Qui descriviamo un protocollo per il confezionamento di pseudovirus e la misurazione dell'attività neutralizzante degli anticorpi.
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Articolo metodologico
Preparazione di virus dell'influenza aviaria H5 pseudo-tipizzati con metodo di trasfezione del fosfato di calcio e misurazione dell'attività neutralizzante degli anticorpi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Dal 1996, i virus H5 dell'influenza aviaria ad alta patogenicità (HPAI) del lignaggio A/goose/Guangdong/1/96 hanno causato epidemie influenzali nel pollame e negli uccelli selvatici. Occasionalmente, anche gli esseri umani ne sono vittime, il che si traduce in un'alta mortalità. Tuttavia, la ricerca sui virus HPAI è spesso ostacolata, considerando che deve essere gestita all'interno di laboratori di livello 3 di biosicurezza. Per affrontare questo problema, gli pseudovirus sono adottati come alternativa ai virus wild-type in alcuni esperimenti di studi H5 HPAI. Gli pseudovirus si dimostrano gli strumenti ideali per studiare gli anticorpi neutralizzanti contro i virus H5 HPAI. Questo protocollo descrive le procedure e le fasi critiche dei preparativi di pseudovirus H5 HPAI e dei saggi di neutralizzazione degli pseudovirus. Inoltre, discute la risoluzione dei problemi, la limitazione e le modifiche di questi test.
Introduzione
Dal 1996, i virus H5 dell'influenza aviaria ad alta patogenicità (HPAI) del lignaggio A/goose/Guangdong/1/96 hanno causato continue epidemie di influenza nel pollame e negli uccelli selvatici, causando enormi perdite socio-economiche nell'industria avicola globale. A volte, anche gli esseri umani vengono infettati da esso, di fronte ad un alto tasso di mortalità 1,2. Tuttavia, la ricerca sul virus HPAI è spesso ostacolata, dato che non può essere gestita al di fuori dei laboratori di livello 3 di biosicurezza. Per affrontare questo problema, gli pseudovirus sono adottati come alternativa ai virus wild-type in ....
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Protocollo
Tutte le operazioni sperimentali correlate allo pseudovirus sono state eseguite in condizioni ABSL2 presso l'Institut Pasteur dell'Accademia cinese delle scienze di Shanghai (IPS, CAS). Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti sulla base dei protocolli sugli animali approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di IPS, CAS.
1. Confezionamento di pseudovirus con trasfezione calcio-fosfato
- Effettuare sospensioni monocellulari di cellule HEK293FT (9 x 105 per ml) in mezzo DMEM completo (Tabella 1). Aggiungere 10 ml delle sospensioni monocellulari in un mat....
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Risultati
Espressione delle proteine p24 di HA, NA e HIV-1 dello pseudovirus influenzale
Per identificare l'efficienza del confezionamento virale, le scorte di pseudovirus influenzali sono state rilevate per la prima volta mediante saggio HA (Figura 2A). Le unità HA per millilitro di pseudovirus influenzali sono 643 (Tabella 3). Il saggio western-blot e i saggi ELISA sandwich sono stati utilizzati per testare l'espressione delle proteine p24 di HA, NA e HIV-1. Quin.......
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Discussione
HEK293FT cellule sono solitamente utilizzate come cellule di imballaggio per produrre pseudovirus. Il rilevamento regolare del micoplasma è essenziale durante la coltura cellulare. La contaminazione da micoplasma può ridurre drasticamente i raccolti di pseudovirus e talvolta vicino allo zero. Rispetto ad altre contaminazioni, le contaminazioni da micoplasma non portano a variazioni del valore del pH o torbidità del terreno di coltura cellulare. Anche un'alta concentrazione di micoplasma non è visibile ad occhio nudo o al.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalle borse di ricerca dell'Innovation Capacity Building Project della provincia di Jiangsu (BM2020019), Shenzhen Scientific and Technological Project (No. JSGG20200225150702770), Programma di ricerca prioritaria strategica dell'Accademia cinese delle scienze (XDB29030103), Progetto scientifico e tecnologico del Guangdong (n. 2020B1111340076) e Programma di ricerca aperta del laboratorio della baia di Shenzhen (n. SZBL202002271003).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagente |
| Piastre per colture cellulari a 96 pozzetti (fondo piatto) | Thermo fisher scientific | 167008 | materiale di consumo |
| Piastre per colture cellulari a 96 pozzetti (fondo tondo) | Thermo fisher scientific | 163320 | materiale di consumo |
| Allegra X-15R | Beckman coltro | -- | Attrezzatura/Centrifuga |
| Siringhe da insulina BD | BD 324910 | materiale di consumo | |
| Cloruro di calcio anidro | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagente |
| clorochina difosfato | Selleck | S4157 | Reagente |
| Dulbecco' s Medium Eagle modificato (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagente |
| Fetale Siero bovino | Gibco | 16000-044 | Reagente |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Linea cellulare |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagente |
| HIV-1 p24 Antigene ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Kit di reagenti |
| Luciferase Assay System Freezer Confezione | Promega | E4530 | Kit di reagenti |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Linea cellulare |
| Provette per microcentrifuga 1,5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | materiale di consumo |
| Nunc Provette per centrifuga coniche 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | materiale di consumo |
| Nunc Provette per centrifuga coniche 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | materiale di consumo |
| Nunc EasYFlask 75 cm2Thermo | fisher scientific | 156499 | materiale di consumo |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15140-122 | Reagente |
| Puntali per pipette (10 μ L) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | materiale di consumo |
| Puntali per pipette (100 μ L) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | materiale di consumo |
| Puntali per pipette (1000 μ L) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | materiale di consumo |
| Pipette sierologiche (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | materiale di consumo |
| Pipette sierologiche (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | materiale di consumo |
| Tripsina/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagente |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | -- | Attrezzature/Lettore di micropiastre |
| Camicia d'acqua Incubatore | Thermo fisher scientific | 3111 | Attrezzature/Incubatore cellulare |
| Pentobarbital sale sodico | Sigma | 57-33-0 | Reagente |
Riferimenti
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z.
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Ristampe e permessi
