L'ossidazione del tiolo proteico ha implicazioni significative in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche normali. Descriviamo i dettagli di un metodo di proteomica redox quantitativa, che utilizza la cattura assistita da resina, la marcatura isobarica e la spettrometria di massa, consentendo l'identificazione sito-specifica e la quantificazione dei residui di cisteina ossidati in modo reversibile delle proteine.
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Articolo metodologico
Cattura assistita da resina accoppiata con etichettatura isobarica Tandem Mass Tag per la quantificazione multiplexata dell'ossidazione del tiolo proteico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Modificazioni ossidative reversibili sui tioli proteici sono recentemente emerse come importanti mediatori della funzione cellulare. Qui descriviamo la procedura dettagliata di un metodo di proteomica redox quantitativa che utilizza la cattura assistita da resina (RAC) in combinazione con la marcatura isobarica tandem mass tag (TMT) e la cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS / MS) per consentire la quantificazione stechiometrica multiplata dei tioli proteici ossidati a livello di proteoma. Le informazioni quantitative sito-specifiche sui residui di cisteina ossidati forniscono ulteriori informazioni sugli impatti funzionali di tali modifiche.
Il flusso di lavoro è adattabile a molti tipi di campioni, comprese le cellule in coltura (ad esempio, mammiferi, procarioti) e interi tessuti (ad esempio, cuore, polmone, muscolo), che sono inizialmente lisati / omogeneizzati e con tioli liberi alchilati per prevenire l'ossidazione artificiale. I tioli proteici ossidati vengono quindi ridotti e catturati da una resina di affinità tiolica, che ottimizza e semplifica le fasi del flusso di lavoro consentendo l'esecuzione delle procedure di digestione, etichettatura e lavaggio senza ulteriore trasferimento di proteine / peptidi. Infine, i peptidi marcati vengono eluiti e analizzati da LC-MS/MS per rivelare cambiamenti stechiometrici completi relativi all'ossidazione del tiolo attraverso l'intero proteoma. Questo metodo migliora notevolmente la comprensione del ruolo della regolazione redox-dipendente negli stati fisiologici e fisiopatologici correlati all'ossidazione del tiolo proteico.
Introduzione
In condizioni omeostatiche, le cellule generano specie reattive di ossigeno, azoto o zolfo che aiutano a facilitare i processi, come il metabolismo e la segnalazione 1,2,3, estendendosi sia ai procarioti che agli eucarioti. I livelli fisiologici di queste specie reattive sono necessari per il corretto funzionamento cellulare, noto anche come "eustress"1,4. Al contrario, un aumento degli ossidanti che porta a uno squilibrio tra ossidanti e antiossidanti può causare stress ossidativo, o "distress"1
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Protocollo
Tutte le procedure descritte nel protocollo relative a campioni/tessuti animali o umani sono state approvate e hanno seguito le linee guida istituzionali del comitato etico per la ricerca umana e animale.
1. Omogeneizzazione/lisi del campione
- Campioni di tessuto congelati
- Tritare il tessuto congelato (~ 30 mg) su un vetrino da microscopio su ghiaccio secco usando una lama di rasoio prerefrigerata e una pinza. Trasferire il tessuto tritato in un tubo di polistirene a fondo tondo da 5 mL prerefrigerato contenente 700 μL di tampone A (vedi Tabella 1) e incubare su ghiaccio per 30 minuti, al riparo dalla luce.<....
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Risultati
Il completamento del protocollo comporterà un arricchimento altamente specifico di peptidi precedentemente ossidati contenenti cisteina, spesso con specificità del >95% 27,35,36. Tuttavia, diverse fasi chiave del protocollo richiedono un'attenzione speciale, ad esempio il blocco iniziale dei tioli liberi prima della lisi/omogeneizzazione del campione, che vieta l'ossidazione artificiale e l'arricchimento non specifico dei tio.......
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Discussione
La cattura assistita da resina è stata utilizzata in una varietà di tipi di campioni e sistemi biologici per lo studio delle modificazioni ossidative dei residui di cisteina25,29,30. Questo metodo consente la valutazione di campioni a più livelli e letture, comprese proteine e peptidi utilizzando SDS-PAGE e analisi western blot, nonché singoli siti di cisteina utilizzando la spettrometria di massa. Indipendentemente dal tipo di .......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse, finanziari o di altro tipo.
Ringraziamenti
Parti del lavoro sono state supportate da NIH Grants R01 DK122160, R01 HL139335 e U24 DK112349
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-(Piridilditio)etilammina cloridrato | Med Chem Express | HY-101794 | Reagente per la sintesi interna di resine |
| Provette da centrifuga LoBind da 2,0 mL Provette da centrifuga | Eppendorf | 22431048 | |
| 5,0 mL Provette da centrifuga LoBind | Eppendorf | 30108310 | |
| 5,0 mL | Falcon | 352054 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| Tiolo attivato Sepharose 4B | Sigma Aldrich | T8512 | Potenziale sostituto della resina di affinità tiolica |
| Filtro centrifugo Amicon Ultra da 0,5 mL | Millipore Sigma | UFC5010BK | |
| Bicarbonato di ammonio | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Acido bicinconico (BCA) | Thermo Scientific | 23227 | Reagente per saggi proteici |
| Centrifuga Eppendorf | 5810R | ||
| Centrifuga | Eppendorf | 5415R | |
| Ditiotreitolo (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Tampone HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Omogeneizzatore | BioSpec Prodotti | 985370 | |
| Iodoacetimide (IAA) | Sigma Aldrich | I1149 | |
| N-etilmaleimmide | Sigma Aldrich | 4259 | |
| NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow | Cytiva | 17-0906-01 | Reagente per la sintesi interna di resine |
| QIAvac 24 Plus collettore a vuoto | Qiagen | 19413 | |
| Cloruro di sodio | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Sodio dodecil solfato (SDS) | Sigma Aldrich | L6026 | |
| Sonicatore | Branson | 1510R-MT | |
| Colonne di rotazione | Thermo Scientific | 69705 | |
| Colonne a fase inversa Strata C18-E | Phenomenex | 8B-S001-DAK | Desalinizzazione dei peptidi |
| Thermomixer | Eppendorf | 5355 | |
| Tiopropil Sefarosio 6B | GE Healthcare | 17-0420-01 | Resina di affinità per i tioli; *La produzione della resina di tiopropil sefarosio 6B è stata interrotta dal produttore (vedere il protocollo per i dettagli). |
| Etichette isobariche TMT (16 plex) | Thermo Scientific | A44522 | Reagente per marcatura di peptidi; disponibile in più formati |
| Tampone bicarbonato di trietilammonio (TEAB)Acido | Sigma Aldrich | T7408 | |
| (TFA) | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tripsina | Promega | V5820 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Vacufuge Plus speedvac | Eppendorf | 22820001 | concentratore sottovuoto |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 |
Riferimenti
- Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
- Adams, L., Franco, M. C., Estevez, A. G. Reactive nitrogen species in cellular s....
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Ristampe e permessi
