Articolo metodologico

Modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per sezionare il coinvolgimento primario del cilio durante lo sviluppo neocorticale

DOI:

10.3791/62667

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25 marzo 2022

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1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo protocolli dettagliati per la generazione e la caratterizzazione di modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte umane (hIPSC) di sviluppo neocorticale, nonché metodologie complementari che consentono l'analisi qualitativa e quantitativa della biogenesi e della funzione del cilio primario (PC).

Abstract

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Le ciglia primarie (PC) sono organelli dinamici non mobili a base di microtubuli che sporgono dalla superficie della maggior parte delle cellule di mammifero. Emergono dal centriolo più vecchio durante la fase G1/G0 del ciclo cellulare, mentre si disassemblano quando le cellule rientrano nel ciclo cellulare al limite di fase G2/M. Funzionano come hub di segnale, rilevando e trasducendo segnali extracellulari cruciali per molti processi cellulari. Simile alla maggior parte dei tipi di cellule, tutte le cellule staminali neurali neocorticali e progenitrici (NSPC) hanno dimostrato di ospitare un PC che consente loro di percepire e trasdurre segnali specifici necessari per il normale sviluppo corticale cerebrale. Qui, forniamo protocolli dettagliati per generare e caratterizzare modelli cellulari bidimensionali (2D) e tridimensionali (3D) da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hIPSC) per sezionare ulteriormente il coinvolgimento del PC durante lo sviluppo neocorticale. In particolare, presentiamo protocolli per studiare la biogenesi e la funzione del PC in NSPC derivati da rosette neurali 2D, inclusa la trasduzione del percorso Sonic Hedgehog (SHH). Per sfruttare l'organizzazione tridimensionale (3D) degli organoidi cerebrali, descriviamo un metodo semplice per l'imaging 3D di organoidi cerebrali immunocolorati in toto . Dopo la compensazione ottica, la rapida acquisizione di interi organoidi consente il rilevamento sia di centrosomi che di PC su progenitori neocorticali e neuroni dell'intero organoide. Infine, descriviamo in dettaglio la procedura per l'immunocolorazione e la pulizia di spesse sezioni organoidi fluttuanti che preservano un grado significativo di informazioni spaziali 3D e consentendo l'acquisizione ad alta risoluzione necessaria per l'analisi qualitativa e quantitativa dettagliata della biogenesi e della funzione del PC.

Introduzione

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Le ciglia primarie (PC) sono organelli a base di microtubuli che percepiscono e trasducono una pletora di segnali chimici e meccanici dall'ambiente extracellulare. In particolare, il PC è l'organello centrale per la trasduzione della via di segnalazione hedgehog nei vertebrati1,2. Mentre la maggior parte delle cellule neurali ha dimostrato a lungo di ospitare un PC, il contributo di questo organello nel modellare il sistema nervoso centrale è stato a lungo sottovalutato. Gli studi sullo sviluppo neocorticale hanno portato alla scoperta di cellule staminali neurali multiple e progenitrici (NSPC), tutte dotate d....

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Protocollo

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1. Generazione di modelli cellulari 2D hIPS di sviluppo neocorticale

  1. Formazione di rosette neurali
    1. Inizia con le colture hIPSC che ospitano grandi colonie regolari, mostrando meno del 10% di differenziazione e non più dell'80% di confluenza.
    2. Risciacquare le hIPSC con 2 ml di PBS.
    3. Aggiungere 2 mL di mezzo di induzione NSPC integrato con l'inibitore Rock (NIM + 10 μM di Y-27632).
    4. Sezionare manualmente ogni colonia hIPSC da un piatto da 35 mm usando un ago per tagliare ogni colonia con precisione in direzioni orizzontali e verticali per creare un modello a scacchiera che divide ogni co....

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Risultati

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Modelli cellulari 2D hIPS per studiare la biogenesi e la funzione del cilio primario
Il protocollo qui dettagliato è stato adattato da studi pubblicati in precedenza20,21,22. Questo protocollo consente la generazione di strutture neurali a rosetta che contengono progenitori neocorticali e neuroni simili a quelli osservati nella neocorteccia in via di sviluppo. La convalida dettagliata può essere eseguita medi.......

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Discussione

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I PC sono ora considerati organelli chiave che regolano i passaggi cruciali durante il normale sviluppo corticale cerebrale18,19,31 tra cui l'espansione e l'impegno NSPC8,9,10,11,12, nonché la migrazione neuronale13,14

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Agence Nationale de la Recherche (ANR) a S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) e N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 e ANR-19-CE16-0002-01). LB è supportato dall'ANR nell'ambito del programma Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01) e dalla Fondation Bettencourt Schueller (programma MD-PhD). L'Imagine Institute è sostenuto da finanziamenti statali dell'ANR nell'ambito del programma Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01, progetti CrossLab) e come parte del secondo programma Investissements d'Avenir (ANR-17-RHUS-0002).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-Mercapto&eacuto; thanol (50 mM)ThermoFisher Scientific31350010
pozzetti Clear Flat Bottom Ultra-Low Attack Piastre a pozzetti multipliCorning3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment MicroplateCorning7007
B-27 Supplement (50X), meno vitamina AThermoFisher Scientific 12587010
B-27 Supplement (50X), senza sieroThermoFisher Scientific17504044
CellAder, tampone di diluizioneStemCell Technologies7183
DMEM/F-12, GlutamaxThermoFisher Scientific
DMSOATCC4-X
DorsomorphinStemCell Technologies72102
Easy Grip 35, Falcon da 10mm, 353001
EDTAThermoFisher Scientific15575020
EGF , 25µ gThermofischerPHG0315
FGF2 , 25µ gThermofischerPHG0264
Reagente delicato per la dissociazione cellulareStemCell Technologies7174
InsulinaThermoFisher Scientific12585014
Siero knockoutThermoFisher Scientific10828028
Laminina (1 mg)Thermofischer23017015
LDN193189StemCell Technologies72147
Matrigel Fattore di crescita ridottoCorning354230
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100X)ThermoFisher Scientific11140050
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381-250G
mTeSR1StemCell Technologies85850
Neural Basal MediumThermofischer21103049
Agitatore orbitaleDutscher995002
PBSThermoFisher Scientific14190094
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
PFA 32%Microscopia elettronicaScienze 15714
Poli-L-Ornitina (PO)SigmaP4957
BDNF 10 umano ricombinante µ gStem Cell Technologies78005
FGF umano ricombinante di basePeprotech100-18B
rSHHR& D Systems8908-SH
SAGSanta CruzSc-202814
SB431542StemCell Technologies72232
Stembeads FGF2StemCultureSB500
SaccarosioSigma AldrichS7903-250G
Superfrost Plus Vetrini di adesioneThermo ScientificJ1800AMNZ
Supplé mentment N2- (100X)ThermoFisher Scientific17502048
TDE 2,2'-TiodietanoloSigma Aldrich166782-500G
VitronectinStem Cell Technologies7180
Y-27632StemCell Technologies72304
Anticorpi primari
ARL13BAbcamAb1366481/200e
ARL13BProteintech17711-1-AP1/500e
CTIP2AbcamAb184651/500e
GLI2R& D SystemsAF35261/100
GPR161Proteintech13398-1-AP1/100
N-CaderinaBD Trasduzione Lab6109211/500e
P-VimentinMBLD076-31/500e
PAX6BiolegendPRB-278P1/200e
PCNTAbcamAb44481/1000e
S0X2R& D SystemsMAB20181/200e
SATB2AbcamAb515021/200e
TBR2AbcamAb2168701/400e
TPX2NovusBioNB500-1791/500e
γ TUBULINSigma AldrichT65571/500e
Anticorpi secondari
Asino anti-coniglio AF488ThermoFisher ScientificA212061/500e
Capra anti-topo AF555ThermoFisher ScientificA214221/500e
Capra anti-topo AF647ThermoFisher ScientificA212361/500e
Capra anti-ratto AF555ThermoFisher ScientificA214341/500e
6 , , 31331028 , , , ,

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. ....

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Cellule staminali pluripotenti indotteOrganoidi cerebraliRosette neuraliInibizione duale di SMADAnalisi di immunocolorazioneMicroscopia confocaleCiliogenesiVia di segnalazione di Sonic Hedgehog

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