Esperimenti NMR ad alta pressione per il rilevamento di stati conformazionali a bassa pressione delle proteine

Sommario

Forniamo una descrizione dettagliata dei passaggi necessari per assemblare una cella ad alta pressione, impostare e registrare esperimenti NMR ad alta pressione e infine analizzare sia l'intensità di picco che i cambiamenti di spostamento chimico sotto pressione. Questi esperimenti possono fornire preziose informazioni sui percorsi di ripiegamento e sulla stabilità strutturale delle proteine.

Abstract

L'alta pressione è un metodo di perturbazione ben noto che può essere utilizzato per destabilizzare le proteine globulari e dissociare i complessi proteici in modo reversibile. La pressione idrostatica guida gli equilibri termodinamici verso lo stato o gli stati con il volume molare inferiore. L'aumento della pressione offre, quindi, l'opportunità di sintonizzare finemente la stabilità delle proteine globulari e gli equilibri di oligomerizzazione dei complessi proteici. Gli esperimenti NMR ad alta pressione consentono una caratterizzazione dettagliata dei fattori che governano la stabilità delle proteine globulari, i loro meccanismi di ripiegamento e i meccanismi di oligomerizzazione combinando la capacità di sintonizzazione della stabilità fine della perturbazione della pressione e la risoluzione del sito offerta dalla spettroscopia NMR della soluzione. Qui presentiamo un protocollo per sondare la stabilità di ripiegamento locale di una proteina tramite una serie di esperimenti 2D 1H-15N registrati da 1 bar a 2,5 kbar. I passaggi necessari per l'acquisizione e l'analisi di tali esperimenti sono illustrati con i dati acquisiti sul dominio RRM2 di hnRNPA1.

Introduzione

È stato a lungo riconosciuto che gli stati conformazionali a più alta energia e scarsamente popolati di proteine e complessi proteici svolgono un ruolo chiave in molte vie biologiche^1,2,3. Grazie a esperimenti basati su Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)^4,Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)⁵e dark-state exchange saturation transfer (DEST) 6 sequenze di impulsi (tra gli altri), la spettroscopia NMR in^soluzione è emersa come metodo di scelta per caratterizzare gli stati conformazionali transitori

Protocollo

NOTA: Il protocollo qui descritto richiede (i) una pompa e una cella ad alta pressione con un tubo di zirconia in alluminio resistente da 2,5 kbar^18,(ii) il software SPARKY¹⁹ per l'analisi degli spettri NMR e (iii) un software di raccordo a curva.

1. Preparazione del campione, assemblaggio della cella ad alta pressione e impostazione degli esperimenti.

1. Scelta del tampone: Utilizzare una miscela uguale di tamponi anionici e cationici, come fosfato e Tris^20,21.
   NOTA: Il pKa di tamponi anionici come fosfato e MES è associato ....

Risultati

Il protocollo qui descritto è stato utilizzato per sondare la dipendenza dalla pressione di RRM2, il secondo motivo di riconoscimento dell'RNA di hnRNPA1 (residui 95-106), che è quasi completamente dispiegato all'interno dell'intervallo di 2,5 kbar (>90%). ¹ Gli spettri^H-15N sono stati raccolti a 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1,5 kbar, 2 kbar e 2,5 kbar (Figura 2). Poiché nessuno dei crosspeak nativi era visibile al di sopra del livello di rumore a 2,5 kbar, a tut.......

Discussione

Questo studio descrive in dettaglio un protocollo implementato per sondare le risposte strutturali e termodinamiche delle proteine alla perturbazione della pressione. Gli esperimenti ad alta pressione registrati qui su RRM2 dimostrano che grandi variazioni nei valori di ΔV_U, indicative di uno sviluppo non completamente cooperativo, possono essere trovate in una proteina a dominio singolo relativamente piccola. Un quadro simile emerge dall'analisi dei cambiamenti di spostamento chimico ^{di 1}H sotto pr.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar	Daedalus Innovations LLC	NMRCELL-B
Sparky3	Università della California San Francisco, CA	N/A
Pompa a siringa Xtreme-60	Daedalus Innovations LLC	XTREME-60