatamente la soluzione tampone e incubare il tubo su ghiaccio per 5 minuti con un leggero scuotimento per disperdere il materiale in modo uniforme.
  4. Centrifugare per 5 min a 500 rcf a 4 °C per formare il pellet cellulare.
  5. Decantare il surnatante e risospesare il pellet con 20 ml di tampone di isolamento nucleare refrigerato B integrato con 0,5% Triton X-100. Capovolgere delicatamente il tubo per risospescere completamente il pellet.
    NOTA: il tampone di isolamento nucleare B da 20 ml è applicabile per 1 g di materiale di partenza e questo volume può essere scalato di conseguenza.
    1. Eseguire un test pilota per testare l'effetto della concentrazione in serie di Triton X-100 (ad esempio, 2 mL di tampone di isolamento nucleare B, ciascuno con 0,1%, 0,25%, 0,5% e 1% Triton X-100 per 100 mg di tessuti macinati). La concentrazione appropriata di Triton X-100 è indicata da un accumulo di nuclei bianchi/grigi nella parte inferiore e da un surnatante verde scuro dopo lisi e centrifugazione a bassa velocità (< 500 rcf per 4 min).
  6. Filtrare il lisato cellulare risultante con una combinazione di due setacci: un setaccio a 500 maglie sulla parte superiore per rimuovere i detriti di tessuto più grandi e un setaccio a 1000 maglie sul fondo per raccogliere i nuclei.
    NOTA: scegliere una dimensione di maglia appropriata per i setacci in base alla dimensione dei nuclei delle piante.
  7. Utilizzare carta da filtro sterile sul retro del setaccio per assorbire i detriti di piccole cellule nel lisato.
  8. Trasferire i restanti nuclei contenenti lisato sul lato superiore del setaccio a 1000 maglie in quattro tubi centrifughi freschi da 1,5 ml.
  9. Centrifugare per 4 min a 300 rcf a 4 °C per raccogliere i nuclei.
  10. Rimuovere il più possibile il surnatante usando una punta a pipetta e lavare il pellet con tampone di lavaggio nucleare.
  11. Aggiungere 800 μL del tampone di lavaggio nucleare e invertire delicatamente i tubi per risospescere il pellet. Ruotare nuovamente il tubo per 4 minuti a 300 rcf a 4 °C.
  12. Eseguire un totale di 3 lavaggi.
  13. (Facoltativo) Immagine dei nuclei al microscopio per la colorazione DAPI.
    1. Trasferire 100 μL di sospensione di nuclei nel tampone di lavaggio nucleare dalla fase 2.11. ad un nuovo tubo da 1,5 ml. Aggiungere 900 μL di tampone di lavaggio nucleare e 2 μL di soluzione madre DAPI (1 mg/mL) per ottenere una concentrazione finale di lavoro di 2 μg/mL per DAPI. Incubare il tubo al buio per 30 minuti a temperatura ambiente.
    2. Dopo la colorazione, centrifugare per 4 minuti a 300 rcf a 4 °C per raccogliere i nuclei.
    3. Rimuovere il più possibile il surnatante usando una punta della pipetta. Lavare 3 volte con 800 μL del tampone di lavaggio nucleare.
    4. Rimuovere il più possibile il surnatante e risospescere i nuclei con 100 μL di tampone di lavaggio nucleare.
    5. Immagine dei nuclei al microscopio a fluorescenza utilizzando il canale DAPI.
  14. Combinare i nuclei di due tubi (~ 50 μL di nuclei in volume in ciascun tubo da 1,5 ml). Centrifuga per 4 min a 300 rcf a 4 °C. Rimuovere il più possibile il buffer rimanente utilizzando una punta della pipetta.

3. Incubazione degli anticorpi

  1. Risospesso ogni 50 μL di nuclei in un tubo da 1,5 mL con 1 mL di tampone anticorpale.
  2. Impostare le seguenti reazioni in tubi da 1,5 mL: due repliche biologiche di gruppi di controllo IgG con 150 μL di nuclei (~ 1 μg di cromatina) e 2 μL di IgG (1 mg/mL) in ciascun tubo, due repliche biologiche di gruppi di saggio H3K4me3 con 150 μL di nuclei e 2 μL di anticorpo anti-H3K4me3 (1 mg/mL) in ciascun tubo.
  3. Mescolare delicatamente la soluzione e lasciare i tubi su uno shaker orizzontale per l'ibridazione durante la notte a 4 °C e 12 giri/min.
  4. Pre-raffreddare la centrifuga a 4 °C. Preparare 50 mL di tampone di lavaggio immunoprecipitazione (IP) fresco (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidina, cocktail inibitore della proteasi 0,1%, 0,05% p/v digitonina) in un tubo centrifugo da 50 mL. Lasciare che il tubo si sieda sul ghiaccio.
  5. Centrifugare i tubi per 4 min a 300 rcf a 4 °C. Rimuovere il tampone anticorpale da ciascun tubo.
  6. Aggiungere 800 μL di tampone di lavaggio IP a ciascun tubo e mescolare delicatamente. Lasciare i tubi su uno shaker orizzontale per 5 minuti a temperatura ambiente e 12 giri / min.
  7. Dopo il lavaggio, centrifugare i tubi per 4 minuti a 300 rcf a 4 °C. Rimuovere il surnatante usando una punta della pipetta.
    NOTA: Per evitare qualsiasi disturbo del pellet di nuclei, lasciare ~ 50-80 μL del tampone con i nuclei.
  8. Ripetere i passaggi 3.6.-3.7. altre due volte.
  9. Dopo il terzo lavaggio, centrifugare per 2 minuti a 300 rcf a 4 °C. Rimuovere il buffer rimanente il più possibile.

4. Incubazione della trasposasi

  1. Produrre fresco 1 mL di tampone di incubazione della transposasi (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidina, cocktail inibitore della proteasi 0,1%, 0,05% p/v digitonina) mescolando 1 mL del tampone di lavaggio IP con 30 μL di 5 M NaCl.
  2. Per preparare la miscela di trasposasi Tn5 per l'incubazione, aggiungere 1 μL di transposasi a ciascun 150 μL del tampone di incubazione della transposasi.
    NOTA: Preparare prima la miscela di soluzione di transposasi in base al numero di reazioni, quindi aggiungere un'aliquota di 150 μL a ciascun tubo.
  3. Risospese i nuclei con 150 μL di soluzione di trasposasi.
  4. Lasciare i tubi su uno shaker orizzontale a 12 giri / min per 2-3 ore a temperatura ambiente e mescolare ogni 10-15 minuti.
  5. Dopo l'incubazione della trasposasi, centrifugare i tubi per 4 minuti a 300 rcf a 4 °C. Rimuovere il tampone di incubazione della transposasi in ogni tubo.
  6. Lavare i tubi con tampone di lavaggio IP. Per fare ciò, aggiungere 800 μL di tampone di lavaggio IP a ciascun tubo, mescolare delicatamente e lasciare i tubi su uno shaker orizzontale a 12 giri / min per 5 minuti a temperatura ambiente.
  7. Centrifuga per 4 min a 300 rcf a 4 °C. Rimuovere il surnatante usando una punta della pipetta.
  8. Ripetere i passaggi 4.6.-4.7. altre due volte.
  9. Dopo il terzo lavaggio, centrifugare per 2 minuti a 300 rcf a 4 °C. Rimuovere il buffer rimanente il più possibile.

5. Tagmentazione

  1. Preparare appena 2 mL del tampone di tagmentazione (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidina, cocktail inibitore della proteasi 0,1%, 10 mM MgCl2, 0,05% p/v digitonina) mescolando 2 mL di tampone di lavaggio IP con 60 μL di 5 M NaCl e 20 μL di 1 M MgCl2.
  2. Risospendare i nuclei con 300 μL di tampone di tagmentazione.
  3. Mescolare la soluzione e incubare a bagnomaria a 37 °C per 1 ora per la tagmentazione.
  4. Interrompere la tagmentazione con 10 μL di 0,5 M EDTA (concentrazione finale ~15 mM) e 30 μL di SDS al 10% (concentrazione finale 1%).

6. Estrazione del DNA e costruzione della libreria NGS

  1. Aggiungere 300 μL di tampone di estrazione del DNA CTAB come descritto7. Incubare i tubi a bagnomaria a 65 °C per 30 min. Invertire per mescolare ogni ~ 10 min.
  2. Aggiungere 600 μL di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1) a ciascun tubo. Mescolare accuratamente.
  3. Pre-centrifugare i tubi gel di blocco di fase per 2 minuti a 13.000 rcf a 4 °C. Trasferire la soluzione di cui sopra in tubi gel a blocco di fase.
  4. Centrifuga per 10 min a 13.000 rcf a 4 °C.
  5. Trasferire il surnatante (~600 μL) in un nuovo tubo da 1,5 mL.
  6. Aggiungere 600 μL di cloroformio a ciascun tubo. Mescolare accuratamente.
  7. Centrifuga per 10 min a 13.000 rcf a 4 °C.
  8. Trasferire il surnatante (~600 μL) in un nuovo tubo da 1,5 ml.
  9. Aggiungere 12 μL di etanolo al 100% e 2 μL di GlycoBlue Coprecipitant. Mescolare accuratamente e conservare a -20 °C per 1 ora.
  10. Centrifuga per 10 min a 13.000 rcf a 4 °C.
  11. Decantare il surnatante. Lavare il pellet di DNA utilizzando etanolo al 75% (v/v) e centrifugare per 5 minuti a 13.000 rcf a 4 °C.
  12. Decantare il surnatante. Asciugare all'aria il pellet di DNA e risospesciare il DNA in 25 μL di ddH2O.
  13. Impostare la reazione PCR come segue. Per un totale di 50 μL di reazione, aggiungere 24 μL di DNA, 11 μL di ddH2O, 10 μL di 5x tampone TAE, 2 μL di primer P5 (10 μM), 2 μL di primer P7 (10 μM) e 1 μL di Enzima TruePrep Amplify. Programma PCR: 72 °C per 3 min, 98 °C per 30 s; poi 14 cicli di 98 °C per 30 s, 60 °C per 30 s e 72 °C per 30 s, seguiti da 72 °C per 5 min.
    NOTA: i primi 72 °C per 3 minuti per estensione non possono essere saltati. La sovraesplorazione della libreria porterà ad un alto livello di duplicati PCR nell'NGS. Iniziare da 12-14 cicli di PCR nella reazione PCR per H3K4me3 quando si utilizza ~ 1 μg di cromatina in ogni reazione.
  14. Caricare 2 μL dei prodotti PCR su gel di agarosio all'1,5% per elettroforesi.
  15. Purificare i prodotti PCR utilizzando perline magnetiche commerciali per la purificazione del DNA.
  16. Quantificare la libreria con un fluorometro e l'elettroforesi su gel di agarosio.
    NOTA: la concentrazione effettiva della libreria deve essere >2 nM da qPCR per garantire una buona qualità.
  17. Esegui il sequenziamento di nuova generazione (NGS) e l'analisi dei dati.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Nella Figura 1 viene illustrato il flusso di lavoro CUT&Tag. La Figura 2 mostra la colorazione DAPI dei nuclei intatti. L'obiettivo della fase di "isolamento dei nuclei" era quello di ottenere i nuclei intatti in una quantità sufficiente per la successiva reazione CUT&Tag. La Figura 3 mostra l'elettroforesi su gel di agarosio dei prodotti PCR. Il controllo negativo IgG è richiesto in parallelo durante la configurazione dell'...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Qui abbiamo descritto CUT&Tag, una tecnologia per la generazione di librerie di DNA ad alta risoluzione e background eccezionalmente basso utilizzando un piccolo numero di cellule con una procedura semplificata rispetto all'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Il nostro successo con la profilatura H3K4me3 nelle foglie di cotone suggerisce che CUT&Tag, che è stato inizialmente progettato per le cellule animali, può essere utilizzato anche per le cellule vegetali. Sia il sistema tampone Tris comunemente usato per i...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Tutti gli autori non hanno conflitti di interesse con alcuna società che commercia uno dei prodotti sopra menzionati.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente in parte da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) e Fundamental Research Funds for the Central Universities, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) e JCIC-MCP project.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Antibody
Anti-H3K4me3Millipore07-473
IgG normali di coniglioMillipore12-370
Chemicals
Bovine Serum Albumin (BSA)Make 10 mg/ml di soluzione madre BSA. Negozio a -20 gradi C
digitonina (~50% (TLC)Sigma-AldrichD141Preparare una soluzione madre al 5% di digitonina (200 mg di digitonina [~50% di purezza] in 2 mL di DMSO). NOTA: Sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 micron. Negozio a -20 gradi C
dimetilsolfossido (DMSO)cloroformio
acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Produrre0,5 M EDTA (pH = 8,5) soluzione madre. Nota: la produzione di 100 mL di EDTA 0,5-M (pH = 8,5) richiede circa 2 g di pellet di idrossido di sodio (NaOH) per regolare il pH
etanolo
Coprecipitante GlycoBlue (15 mg/mL)InvitrogenAM9516
cloruro di magnesio (MgCl2)Make1 M MgCl2 cocktail di
inibitori della proteasiCalbiochem539133-1SET
cloruro di potassio (KCl)Produrre 1 M KCl soluzione madre
fenolo:cloroformio:alcol isoamilico (25:24:1,v:v:v
cloruro di sodio (NaCl)Produrre 5 M NaCl soluzione madre
spermidinaProdurre 2 M soluzione madre di spermidina, conservare a -20°C.
sodio dodecil solfato (SDS)Produce una soluzione madre SDS al 10%. NOTA: Non sterilizzare in autoclave; sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 micron
TrisProdurre 1 M Soluzione madre Tris (pH = 8,0)
Triton X-100Produrre il 20% Soluzione madre Triton X-100
Enzima
Iperattivo pG-Tn5/pA-Tn5 trasposasi per CUT& TagVazymeS602/S603Controllare l'affinità anticorpale della proteina A o della proteina G che è fusa con il Tn5. In generale, le proteine A e G hanno un'ampia affinità anticorpale. Tuttavia, la proteina A ha un'affinità relativamente più alta con gli anticorpi di coniglio e la proteina G ha un'affinità relativamente più alta con gli anticorpi di topo. Seleziona i prodotti di trasposasi appropriati che corrispondono al tuo anticorpo.
TruePrep Amplifica l'enzimaVazymeTD601
Equipment
CentrifugaEppendorf5424R
Macchina PCRApplied BiosystemsABI9700
Agitatore orbitaleMIULABHS-25
NanoDrop One  spettrofotometroThermo ScientificND-ONE-W
)Base

Riferimenti

  1. Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
  2. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
  3. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).
  4. Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120(2020).
  5. Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
  6. Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
  7. Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
  8. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11(2007).
  9. Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679(2021).
  10. Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
  11. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

CUT Tagprofilazione della cromatinaepigenomica vegetaleisolamento dei nucleimodifica istonicatrasposasi Tn5incubazione con anticorpiframmentazione del DNAsequenziamento ad alta produttivit

Articoli correlati