Preparazione di virus dell'influenza aviaria H5 pseudo-tipizzati con metodo di trasfezione del fosfato di calcio e misurazione dell'attività neutralizzante degli anticorpi

Dal 1996, i virus H5 dell'influenza aviaria ad alta patogenicità (HPAI) del lignaggio A/goose/Guangdong/1/96 hanno causato continue epidemie di influenza nel pollame e negli uccelli selvatici, causando enormi perdite socio-economiche nell'industria avicola globale. A volte, anche gli esseri umani vengono infettati da esso, di fronte ad un alto tasso di mortalità ^1,2. Tuttavia, la ricerca sul virus HPAI è spesso ostacolata, dato che non può essere gestita al di fuori dei laboratori di livello 3 di biosicurezza. Per affrontare questo problema, gli pseudovirus sono adottati come alternativa ai virus wild-type in alcuni esperimenti di studi H5 HPAI. Gli pseudovirus sono abbastanza sicuri da essere praticati nei laboratori di livello 2 di biosicurezza.

Gli pseudovirus H5 HPAI appartengono a virus chimerici costituiti da nuclei di virus surrogati, involucri lipidici con glicoproteine superficiali da virus influenzali e geni reporter. I nuclei di pseudovirus sono solitamente derivati dal virus dell'immunodeficienza umana lentivirale (HIV), dai retrovirus come il virus della leucemia murina (MLV) e dal virus della stomatite vescicolare (VSV)³. In particolare, il sistema di confezionamento dell'HIV-1 è ampiamente utilizzato per produrre pseudovirus influenzale, dove i geni primari forniti sono gag e pol. Il gene del bavaglio dell'HIV esprime le proteine di base. Il gene pol esprime l'integrasi e la trascrittasi inversa, entrambe necessarie per l'espressione del gene reporter nelle cellule trasdotte. Imitando il genoma del virus surrogato, il gene reporter è abbracciato nel nucleo dello pseudovirus in forma di RNA. Il gene reporter esprimerà la proteina nelle cellule ospiti. I livelli di espressione genica dei geni reporter possono essere utilizzati per misurare l'efficienza dell'infezione da pseudovirus ^3,4. Il reporter principale è la lucciola luciferasi per misurare le unità di luminescenza relativa (RLU) o l'attività relativa della luciferasi (RLA) nelle cellule trasdotte. Vengono utilizzati anche altri reporter come lacZ, Gaussia e Renilla luciferasi, solo in misura minore⁵.

Gli pseudovirus sono strumenti ideali per studiare gli anticorpi neutralizzanti contro i virus HAPI H5. Per misurare la potenza degli anticorpi neutralizzanti, vengono utilizzati i saggi di neutralizzazione dello pseudovirus (PN)⁶. L'emoagglutinina (HA) e la neuraminidasi (NA) sono glicoproteine sulla superficie del virus dell'influenza A ^7,8. L'HA è composto da un dominio globulare per il legame del recettore e un dominio dello stelo per la fusione della membrana. La proteina NA ha l'attività sialidasi per facilitare il rilascio del virus ^7,8. Un test PN può misurare gli anticorpi neutralizzanti diretti alle proteine HA. Gli anticorpi neutralizzanti diretti alla testa e alla regione dello stelo dell'HA possono anche essere rilevati mediante test di attaccamento virale e di ingresso. Rispetto ai virus wild-type, gli esperimenti di neutralizzazione degli pseudovirus hanno valori di rilevamento più sensibili, possono essere gestiti in modo sicuro in un laboratorio di biosicurezza di livello 2 e sono generalmente più facili da utilizzare nella pratica.

Questo protocollo presenta in dettaglio le procedure e le fasi critiche dei preparati di pseudovirus H5 HPAI e dei saggi PN. Inoltre, discute la risoluzione dei problemi, la limitazione e le modifiche di questi test. In questo studio, il ceppo A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) dei virus HPAI H5N1 è stato utilizzato come esempio. Per ottenere i sieri immunitari utilizzati nei saggi, questo protocollo ha selezionato la proteina HA proveniente dal ceppo TH come immunogeno per immunizzare i topi.

Tutte le operazioni sperimentali correlate allo pseudovirus sono state eseguite in condizioni ABSL2 presso l'Institut Pasteur dell'Accademia cinese delle scienze di Shanghai (IPS, CAS). Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti sulla base dei protocolli sugli animali approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di IPS, CAS.

1. Confezionamento di pseudovirus con trasfezione calcio-fosfato

1. Effettuare sospensioni monocellulari di cellule HEK293FT (9 x 10⁵ per ml) in mezzo DMEM completo (Tabella 1). Aggiungere 10 ml delle sospensioni monocellulari in un matraccio T75, incubare le cellule in un incubatore a 37 °C, 5% di anidride carbonica (CO₂) per 20 ore prima della trasfezione.
   NOTA: HEK293FT passaggio basso (<20 passaggi) è consigliato. Assicurarsi che il monostrato cellulare sia confluente all'80-90%.
2. Sostituire il terreno con 10 ml di terreno completo fresco contenente clorochina (100 μM) 2 ore prima della trasfezione.
3. Mescolare i reagenti e il DNA plasmidico come mostrato nella Tabella 2 e nella Figura 1: ddH 2 O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8,9, 2,5 M CaCl₂e 2x tampone HEPES. Pipettare su e giù 5 volte delicatamente, incubare la miscela a temperatura ambiente (RT) per 20 minuti.
4. Trasferire la miscela nel mezzo sopra le cellule e scuotere delicatamente il pallone. Incubare le cellule nell'incubatore cellulare per 15 ore.
5. Sostituire il fluido con 15 ml di materiale DMEM completo fresco. Incubare le cellule in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ per 65 ore.
   NOTA: Il colore del mezzo sarà arancione chiaro o leggermente giallo e almeno l'80% della cellula dovrebbe mostrare l'effetto citopatico (CPE) al microscopio ottico invertito.
6. Raccogliere il surnatante e centrifugarlo a 2095 x g per 20 minuti a 4 °C. Raccogliere il surnatante, aliquotarlo e conservarlo a -80 °C.

2. Rilevazione dell'espressione delle proteine p24 di HA, NA e HIV-1 dello pseudovirus influenzale

1. Rilevare l'espressione della proteina HA mediante il test dell'emoagglutinina (HA).
   1. Aggiungere 50 μL di PBS nelle colonne 2-12, righe A, B e C di una piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti.
      Nota : le righe A, B e C appartengono a 3 test di replica indipendenti e la colonna 12 viene utilizzata come controllo negativo.
   2. Aggiungere 100 μL di pseudovirus nei pozzetti della colonna 1. Trasferire 50 μL dalla colonna 1 alla colonna 2, miscelare bene pipettando su e giù 5 volte, eseguire le due diluizioni doppie fino all'ultima colonna 11 ed eliminare i 50 μL supplementari dalla colonna 11.
   3. Aggiungere 50 μL di eritrocita allo 0,5% in ciascun pozzetto, pipettare su e giù delicatamente due volte. Incubare la piastra per 30-60 minuti a RT o fino a quando gli eritrociti del controllo negativo formano i punti regolari sul fondo del pozzetto.
   4. Osservare e registrare i titoli HA dello pseudovirus.
      NOTA: L'unità HA degli pseudovirus è il più alto fattore di diluizione del virus che può causare emoagglutinazione al 100% dei globuli rossi.
2. Rilevare l'espressione delle proteine HA e NA mediante il test western-blot.
   NOTA: Tutti i passaggi western-blot sono eseguiti secondo il manuale di clonazione molecolare (4^° edizione).
3. Rilevare l'espressione della proteina HIV-1 p24 mediante il kit ELISA HIV-1 p24 (Table of Materials).
   1. Aggiungere 50 μL del tampone di lisi in 450 μL di campione di pseudovirus. Mescolare accuratamente.
   2. Aggiungere 300 μL del tampone di lavaggio a ciascun pozzetto della micropiastra. Colpire la piastra capovolta per rimuovere completamente il tampone di lavaggio. Ripetere il lavaggio 5 volte.
   3. Aggiungere separatamente 200 μL dello standard e campioni a ciascun pozzetto. Incubarli a 37 °C durante la notte o per 2 ore.
   4. Aspirare il contenuto della piastra e lavarla come descritto al punto 2.3.2.
      NOTA: Lasciare vuoto un pozzetto della piastra di analisi da utilizzare come substrato vuoto.
   5. Aggiungere 200 μL di anticorpi del rivelatore p24 a ciascun pozzetto. Incubarli a 37 °C per 1 ora. Aspirare e lavare la piastra come descritto al punto 2.3.2.
   6. Aggiungere 100 μL della soluzione di lavoro di streptavidina-perossidasi a ciascun pozzetto e incubarli a 37 °C per 30 minuti. Aspirare e lavare la piastra come descritto al punto 2.3.2.
   7. Aggiungere 100 μL della soluzione di lavoro del substato a ciascun pozzetto, compreso il pozzetto bianco del substrato, e incubarli a 37 °C per 30 minuti.
      NOTA: Il colore blu si svilupperà nei pozzi.
   8. Aggiungere 100 μL del tampone di arresto a ciascun pozzetto.
      NOTA: il colore blu diventerà immediatamente giallo.
   9. Leggi la densità ottica a 450 nm entro 15 min. Registrare i titoli p24 dello pseudovirus

3. Titolazione degli pseudovirus

1. Effettuare sospensioni a cella singola di cellule MDCK (5 x 10⁴ per ml) in mezzo DMEM completo, aggiungere 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 e 40000 celle a diversi pozzetti di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Incubare le cellule in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ per 20 ore.
2. Estrarre lo pseudovirus dal frigorifero a -80 °C, scongelarlo sul ghiaccio e vortice lo pseudovirus.
3. Aggiungere 6 pseudovirus HAU (6x unità HA) a ciascun pozzetto di piastra a fondo tondo a 96 pozzetti e ricostituire ciascun pozzetto con DMEM completo fino a 120 μL.
4. Pipettare su e giù per la miscela 5 volte per mescolare accuratamente. Incubare la piastra della miscela in un incubatore a 37 °C, 5 % CO₂ per 1 ora.
5. Trasferire 100 μL della miscela alle cellule nella piastra a 96 pozzetti. Rimettere la piastra di coltura cellulare nell'incubatore per 48 ore, 60 ore e 72 ore dopo l'infezione da virus.
6. Estrarre la piastra dall'incubatore ed eseguire il test della luciferasi (Table of Materials).
7. Rimuovere accuratamente il mezzo dai pozzetti della piastra. Risciacquare le cellule con 200 μL di PBS e rimuovere il PBS il più possibile.
   NOTA: Capovolgere la piastra e scartare il surnatante schiaffeggiandolo inversamente su carta assorbente. Se la linea cellulare di prova non è stata fissata saldamente al fondo, rimuovere con cura l'aspirazione del mezzo.
8. Aggiungere 50 μL del tampone di lisi a ciascun pozzetto e scuotere la piastra di coltura più volte. Conservare il piatto a -80 °C per una notte.
   NOTA: Mescolare 1 volume di tampone di lisi 5x con 4 volumi di acqua per ottenere il tampone di lisi 1x. Equilibrare il tampone di lisi 1x a RT prima dell'uso. Scuotere la piastra per garantire che le cellule siano completamente coperte con il tampone di lisi. Il singolo processo di congelamento-disgelo può aiutare la cellula a essere completamente lisata.
9. Estrarre il piatto, equilibrare a RT per 2 ore.
   NOTA: la cella deve essere completamente lisata.
10. Scuotere la piastra più volte delicatamente e trasferire tutti i lisati cellulari in piastre opache a 96 pozzetti.
11. Aggiungere 50 μL del substrato a ciascun pozzetto, scuotere delicatamente la piastra più volte e mescolare accuratamente il substrato e il tampone di lisi.
12. Misurare la luce prodotta entro 5 minuti utilizzando un luminometro. Registrare i titoli luciferasi dello pseudovirus.
    NOTA: Quando viene aggiunto un substrato appropriato, la luce viene emessa come sottoprodotto attraverso una reazione chimica in cui la luciferina viene convertita in ossiluciferina dall'enzima luciferasi. La quantità di luce prodotta è proporzionale alla quantità dell'enzima luciferasi.

4. Preparazione dei sieri immunitari

NOTA: Il siero immunitario sarà utilizzato per esperimenti correlati alle cellule e l'operazione sperimentale deve essere eseguita in condizioni asettiche.

1. Preparare 12 topi BALB / c femmina di otto settimane. Dividi equamente i topi in due gruppi.
   NOTA: un gruppo era il gruppo DDV e l'altro era il gruppo di controllo negativo.
2. Immunizzazione del gruppo DDV: Prime due volte per via intramuscolare con 100 μg di un plasmide del DNA ottimizzato per il codone che codifica la proteina A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) HA alla settimana 0 e alla settimana 3 e aumenta una volta per via intraperitoneale con 512 particelle simili al virus HAU TH (VLP) alla settimana 6.
3. Immunizzazione del gruppo di controllo: Prime due volte per via intramuscolare con 100 μg di DNA plasmidico vettore vuoto alla settimana 0 e alla settimana 3 e aumenta una volta per via intraperitoneale con HIV-1 gag VLP alla settimana 6.
4. Raccogliere il sangue del topo 2 settimane dopo l'ultima immunizzazione.
   NOTA: Qui, i topi sono stati anestetizzati con pentobarbital sodico (65 mg / kg) al momento della raccolta del sangue. Dopo la raccolta di sangue dalla vena sottomandibolare, i topi sono stati immediatamente eutanasizzati.
5. Mantenere il sangue a RT per 2 ore, poi 4 °C durante la notte. Centrifugare a 900 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante. Inattivare i sieri posizionandoli a 56 °C per 30 minuti.
6. Conservare i sieri immuni in frigorifero a -80 °C per l'uso.
   NOTA: fare riferimento alla Figura 1 supplementare per il diagramma di flusso che descrive le principali procedure di immunizzazione del topo.

5. Saggio di neutralizzazione degli pseudovirus (PN)

1. Effettuare sospensioni a cella singola di cellule MDCK (5 x 10⁴ per ml) in mezzo DMEM completo e aggiungere 100 μL della sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Incubare le cellule in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ per 20 ore.
2. Estrarre lo pseudovirus e i sieri dal frigorifero a -80 °C, scongelarli sul ghiaccio e vortice accuratamente.
3. Diluire i sieri nel mezzo completo 20 volte e aggiungere 100 μL di mezzo DMEM completo ai pozzetti di una piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti dalle colonne 2-10.
4. Aggiungere 200 μL dei sieri diluiti nei pozzetti della colonna 2, trasferire successivamente 100 μL dalla colonna 2 alla colonna 3, diluire i sieri come 1:20, 1:40, 1:80, ecc., a 1:10240 successivamente dalla colonna 2 alla colonna 10 ed eliminare i 100 μL dalla colonna 10.
5. Aggiungere 100 μL di mezzo completo DMEM ai pozzetti della colonna 11 come controllo negativo.
6. Aggiungere 100 μL di pseudovirus a ciascun pozzetto, pipettare su e giù per la miscela 5 volte accuratamente e incubare la piastra della miscela in 37 °C, 5% CO₂ per 1 ora.
7. Trasferire 100 μL della miscela dalla piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti al pozzetto corrispondente della piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti. Rimettere la piastra nell'incubatore (37 °C, 5% CO₂) per 60 ore.
8. Estrarre il piatto dall'incubatore. Eseguire il test della luciferasi come descritto nei punti 3.7-3.12.

6. Saggio di attaccamento di pseudovirus

1. Effettuare sospensioni a cella singola di cellule MDCK (4 x 10⁴ per ml) in mezzo DMEM completo e aggiungere sospensioni di celle da 100 μL a ciascun pozzetto in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO₂ per 20 ore.
2. Incubare lo pseudovirus con sieri in DMEM contenente 1% BSA a 4 °C durante la notte.
   NOTA: Il volume della miscela è di 100 μL.
3. Bloccare le cellule MDCK con 100 μL per pozzetto di DMEM contenente l'1% di BSA a 4 °C per 1 ora.
4. Inoculare lo pseudovirus e la miscela di siero (100 μL) sul monostrato MDCK e incubarlo a 4 °C per 2 ore.
5. Lavare la piastra cellulare 4 volte con PBS contenente l'1% di BSA per rimuovere qualsiasi virus non legato.
6. Lisare le cellule con 100 μL di tampone di lisi luciferasi a RT per 30 minuti.
7. Quantificare la quantità di virus legato sulle cellule con un kit ELISA HIV-1 p24 come descritto sopra (paragrafo 2.3).

7. Valutazione dell'ingresso virale

1. Effettuare sospensioni a cella singola di cellule MDCK (5 x 10⁴ per ml) in mezzo DMEM completo e aggiungere 100 μL della sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO₂ per 20 ore prima del test.
2. Inoculare lo pseudovirus (100 μL) su un monostrato MDCK in una piastra da 96 pozzetti a 4 °C per 6 ore.
3. Lavare la piastra cellulare 4 volte con PBS contenente l'1% di BSA per rimuovere gli pseudovirus non legati.
4. Aggiungere 100 μL dei sieri o sieri immunitari diluiti in serie da topi con vaccinazione fittizia in DMEM contenente l'1% di BSA al monostrato e incubare la cellula a 4 °C per 2 ore.
5. Rimuovere il surnatante cellulare e lavare la piastra di coltura cellulare 4 volte con PBS contenente BSA all'1%.
6. Aggiungere DMEM fresco alle cellule e incubare per 60 ore in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ .
7. Misurare l'attività relativa della luciferasi (RLA) delle cellule come descritto nei passaggi 3.7-3.12.
   NOTA: L'ingresso virale, come indicato da RLA, è stato espresso come percentuale della lettura ottenuta in assenza di sieri, che è stata impostata come 100%.

Espressione delle proteine p24 di HA, NA e HIV-1 dello pseudovirus influenzale
Per identificare l'efficienza del confezionamento virale, le scorte di pseudovirus influenzali sono state rilevate per la prima volta mediante saggio HA (Figura 2A). Le unità HA per millilitro di pseudovirus influenzali sono 643 (Tabella 3). Il saggio western-blot e i saggi ELISA sandwich sono stati utilizzati per testare l'espressione delle proteine p24 di HA, NA e HIV-1. Quindi sono stati calcolati i rapporti dell'unità HA e la quantità di gag p24 per gli pseudovirus. I risultati del test western-blot hanno mostrato che c'erano 4 tipi di proteine: proteine HA0, HA1, HA2 e NA (Figura supplementare 2). Ciò indica che le proteine avvolgenti degli pseudovirus influenzali sono simili a quelle dei virus wild-type. I rapporti di HA e Gag p24 erano all'interno di un intervallo normale come riportato (Tabella 3) 9.

Tabella 3: Quantificazione dello pseudovirus H5.

Titolazione pseudovirus
Per misurare la concentrazione di particelle virali funzionali, è stata rilevata l'attività relativa della luciferasi (RLA) dello pseudovirus. Le letture RLA dipendono da molte variabili. Per identificare l'effetto della quantità di cellule trasdotte sulle letture RLA, abbiamo seminato le cellule di 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 e 40000 per pozzetto di piastra a 96 pozzetti (Figura 2). I risultati hanno mostrato che le letture RLA dello pseudovirus sono le più alte e l'errore standard della media è il più basso quando 5000 cellule sono seminate in un pozzo di piastra a 96 pozzetti (Figura 4A). Per identificare l'effetto del tempo di incubazione, le letture RLA vengono rilevate a 48 ore, 60 ore e 72 ore dopo l'infezione da virus. I risultati hanno mostrato che quando incubati per 60 ore, le letture RLA dello pseudovirus sono più alte nei valori e migliori nella ripetibilità con un basso errore standard della media (Figura 4B). I risultati indicano che è adatto a seminare 5000 cellule in un pozzetto di una piastra da 96 pozzetti e rilevare le letture RLA 60 ore dopo l'infezione da virus.

Saggi PN
I titoli di neutralizzazione dei sieri immunitari del gruppo di controllo e del gruppo DDV sono stati misurati mediante saggi PN (Figura 5). Come mostrato nella Figura 5A, i sieri immunitari del gruppo DDV hanno mostrato titoli di neutralizzazione elevati contro il ceppo pseudovirus A/Thailand/1(KAN)-1/04. Al contrario, i sieri del gruppo di controllo non hanno mostrato alcuna attività di neutralizzazione (Figura 5B). Rispetto ai test sierologici tradizionali (saggi HI e MN), i test PN sono più sensibili (i dati non sono mostrati).

Saggio di neutralizzazione dell'allegato
Alcuni anticorpi di neutralizzazione possono ostacolare l'attaccamento dei virus ai recettori dell'acido sialico. Questi anticorpi sono diretti alla testa HA e sono predominanti dopo l'immunizzazione con vaccino commerciale o infezione del virus dell'influenza. Per identificare l'attività neutralizzante di questi anticorpi, vengono eseguiti saggi di neutralizzazione dell'attaccamento (Figura 3). Rispetto ai sieri di controllo, l'attività neutralizzante dei sieri immunitari è potente, il che indica che ci sono molti anticorpi diretti alla testa HA nei sieri immunitari (Figura 6A).

Valutazione dell'ingresso virale
Questo test viene utilizzato per identificare gli anticorpi che ostacolano la fusione dell'involucro virale e delle membrane endosomiali durante l'infezione da virus influenzale. Questi anticorpi sono diretti al dominio del gambo HA e sono comunemente meno potenti. Per misurare i titoli di neutralizzazione di questi anticorpi, vengono eseguiti saggi post-attacco (Figura 3). Ci sono differenze significative tra i sieri immunitari e i sieri di controllo, il che indica che ci sono anticorpi diretti alla regione dello stelo HA nei sieri immunitari (Figura 6B).

Figura 1: Diagramma di flusso della trasfezione mediata dal calcio. Questo diagramma di flusso è usato per descrivere le principali procedure di trasfezione mediata dal calcio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Quantificazione e titolazione dello pseudovirus. (A) Diagramma di flusso del saggio HA sugli pseudovirus che descrive le fasi principali del saggio HA sugli pseudovirus. (B) Diagramma di flusso del saggio sullo pseudovirus P24 che descrive le fasi principali del test sullo pseudovirus P24. (C) Diagramma di flusso del saggio di titolazione degli pseudovirus che descrive le fasi principali del saggio di titolazione degli pseudovirus. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Saggi di neutralizzazione basati su pseudovirus. (A) Diagramma di flusso del saggio PN che descrive le fasi principali del test PN. (B) Diagramma di flusso del saggio di attaccamento di pseudovirus che descrive le fasi principali del test di attaccamento. (C) Diagramma di flusso della valutazione del saggio di ingresso virale che descrive le fasi principali del test di ingresso virale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Titolazione di pseudovirus. (A) Diverse quantità di celle per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti influenzano le letture RLA. 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 e 40000 cellule sono state seminate in una piastra da 96 pozzetti. (B) Il diverso tempo di raccolta influenza le letture della RLA. Le letture RLA vengono rilevate a 48 ore, 60 ore e 72 ore dopo l'infezione da virus. I dati raccolti da tre esperimenti indipendenti sono presentati come media ± SEM; le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM). È stato eseguito un test ANOVA unidirezionale con Tukey. P < 0,0001; ns, non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Risposte anticorpali neutralizzanti H5 rilevate con pseudovirus. (A) Titolazione delle risposte anticorpali neutralizzanti dei sieri immunitari dal gruppo DDV. (B) Titolazione delle risposte anticorpali neutralizzanti dei sieri immunitari dal gruppo di controllo. L'IC50 è definito come le diluizioni reciproche dell'anticorpo neutralizzante che può inibire il 50% dello pseudovirus. I dati raccolti da tre esperimenti indipendenti sono presentati come media ± SEM; le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM). Lo pseudovirus VSVG è stato usato come controllo negativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Rilevazione della potenza degli anticorpi di neutralizzazione mediante test di legame e di ingresso virale. (A) I sieri immunitari del gruppo DDV, non quelli del gruppo di controllo, inibiscono l'attaccamento virale alle cellule. (B) I sieri immunitari del gruppo DDV, non quelli del gruppo di controllo, inibiscono parzialmente l'infezione virale post-attaccamento. I dati raccolti da tre esperimenti indipendenti sono presentati come media ± SEM; le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Composizione completa del mezzo DMEM.

Tabella 2: Sistema di confezionamento di pseudovirus.

Figura supplementare 1: Diagramma di flusso dell'immunizzazione del topo. Questo diagramma di flusso descrive le principali procedure di immunizzazione del topo. I sieri immunitari sono stati utilizzati come campioni. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Espressione delle proteine p24 di HA, NA e HIV-1 dello pseudovirus influenzale. Western-blot di proteine pseudovirali. Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.