Articolo metodologico

Scambio idrogeno/deuterio basato sull'elettroforesi capillare per la caratterizzazione conformazionale di proteine con spettrometria di massa top-down

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DOI:

10.3791/62672

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8 giugno 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Materials Science, Nanjing Normal University, 2Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, 3Department of Chemistry, University of British Columbia

In questo articolo

Sommario

Qui viene presentato un protocollo per un approccio di scambio idrogeno/deuterio (HDX) basato sull'elettroforesi capillare accoppiato con la spettrometria di massa top-down. Questo approccio caratterizza la differenza nelle strutture di ordine superiore tra diverse specie proteiche, comprese le proteine in diversi stati e diverse proteoforme, conducendo simultaneamente HDX differenziale e separazione elettroforetica.

Abstract

La risoluzione dell'eterogeneità conformazionale di più stati proteici che coesistono in soluzione rimane uno dei principali ostacoli nella caratterizzazione delle terapie proteiche e nella determinazione delle vie di transizione conformazionali critiche per le funzioni biologiche, che vanno dal riconoscimento molecolare alla catalisi enzimatica. La reazione di scambio idrogeno/deuterio (HDX) accoppiata con l'analisi spettrometrica di massa top-down (MS) fornisce un mezzo per caratterizzare le strutture e le dinamiche di ordine superiore delle proteine in modo conforme-specifico. Il potere risolutivo conformazionale di questa tecnica dipende fortemente dall'efficienza di separare gli stati proteici a livello proteico intatto e ridurre al minimo il contenuto protico residuo non deuterato durante le reazioni HDX.

Qui descriviamo una variante basata sull'elettroforesi capillare (CE) dell'approccio HDX MS che mira a migliorare la risoluzione conformazionale. In questo approccio, le proteine subiscono reazioni HDX mentre migrano attraverso una soluzione elettrolitica di fondo deuterata (BGE) durante la separazione elettroforetica capillare. Diversi stati proteici o proteoforme che coesistono in soluzione possono essere separati in modo efficiente in base ai loro diversi rapporti carica-dimensione. La differenza nella mobilità elettroforetica tra proteine e molecole di solvente protico riduce al minimo il solvente residuo non deuterato, risultando in un ambiente di deuterazione quasi completo durante il processo HDX. L'interfaccia CE-MS microviale flow-through consente un'efficiente ionizzazione elettrospray delle specie proteiche eluite a seguito di una rapida miscelazione con la soluzione modificante estinguente e denaturante all'uscita dello spruzzatore. L'analisi online top-down della SM misura il livello di deuterazione globale delle specie proteiche intatte eluite e, successivamente, la deuterazione dei loro frammenti in fase gassosa. Questo documento dimostra questo approccio nell'HDX differenziale per i sistemi, comprese le varianti proteiche naturali che coesistono nel latte.

Introduzione

Distinguere le specie proteiche in diversi stati conformazionali, leganti o modificativi e caratterizzare le loro differenze strutturali è importante per monitorare i percorsi di transizione tra queste specie coinvolte in eventi biologici, che vanno dal riconoscimento molecolare alla catalisi enzimatica, e comprendere i meccanismi alla base di questi eventi. Le tecniche biofisiche convenzionali non forniscono una soluzione completa a causa delle limitazioni come la risoluzione insufficiente e la perdita di informazioni dinamiche in soluzione. Lo scambio idrogeno/deuterio accoppiato con la spettrometria di massa (HDX MS) è una tecnica che etichetta le caratteristiche strutturali e conformazionali delle proteine con deuterio (2H) attraverso lo scambio tra atomi di idrogeno labile di proteine e 2H dalla soluzione di 2H2O deliberatamente introdotta. I protoni coinvolti nel legame idrogeno o che sono sequestrati dal solvente all'interno della proteina non si scambiano facilmente1. Pertanto, poiché il tasso di cambio in un sito scambiabile dipende fortemente dal suo coinvolgimento in strutture di ordine superiore, le strutture proteiche possono essere rivelate ad alta risoluzione spaziale da MS che sonda l'estensione e il tasso di assorbimento di 2H in base alle diverse masse atomiche tra 1H e 2H. Negli ultimi decenni, HDX MS è diventata una tecnica di eccezionale successo per lo studio delle conformazioni proteiche e delladinamica 2.

Nel classico approccio bottom-up di HDX MS, l'insieme di specie proteiche in diversi stati conformazionali, leganti o modificativi è proteolizzato senza separazione a livello proteico intatto, rendendo impossibile caratterizzare le singole specie analizzando i frammenti proteolitici risultanti con contenuto di deuterio contorto. Al contrario, nell'approccio top-down, diversi stati proteici o proteoforme che hanno incorporato diversi contenuti di deuterio danno origine a molteplici distribuzioni di masse proteiche intatte in una scansione della SM. Ciò consente di separare le singole specie mediante la selezione di massa di ioni corrispondenti a ciascuna distribuzione di massa utilizzando un filtro di massa appropriato (come un quadrupolo) e la caratterizzazione delle loro differenze conformazionali nella successiva analisi TANDEM MS 3,4,5,6. Tuttavia, l'efficienza della separazione degli stati proteici o dei proteoformi in questa strategia è limitata dall'entità della differenza nelle loro corrispondenti distribuzioni di massa.

L'elettroforesi capillare (CE) fornisce un mezzo per separare le specie proteiche in base alle loro diverse cariche e dimensioni idrodinamiche nella fase di soluzione con alta efficienza7. La combinazione di CE con HDX offre un'ulteriore separazione degli stati proteici o delle proteoforme nella fase di soluzione. Inoltre, il piccolo volume del capillare CE consente l'utilizzo di una soluzione completamente deuterata come soluzione elettrolitica di fondo (BGE), cioè il buffer in esecuzione, rendendo il capillare come reattore HDX per campioni proteici. A causa della differenza nella mobilità elettroforetica tra proteine e reagenti protici nel processo di elettroforesi, la conduzione di HDX durante la CE si traduce in un ambiente di deuterazione quasi completo per gli analiti proteici con contenuti residui non deuterati minimi, migliorando così la sensibilità dell'analisi strutturale utilizzando i dati HDX. Pertanto, abbiamo sviluppato un approccio HDX differenziale basato su CE accoppiato con SM top-down per caratterizzare le strutture proteiche di ordine superiore in modo specifico per stato o proteoforme8.

Questo documento descrive i protocolli per questo approccio dettagliando le fasi di preparazione dei materiali, procedura sperimentale e analisi dei dati. I fattori che possono influire sulle prestazioni del metodo o sulla qualità dei dati sono elencati in brevi note. I risultati rappresentativi qui presentati includono i dati HDX differenziali di miscele di diverse proteine e varianti naturali di β-lattoglobulina bovina (β-lg), la principale proteina del siero di latte presente nel latte9. Dimostriamo l'efficienza di separazione, la riproducibilità e le prestazioni di etichettatura 2H delle due abbondanti varianti di β-lg, cioè A e B10,11 durante l'HDX basato su CE e la caratterizzazione specifica della variante delle loro conformazioni.

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Protocollo

NOTA: utilizzare reagenti di grado HPLC (Ad alte prestazioni) per cromatografia liquida (HPLC) o di grado MS quando possibile per ridurre al minimo i contaminanti che possono interferire con l'analisi della SM. Non toccare l'interfaccia CE-MS a mani nude durante la misurazione per evitare la possibilità di una scossa elettrica causata dalla tensione elettroforetica o dalla tensione elettrospray.

1. Preparazione del materiale

  1. Modifica del capillare di silice fusa per CE
    1. Preparare una soluzione di idrossipropilcellulosa (HPC) al 5% (p/p) sciogliendo la polvere di HPC (peso molecolare [MW]: 100 kDa) in acqua con agitazione continua a temperatura ambiente su un agitatore magnetico per ~12 h o fino alla completa scomparsa delle particelle solide12. Rimuovere eventuali bolle d'aria visibili con un ultrasuoni.
    2. Montare un capillare di vetro di silice fusa (diametro interno [ID]: 50 μm, diametro esterno [OD]: 360 μm) di circa 85 cm di lunghezza in uno strumento CE. Risciacquare il capillare infondendo continuamente un solvente organico, come l'acetone13, utilizzando l'autocampionatore di CE ad una pressione di infusione di 40 psi per 10-15 min.
    3. Riempire il capillare pulito con soluzione HPC utilizzando l'autocampionatore a una pressione di infusione di 40 psi (che spesso richiede ~ 40 minuti). Infondere aria nel capillare riempito di HPC a 40 psi per garantire un flusso d'aria libero nel capillare, indicato dalle bolle d'aria espulse dal capillare dopo l'immersione in acqua.
    4. Cuocere il capillare rivestito in HPC in un forno programmabile a temperatura (idealmente il forno a colonna a temperatura controllata di un gascromatografo a temperatura programmata) con azoto gassoso (25 psi) che scorre attraverso il capillare, seguendo il programma di temperatura mostrato in Figura 1.
    5. Raffreddare il forno a temperatura ambiente prima di estrarre il capillare. Utilizzare questo capillare modificato HPC per la separazione CE.

figure-protocol-1
Figura 1: Un programma di temperatura consigliato per la cottura capillare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Soluzione di elettrolita di fondo (BGE) e soluzione modificatore8
    1. Preparare 1-10 mL di BGE alla concentrazione desiderata (ad esempio, 10 mM) sciogliendo la quantità appropriata di acetato di ammonio in 2H2 O. Posizionare 200μL-aliquote di BGE in flaconcini BGE separati e sigillare i flaconcini con parafilm per ridurre al minimo la reazione HDX tra BGE e vapore acqueo nell'aria.
    2. Preparare 10 mL di una soluzione modificatrice con metanolo al 75% (v/v) e acqua al 25% (v/v), con pH regolato a 2,5 utilizzando acido formico.
      NOTA: utilizzare 2H2O e metanolo deuterato per preparare la soluzione modificatore se gli atomi di deuterio nelle catene laterali e le ammidi dorsali non protette devono essere trattenuti per il rilevamento da parte della SM.
  2. Dissalazione di campioni proteici
    1. Preparare una soluzione di acetato di ammonio in acqua non deuterata alla concentrazione desiderata.
      NOTA: si raccomanda una concentrazione inferiore a 100 mM per evitare un'elevata corrente elettrica durante l'elettroforesi e il conseguente effetto di riscaldamento Joule.
    2. Se necessario, regolare il pH della soluzione di acetato di ammonio al livello desiderato utilizzando acido formico (per pH < 6,8) o idrossido di ammonio (per pH > 6,8).
    3. Sostituire i tamponi originali della soluzione proteica con una soluzione di acetato di ammonio (preparata in acqua non deuterata alla concentrazione desiderata; pH regolato a 7,5 con idrossido di ammonio) attraverso almeno cinque concentrazioni sequenziali e fasi di diluizione a 4 °C utilizzando un filtro centrifugo con un adeguato cutoff MW.
      NOTA: I campioni proteici da dissalizzare possono provenire da precedenti procedure di produzione (ad esempio, purificazione o formulazione) o preparati sciogliendo la polvere liofilizzata di proteine. I "sali" da rimuovere dalle soluzioni campione in questa fase si riferiscono in generale a tutti i piccoli ioni o molecole che non sono volatili. Sebbene queste specie possano essere separate in modo efficiente dalle proteine durante il processo di elettroforesi, questo passaggio è raccomandato per evitare di compromettere la risoluzione elettroforetica e quindi ridurre al minimo la contaminazione dello spettrometro di massa. Quando gli analiti proteici devono essere stabilizzati da sali o additivi specifici, includerli nel BGE.
    4. Determinare la concentrazione proteica utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis a microvolume.

2. Funzionamento dell'analisi HDX MS basata su CE

NOTA: Lo spettrometro di massa utilizzato in questo approccio dovrebbe essere dotato di un analizzatore di massa ad altissima risoluzione, come una risonanza di ciclotrone ionico a trasformata di Fourier (FTICR) o orbitrap, un filtro di massa, come un quadrupolo che consente la selezione di massa di ioni precursori per la frammentazione e funzioni di dissociazione a trasferimento di elettroni (ETD) o dissociazione a cattura elettronica (ECD) per eseguire analisi top-down con dati MS tandem affidabili (idealmente segnali isotopicamente risolti di ioni frammento).

  1. Ottimizzazione delle impostazioni CE e MS
    1. Eseguire una misurazione pilota della SM utilizzando una sorgente standard di ionizzazione elettrospray (ESI) spruzzando il campione precaricato da un capillare di vetro borosilicato rivestito di metallo (lo schema nanoESI "statico") o il campione continuamente infuso da un emettitore di metalli per ottimizzare le impostazioni MS per la misurazione delle proteine intatte (MS1) e dei loro frammenti in fase gassosa (MS2). Frammentare le specie proteiche di interesse mediante selezione di massa dell'insieme dei suoi ioni in un singolo stato di carica, seguito da ETD o ECD degli ioni precursori.
      NOTA: le impostazioni essenziali includono i parametri che influenzano la desolvazione, la selezione di massa degli ioni precursori (per evitare interferenze da altre specie) e l'efficienza di frammentazione. Sia il centro che la larghezza della finestra di selezione della massa devono essere aumentati per corrispondere alla distribuzione di massa risultante degli ioni analita dopo HDX. Poiché la finestra di eluizione di una specie proteica in CE varia tipicamente da 0,5 minuti a 2 minuti, valutare l'efficienza di frammentazione in base alle scansioni MS2 accumulate in una finestra temporale comparabile. I valori ottimali di questi parametri sono specifici delle proteine; i lettori sono riferiti a rapporti pubblicati in precedenza per impostazioni esemplari 8,14.
    2. Eseguire una misura CE pilota utilizzando uno strumento CE dotato di un rivelatore ottico, ad esempio un rilevatore di array di fotodiodi (PDA) o un rilevatore UV per ottimizzare le impostazioni CE per la separazione delle specie proteiche e i tempi di migrazione, che è equivalente ai tempi di reazione HDX.
      NOTA: Questo passaggio è facoltativo a seconda della disponibilità del rilevatore ottico di CE. In assenza di un rilevatore ottico, le impostazioni CE possono essere ottimizzate utilizzando CE-MS al completamento del punto 2.2, seguendo le istruzioni descritte al punto 2.3. Le impostazioni essenziali includono parametri che influenzano l'efficienza di separazione, forme di picco mostrate negli elettroferogrammi e tempi di eluizione.
  2. Pre-condizionamento della configurazione CE-HDX
    1. Pulire l'interfaccia CE-MS microviale a flusso continuo con una miscela di metanolo al 50%, acqua al 49% e acido formico all'1% (v/v) utilizzando l'ultrasonicazione per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.
    2. Dopo il montaggio del capillare modificato HPC su uno strumento CE, sciacquare il capillare con BGE utilizzando l'autocampionatore per 10 minuti e lasciare il capillare pieno di BGE.
    3. Ottenere una lunghezza adeguata del tubo capillare di silice fusa non modificato (ID: 50 μm, OD: 360 μm) come tubo di infusione per la soluzione modificante. Collegare il tubo modificatore a una siringa di vetro a tenuta di gas con una punta smussata utilizzando un'unione e un manicotto appropriato e risciacquare il tubo con la soluzione modificatrice utilizzando una pompa per infusione per almeno 10 minuti.
    4. Inserire le uscite del capillare e del modificatore CE rivestito in HPC, che sono state caricate con le soluzioni corrispondenti, nell'interfaccia CE-MS pulita, come illustrato nella Figura 2.
    5. Far avanzare la siringa per l'infusione del modificatore manualmente o con la pompa di infusione per assicurarsi che la soluzione modificatrice raggiunga la punta dell'interfaccia. Montare l'interfaccia CE-MS assemblata su un alloggiamento sorgente nanoESI di uno spettrometro di massa.

figure-protocol-2
Figura 2: Illustrazione schematica della configurazione HDX MS basata su CE. Questa cifra è stata modificata da8. Abbreviazioni: BGE = soluzione elettrolitica di fondo; CE = elettroforesi capillare; MS = spettrometria di massa; HDX = scambio idrogeno/deuterio; ESI = ionizzazione elettrospray; FTICR = risonanza ciclotrone ionica a trasformata di Fourier; ETD = dissociazione a trasferimento di elettroni; ECD = dissociazione a cattura elettronica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Separazione CE simultanea, reazione HDX e analisi MS
    NOTA: si consiglia l'uso di BGE deuterato entro 1 giorno dall'apertura del sigillo.
    1. Applicare una tensione di spruzzatura di 3-5 kV all'interfaccia CE-MS.
    2. Iniziare a infondere la soluzione modificatrice con la pompa di infusione a una portata compresa tra 0,1 e 10 μL/min e garantire un elettrospray stabile sulla punta dell'interfaccia CE-MS.
    3. Posizionare il flaconcino campione contenente il BGE nell'autocampionatore e utilizzarlo al punto 2.3.4 per acquisire elettroferogrammi vuoti e spettri di massa vuoti.
    4. Iniettare la soluzione campione utilizzando l'autocampionatore a 2 psi e per una durata adeguata per consentire l'iniezione di una quantità desiderata del campione. Stimare il volume di iniezione utilizzando la relazione tra volume di iniezione e parametri di iniezione15 definiti dall'equazione (1).
      figure-protocol-3 (1)
      Dove Vinj è il volume di iniezione, Δp è la pressione di iniezione, dc è il diametro interno del capillare, A è la sezione trasversale del capillare, tinj è la durata dell'iniezione, η è la viscosità del liquido nel capillare e L è la lunghezza del capillare.
    5. Avviare la separazione CE applicando una tensione elettroforetica di 30 kV e una pressione di infusione compresa tra 0 e 2 psi, e acquisire l'elettroferogramma. Nel frattempo, avviare l'acquisizione dei dati MS in modalità cromatografica in cui il grafico a corrente ionica viene acquisito in funzione del tempo e le corrispondenti scansioni MS non vengono automaticamente combinate in un singolo spettro.
      NOTA: Le proteine subiscono una reazione spontanea HDX nel punto di contatto di 2molecole H2O in BGE durante la loro migrazione elettroforetica in questa fase. Il rilevamento ottico per CE può essere utilizzato in aggiunta al rilevamento MS. Poiché il rilevamento su colonna richiede la rimozione di una certa lunghezza di rivestimento in poliimmide all'estremità di uscita del capillare di silice fusa, è necessario prestare particolare attenzione per evitare danni capillari durante l'assemblaggio dell'interfaccia CE-MS.
    6. Salvate l'elettroferogramma vuoto e gli spettri di massa come riferimenti.
      NOTA: i dati vuoti devono essere utilizzati per la risoluzione dei problemi anziché per la sottrazione di base.
    7. Inserire i flaconcini campione contenenti le concentrazioni desiderate delle soluzioni campione proteiche nell'autocampionatore. Acquisire gli elettroferogrammi e gli spettri di massa per i campioni proteici seguendo i passaggi 2.3.4-2.3.5. Raccogliere un numero adeguato di scansioni di SM per ottenere spettri MS1 delle specie proteiche elettroforeticamente separate e 2H-labeled.
    8. Eseguire misurazioni di MS in tandem per le specie di interesse dopo aver acquisito gli spettri MS1 all'interno della stessa corsa o in una successiva corsa separata.
    9. Se necessario, regolare i tempi di migrazione/tempi di reazione HDX modificando la pressione di infusione o la lunghezza del capillare CE. Se il tempo di reazione HDX deve essere inferiore al tempo di migrazione, utilizzare l'approccio descritto in precedenza8, che impiega BGE sia deuterato che non deuterato nel capillare durante il processo CE.
    10. Lavare il capillare CE con BGE ad una pressione di 20 psi per almeno 10 minuti dopo ogni misurazione.
    11. Al termine degli esperimenti, pulire l'interfaccia CE-MS e tutti i tubi per lo stoccaggio.
    12. Acquisire un set di dati del campione "endpoint" HDX (che può essere preparato utilizzando gli approcci descritti in precedenza 6,16) con SM in modalità infusione diretta.
      NOTA: questo passaggio è necessario solo quando viene utilizzata una soluzione di modificatore deuterato per HDX basato su CE.

3. Analisi dei dati

  1. Analisi dei dati CE
    1. Utilizzare uno dei seguenti grafici come elettroferogramma per determinare le caratteristiche elettroforetiche, incluso il numero di picchi, i tempi di migrazione e l'efficienza di separazione: (a) assorbanza UV vs tempo di migrazione, acquisita dal rilevatore ottico dello strumento CE (quando disponibile); b) il grafico della corrente ionica totale (TIC) acquisito dagli Stati membri; c) il grafico della corrente ionica estratta (EIC/XIC) acquisito dagli Stati membri.
      NOTA: EIC/XIC fornisce il rapporto segnale/rumore (S/N) ottimale, in generale, tra i suddetti formati di elettroferogrammi. È interessante notare che anche in assenza di pregiudizi strumentali, mentre l'assorbanza UV è proporzionale alla concentrazione di massa della proteina, il segnale MS è proporzionale alla concentrazione molare. Pertanto, è ragionevole osservare le differenze nei modelli di picco tra elettroferogrammi derivati da CE e MS.
    2. Utilizzare l'area sotto la curva (AUC) dei picchi mostrati negli elettroferogrammi per la semiquantazione. Per i campioni che coinvolgono complessi proteici, utilizzare l'approccio descritto in precedenza17 per dedurre i dati sulla concentrazione di massa dagli elettroferogrammi TIC/EIC.
  2. Analisi dei dati MS
    1. Ottenere gli spettri MS1 e MS2 combinando rispettivamente le scansioni MS1 e MS2 acquisite all'interno delle finestre di eluizione corrispondenti.
    2. Determinare le masse della proteina intatta (M (proteina intatta)) e dei frammenti con uno dei seguenti due metodi.
      1. Calcolare le masse medie degli ioni che danno origine agli ammassi di segnali risolti isotopicamente.
      2. Utilizzare il centro delle curve gaussiane risultanti dal fitting degli inviluppi isotopici corrispondenti6.
    3. Utilizzare software come Biopharma Finder, ProSight18 o MASH Suite19 per generare l'elenco di massa degli ioni frammento e identificarli.
  3. Analisi dei dati HDX
    1. Determinare il livello complessivo di deuterazione di una specie proteica intatta usando l'equazione (2).
      figure-protocol-4 (2)
      dove M (2H) o M (1H) sono pesi atomici di 2H o 1H. L'asterisco indica i dati del campione con etichetta 2H.
    2. Determinare la protezione cumulativa o la deuterazione cumulativa delle dorsali-ammidi di un segmento specifico.
      1. Per i dati acquisiti con una soluzione modificatrice deuterata, utilizzare le equazioni (3) e (4) per determinare il livello di protezione cumulativo.
        figure-protocol-5 (3)
        figure-protocol-6 (4)
        Dove P(Sk(N)) è la protezione totale del segmento N-terminale che copre i residui da 1 a k, P(Sm(C)) è la protezione totale del segmento C-terminale comprendente m residui, M (2H) o M (1H) sono pesi atomici di 2H o 1H, e M (ci) o M (zi) sono i pesi molecolari degli ioni ci o zi .
        NOTA: il doppio asterisco indica i dati dell'esempio "endpoint" HDX.
      2. Per i dati acquisiti con una soluzione modificatrice non deuterata, utilizzare le equazioni (5) e (6) per determinare il livello di deuterazione cumulativo.
        figure-protocol-7 (5)
        figure-protocol-8 (6)
        dove D(Sk(N)) è l'assorbimento cumulativo di deuterio del segmento N-terminale che attraversa i residui da 1 a k; D(Sm(C)) è l'assorbimento cumulativo di deuterio del segmento C-terminale comprendente m residui.
    3. Determinare il livello di deuterazione in un gruppo ammidico della spina dorsale locale
      1. Per i dati acquisiti con una soluzione modificatrice deuterata, utilizzare le equazioni (7), (8), (9), (10) e (11) per determinare il livello di protezione locale.
        per i dati dedotti dagli ioni C
        figure-protocol-9 (7)
        per i dati dedotti dagli ioni z
        figure-protocol-10 (8)
        Dove P(Ri) è la protezione di un'ammide dorsale al residuo i, e il pedice "totale" indica il numero totale di residui della proteina.
        Per i siti residui in cui mancavano ioni frammento successivi, assegnare P(Ri) usando le equazioni (9) e (10).
        per i dati dedotti dagli ioni C
        figure-protocol-11 (9)
        per i dati dedotti dagli ioni z
        figure-protocol-12 (10)
        Quindi, determinare il livello di deuterazione D(Ri) in un gruppo ammidico della spina dorsale locale usando l'equazione (11).
        figure-protocol-13(11)
      2. Per i dati acquisiti con una soluzione modificatrice non deuterata, utilizzare le equazioni (12), (13), (14) e (15) per determinare il livello di protezione locale.
        per i dati dedotti dagli ioni C
        figure-protocol-14(12)
        per i dati dedotti dagli ioni z
        figure-protocol-15(13)
        Dove D(Ri) è la protezione di un'ammide dorsale al residuo i, e il pedice "totale" indica il numero totale di residui della proteina.
        Per i siti residui in cui mancavano ioni frammento successivi, assegnare D(Ri) usando le equazioni (14) e (15).
        per i dati dedotti dagli ioni C
        figure-protocol-16 (14)
        per i dati dedotti dagli ioni z
        figure-protocol-17 (15)

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Risultati

La modifica della pressione di infusione di BGE consente di regolare sia l'efficienza di separazione che il tempo di migrazione, che è equivalente al tempo di reazione HDX delle proteine da separare (Figura 3). Una pressione di infusione più bassa si traduce in una migliore separazione dei picchi CE a scapito della durata dell'esperimento (Figura 3A). Un tempo di migrazione/reazione HDX più lungo si traduce in un livello più elevato di deuterazione degli analiti...

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Discussione

Gli obiettivi del rivestimento della parete interna del capillare CE includono la minimizzazione del flusso elettroosmotico e l'assorbimento delle proteine durante il processo CE13. Sebbene il flusso elettroosmotico sia vantaggioso per l'analisi CE convenzionale di piccole molecole grazie alla sua capacità di guidare specie neutre o caricate in modo opposto al rivelatore, compromette l'efficienza di separazione di specie proteiche con dimensioni simili e cariche nette in soluzione. Rivestire il ca...

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Dichiarazioni

D. D. Y. Chen è uno dei fondatori del Knowledge for Health Institute for Biomolecules, che sta commercializzando l'interfaccia CE-MS microviale a flusso continuo. Altri autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). Gli autori hanno anche ricevuto il supporto dell'Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, Cina; Jiangsu Collaborative Innovation Center of Biomedical Functional Materials; e Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials presso la Nanjing Normal University, Cina.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
acetato di ammonioFisher ChemicalA/3446/50≥ 99%
CESI 8000 plus sistema di elettroforesi capillareSciex, centrifuga USA
Eppendorffiltro
MerckUFC20102410 kDa taglio ossido
di deuterioEnergia ChimicoE09000199,9
D acido formicoAcros Organics 
capillare in vetro silice fusoPolymicro Technologies1068150017ID 50μ m, OD 360μ m
gascromatografiaAgilentGC6890N
acido cloridricoSigma Aldrich258148
idrossipropilcellulosaAlaaddinH113415MW 100000
agitatori magneticiDLAB8030101212
metanoloFisher ChemicalA456-4grado MS
microvolume UV-Vis spettrofotometroDeNovix84677JK7731
mioglobinaSigma AldrichM1882
Orbitrap Fusion Spettrometro di massa LumosThermo Fisher Scientific, USA
PA 800 Plus Analisi farmaceutica CE SystemBeckman Coulter, USA
Q Spettrometro di massa UHMR esattivoThermo Fisher Scientific, Germania
sodio  idrossidoSigma AldrichS5881
ubiquitinaSigma AldrichU6253
ultrasuonatoreSCIENTZSB-5200
β-lattoglobulinaSigma AldrichL0130
centrifugo 5406000097 % 270480250,

Riferimenti

  1. Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169(2020).
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