Haemophilus influenzae induce infiammazione delle vie respiratorie. Questo articolo si concentrerà sull'uso della citometria a flusso e della microscopia confocale per definire le risposte immunitarie dei fagociti e dei linfociti in risposta a questo batterio.
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Articolo metodologico
Valutazione delle risposte immunitarie respiratorie all'Haemophilus influenzae
In questo articolo
Sommario
Abstract
Haemophilus influenzae (Hi) è un batterio prevalente trovato in una serie di condizioni respiratorie. Una varietà di diversi saggi / tecniche possono essere utilizzati per valutare la risposta immunitaria / infiammatoria respiratoria a questo batterio. La citometria a flusso e la microscopia confocale sono tecnologie basate sulla fluorescenza che consentono la caratterizzazione dettagliata delle risposte biologiche. Possono essere utilizzate diverse forme di antigene Hi, inclusi componenti della parete cellulare, preparati uccisi / inattivati e batteri vivi. Hi è un batterio fastidioso che richiede mezzi arricchiti, ma è generalmente facile da coltivare in ambienti di laboratorio standard. I campioni di tessuto per la stimolazione con Hi possono essere ottenuti da sangue periferico, broncoscopia o polmone resecato, ad esempio, in pazienti sottoposti a intervento chirurgico per il trattamento del cancro del polmone). La funzione dei macrofagi e dei neutrofili può essere valutata in modo completo utilizzando la citometria a flusso con una varietà di parametri misurati, tra cui la fagocitosi, le specie reattive dell'ossigeno e la produzione di citochine intracellulari. La funzione dei linfociti (ad esempio, la funzione delle cellule T e delle cellule NK) può essere valutata specificamente utilizzando la citometria a flusso, principalmente per la produzione di citochine intracellulari. L'infezione da Hi è un potente induttore della produzione di trappole extracellulari, sia da parte dei neutrofili (NET) che dei macrofagi (MET). La microscopia confocale è probabilmente il modo più ottimale per valutare l'espressione di NET e MET, che può anche essere utilizzata per valutare l'attività della proteasi. L'immunità polmonare all'Haemophilus influenzae può essere valutata mediante citometria a flusso e microscopia confocale.
Introduzione
Haemophilus influenzae (Hi) è un normale batterio commensale presente nella faringe della maggior parte degli adulti sani. Hi può avere una capsula polisaccaridica (tipi A-F, ad esempio, tipo B o HiB) o mancare di una capsula ed essere non tipizzabile (NTHi)1. La colonizzazione della mucosa con questo batterio inizia nella prima infanzia e c'è un turnover di diversi ceppi colonizzatori2. Questo batterio è anche in grado di invadere sia il tratto respiratorio superiore che inferiore; In questo contesto, può indurre l'attivazione della risposta immunitaria e l'infiammazione 3,4
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Protocollo
Questo lavoro è stato approvato dal comitato etico di ricerca umana di Monash Health. Il protocollo segue le linee guida del comitato etico per la ricerca umana.
1. Preparazione antigenica
NOTA: Tre diversi preparati antigenici possono essere utilizzati per valutare la risposta immunitaria a Hi. Questi sono 1) un componente subcellulare (tipicamente dalla parete cellulare batterica); 2) batteri uccisi e inattivati; e 3) batteri vivi. Determinare l'uso di ciascuna preparazione antigenica prima dell'inizio di qualsiasi esperimento.
- Componenti subcellulari
- Ottenere componenti subcellulari da fonti, ....
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Risultati
I risultati rappresentativi mostrano come le risposte immunitarie infiammatorie a NTHi possano essere valutate/quantificate mediante citometria a flusso e microscopia confocale. Una parte fondamentale dell'interpretazione dei risultati è il confronto in fluorescenza tra campioni di controllo e stimolati. Di solito sono necessari numerosi esperimenti preliminari per ottimizzare la colorazione dei campioni. Quanti colori diversi possono essere esaminati contemporaneamente dipenderà dal numero di canali disponibili sul cito.......
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Discussione
I metodi elencati qui utilizzano tecniche di citometria a flusso basate sulla fluorescenza e microscopia confocale che possono essere utilizzate in combinazione per ottenere informazioni dettagliate sulla risposta polmonare infiammatoria all'Hi.
Stabilire la formulazione antigenica appropriata di Hi da utilizzare è fondamentale ed è consigliabile avere un input specifico da un microbiologo a questo proposito. Live Hi induce una risposta più forte, mentre i preparati Hi uccisi e i componenti Hi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare lo staff di Immunologia Clinica presso Monash Health per la loro assistenza in questo lavoro.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cloruro di ammonio | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolungare l'oro | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Rete di nylon sterile | Filcon Becton Dickinson | 340606 | |
| Substrato di gelatina, Enzchek | Sonde molecolari | E12055 | |
| Rotatore di provette di miscelazione MACS | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson Numero di | catalogo non disponibile | |
| Medicons 50 &; m | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Ioduro di propidio | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponina | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| diapositive Superfrost | Thermofisher | 11562203 |
Riferimenti
- Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
- Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections.
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Ristampe e permessi
