La capacità di rilevare con precisione i componenti della giunzione neuromuscolare è fondamentale per valutare le modifiche nella sua architettura a causa di processi patologici o di sviluppo. Qui presentiamo una descrizione completa di un metodo semplice per ottenere immagini di alta qualità di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero che possono essere utilizzate per eseguire misurazioni quantitative.
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Articolo metodologico
Dissezione di fibre muscolari scheletriche singole per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La giunzione neuromuscolare (NMJ) è un punto di contatto specializzato tra il nervo motorio e il muscolo scheletrico. Questa sinapsi periferica presenta un'elevata plasticità morfologica e funzionale. In numerosi disturbi del sistema nervoso, nmj è un bersaglio patologico precoce con conseguente fallimento della neurotrasmissione, debolezza, atrofia e persino nella morte delle fibre muscolari. A causa della sua rilevanza, la possibilità di valutare quantitativamente alcuni aspetti della relazione tra i componenti NMJ può aiutare a comprendere i processi associati al suo assemblaggio / smontaggio. Il primo ostacolo quando si lavora con i muscoli è quello di acquisire l'esperienza tecnica per identificare e sezionare rapidamente senza danneggiare le loro fibre. La seconda sfida consiste nell'utilizzare metodi di rilevamento di alta qualità per ottenere immagini NMJ che possono essere utilizzate per eseguire analisi quantitative. Questo articolo presenta un protocollo passo-passo per sezionare i muscoli extensor digitorum longus e soleus dai ratti. Spiega anche l'uso dell'immunofluorescenza per visualizzare elementi pre e postinaptici di NMJs a montaggio intero. I risultati ottenuti dimostrano che questa tecnica può essere utilizzata per stabilire l'anatomia microscopica della sinapsi e identificare sottili cambiamenti nello stato di alcuni dei suoi componenti in condizioni fisiologiche o patologiche.
Introduzione
La giunzione neuromuscolare del mammifero (NMJ) è una grande sinapsi tripartita colinergica composta dalla terminazione nervosa del motoneurone, dalla membrana postssinaptica sulla fibra muscolare scheletrica e dalle cellule terminali di Schwann1,2,3. Questa sinapsi presenta un'elevata plasticità morfologica e funzionale4,5,6,7,8,anche durante l'età adulta quando gli MN possono subire modifiche strutturali dinamich....
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Protocollo
Tutte le procedure animali sono state eseguite secondo le linee guida della legge nazionale n. 18611 per la cura degli animali utilizzati a fini sperimentali. Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale (CEUA IIBCE, Protocollo Numero 004/09/2015).
1. Dissezione muscolare (Giorno 1)
NOTA: Prima di iniziare, fare 40 mL di paraformaldeide (PFA) allo 0,5%, pH 7,4 nella soluzione salina fosfato di Dulbecco (DPBS). Opzionalmente, fare 20 mL del 4% di PFA. Preparare aliquote da 5 mL e congelare a -20 °C. Il giorno della dissezione, scongelare un'aliquota del 4% e aggiungere 35 mL di DPBS per ottenere....
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Risultati
Questo protocollo offre un metodo semplice per isolare e immunostain fibre muscolari da due diversi tipi di muscoli (muscoli a contrazione rapida e lenta, vedi Figura 1). Utilizzando i marcatori e/o le sonde corretti, i componenti NMJ possono essere rilevati e valutati poiché un punto di vista quantitativo per valutare alcuni dei cambiamenti morfologici che possono verificarsi come conseguenza della progressione della malattia o di uno specifico trattamento farmacologico. Nel presente studio.......
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Discussione
In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato per la dissezione di due muscoli scheletrici del ratto (uno a contrazione lenta e l'altro a contrazione rapida), isolamento muscolare delle fibre e rilevamento dell'immunofluorescenza dei marcatori pre e postinaptici per valutare quantitativamente i cambiamenti nmj e i processi di assemblaggio / smontaggio. Questo tipo di protocollo può essere utile nei modelli diroditori 41,42 per valutare NMJ durante i p.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Molte grazie al CSIC e al PEDECIBA per il sostegno finanziario dato a questo lavoro; a Natalia Rosano per le sue correzioni manoscritte; a Marcelo Casacuberta che realizza il video e a Nicolás Bolatto per aver prestato la sua voce per questo.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Stereomicroscopio con illuminazione a luce fredda | Nikon | SMZ-10A | |
| Piattaforma oscillante | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Vetri di copertura (24 x 32 mm) | Vetrini per microscopio Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) | PORLAB | PC-201-16 | |
| Pinzetta | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Forbici 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Lame chirurgiche monouso #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Siringa sterile monouso (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μ l o 200 μ l pipetta | Finnpipette | 9400130 | |
| Microscopio confocale | Zeiss | LSM 800 - AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H ratti | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldeide | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glicina | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glicerolo | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Anti-Neurofilamento purificato H (NF-H), Anticorpo fosforilato | BioLegend | 801601 | Precedentemente Covance # SMI 31P |
| Anti-Neurofilamento purificato H (NF-H), Anticorpo non fosforilato | BioLegend | 801701 | Precedentemente Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 capra anti-Topo IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| &alfa;-Bungarotossina, biotina-XX coniugato | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidina, Alexa Fluor 555 coniugato | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminofenilindolo (DAPI) | Sigma | D8417 |
Riferimenti
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
- Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neur....
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Ristampe e permessi
