Qui viene presentato un protocollo per un approccio di scambio idrogeno/deuterio (HDX) basato sull'elettroforesi capillare accoppiato con la spettrometria di massa top-down. Questo approccio caratterizza la differenza nelle strutture di ordine superiore tra diverse specie proteiche, comprese le proteine in diversi stati e diverse proteoforme, conducendo simultaneamente HDX differenziale e separazione elettroforetica.
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Articolo metodologico
Scambio idrogeno/deuterio basato sull'elettroforesi capillare per la caratterizzazione conformazionale di proteine con spettrometria di massa top-down
In questo articolo
Sommario
Abstract
La risoluzione dell'eterogeneità conformazionale di più stati proteici che coesistono in soluzione rimane uno dei principali ostacoli nella caratterizzazione delle terapie proteiche e nella determinazione delle vie di transizione conformazionali critiche per le funzioni biologiche, che vanno dal riconoscimento molecolare alla catalisi enzimatica. La reazione di scambio idrogeno/deuterio (HDX) accoppiata con l'analisi spettrometrica di massa top-down (MS) fornisce un mezzo per caratterizzare le strutture e le dinamiche di ordine superiore delle proteine in modo conforme-specifico. Il potere risolutivo conformazionale di questa tecnica dipende fortemente dall'efficienza di separare gli stati proteici a livello proteico intatto e ridurre al minimo il contenuto protico residuo non deuterato durante le reazioni HDX.
Qui descriviamo una variante basata sull'elettroforesi capillare (CE) dell'approccio HDX MS che mira a migliorare la risoluzione conformazionale. In questo approccio, le proteine subiscono reazioni HDX mentre migrano attraverso una soluzione elettrolitica di fondo deuterata (BGE) durante la separazione elettroforetica capillare. Diversi stati proteici o proteoforme che coesistono in soluzione possono essere separati in modo efficiente in base ai loro diversi rapporti carica-dimensione. La differenza nella mobilità elettroforetica tra proteine e molecole di solvente protico riduce al minimo il solvente residuo non deuterato, risultando in un ambiente di deuterazione quasi completo durante il processo HDX. L'interfaccia CE-MS microviale flow-through consente un'efficiente ionizzazione elettrospray delle specie proteiche eluite a seguito di una rapida miscelazione con la soluzione modificante estinguente e denaturante all'uscita dello spruzzatore. L'analisi online top-down della SM misura il livello di deuterazione globale delle specie proteiche intatte eluite e, successivamente, la deuterazione dei loro frammenti in fase gassosa. Questo documento dimostra questo approccio nell'HDX differenziale per i sistemi, comprese le varianti proteiche naturali che coesistono nel latte.
Introduzione
Distinguere le specie proteiche in diversi stati conformazionali, leganti o modificativi e caratterizzare le loro differenze strutturali è importante per monitorare i percorsi di transizione tra queste specie coinvolte in eventi biologici, che vanno dal riconoscimento molecolare alla catalisi enzimatica, e comprendere i meccanismi alla base di questi eventi. Le tecniche biofisiche convenzionali non forniscono una soluzione completa a causa delle limitazioni come la risoluzione insufficiente e la perdita di informazioni dinamiche in soluzione. Lo scambio idrogeno/deuterio accoppiato con la spettrometria di massa (HDX MS) è una tecnica che etichetta le caratteristiche s....
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Protocollo
NOTA: utilizzare reagenti di grado HPLC (Ad alte prestazioni) per cromatografia liquida (HPLC) o di grado MS quando possibile per ridurre al minimo i contaminanti che possono interferire con l'analisi della SM. Non toccare l'interfaccia CE-MS a mani nude durante la misurazione per evitare la possibilità di una scossa elettrica causata dalla tensione elettroforetica o dalla tensione elettrospray.
1. Preparazione del materiale
- Modifica del capillare di silice fusa per CE
- Preparare una soluzione di idrossipropilcellulosa (HPC) al 5% (p/p) sciogliendo la polvere di HPC (peso molecolare [MW]: 100 kDa) in acqua con agitazione co....
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Risultati
La modifica della pressione di infusione di BGE consente di regolare sia l'efficienza di separazione che il tempo di migrazione, che è equivalente al tempo di reazione HDX delle proteine da separare (Figura 3). Una pressione di infusione più bassa si traduce in una migliore separazione dei picchi CE a scapito della durata dell'esperimento (Figura 3A). Un tempo di migrazione/reazione HDX più lungo si traduce in un livello più elevato di deuterazione degli analiti.......
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Discussione
Gli obiettivi del rivestimento della parete interna del capillare CE includono la minimizzazione del flusso elettroosmotico e l'assorbimento delle proteine durante il processo CE13. Sebbene il flusso elettroosmotico sia vantaggioso per l'analisi CE convenzionale di piccole molecole grazie alla sua capacità di guidare specie neutre o caricate in modo opposto al rivelatore, compromette l'efficienza di separazione di specie proteiche con dimensioni simili e cariche nette in soluzione. Rivestire il ca.......
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Dichiarazioni
D. D. Y. Chen è uno dei fondatori del Knowledge for Health Institute for Biomolecules, che sta commercializzando l'interfaccia CE-MS microviale a flusso continuo. Altri autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). Gli autori hanno anche ricevuto il supporto dell'Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, Cina; Jiangsu Collaborative Innovation Center of Biomedical Functional Materials; e Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials presso la Nanjing Normal University, Cina.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| acetato di ammonio | Fisher Chemical | A/3446/50 | ≥ 99% |
| CESI 8000 plus sistema di elettroforesi capillare | Sciex, centrifuga USA | ||
| Eppendorf | filtro | ||
| Merck | UFC201024 | 10 kDa taglio ossido | |
| di deuterio | Energia Chimico | E090001 | 99,9 |
| D acido formico | Acros Organics | ||
| capillare in vetro silice fuso | Polymicro Technologies | 1068150017 | ID 50μ m, OD 360μ m |
| gascromatografia | Agilent | GC6890N | |
| acido cloridrico | Sigma Aldrich | 258148 | |
| idrossipropilcellulosa | Alaaddin | H113415 | MW 100000 |
| agitatori magnetici | DLAB | 8030101212 | |
| metanolo | Fisher Chemical | A456-4 | grado MS |
| microvolume UV-Vis spettrofotometro | DeNovix | 84677JK7731 | |
| mioglobina | Sigma Aldrich | M1882 | |
| Orbitrap Fusion Spettrometro di massa Lumos | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| PA 800 Plus Analisi farmaceutica CE System | Beckman Coulter, USA | ||
| Q Spettrometro di massa UHMR esattivo | Thermo Fisher Scientific, Germania | ||
| sodio idrossido | Sigma Aldrich | S5881 | |
| ubiquitina | Sigma Aldrich | U6253 | |
| ultrasuonatore | SCIENTZ | SB-5200 | |
| β-lattoglobulina | Sigma Aldrich | L0130 |
Riferimenti
- Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169(2020).
- Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E.
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Ristampe e permessi
