Modello di sanguinamento della traslazione della vena della coda in topi di emofilia A completamente anestetizzati

Sommario

Il modello di sanguinamento della transezione della vena della coda raffinata (TVT) nei topi anestetizzati è un metodo sensibile in vivo per la valutazione del sanguinamento emofilico. Questo modello di sanguinamento TVT ottimizzato utilizza la perdita di sangue e il tempo di sanguinamento come endpoint, perfezionando altri modelli ed evitando la morte come endpoint.

Abstract

I modelli di sanguinamento della coda sono strumenti importanti nella ricerca sull'emofilia, in particolare per la valutazione degli effetti procoagulanti. Il modello di sopravvivenza alla transezione della vena caudale (TVT) è stato preferito in molti contesti a causa della sensibilità a dosi clinicamente rilevanti di FVIII, mentre altri modelli consolidati, come il modello di clip di coda, richiedono livelli più elevati di composti procoagulanti. Per evitare di utilizzare la sopravvivenza come endpoint, abbiamo sviluppato un modello TVT che stabilisce la perdita di sangue e il tempo di sanguinamento come endpoint e l'anestesia completa durante l'intero esperimento. In breve, i topi anestetizzati vengono posizionati con la coda immersa in soluzione salina temperata (37 ° C) e dosati con il composto di prova nella vena laterale destra della coda. Dopo 5 minuti, la vena laterale sinistra della coda viene trasettata utilizzando una guida modello, la coda viene restituita alla soluzione salina e tutti gli episodi emorragici vengono monitorati e registrati per 40 minuti durante la raccolta del sangue. Se non si verifica alcun sanguinamento a 10 minuti, 20 minuti o 30 minuti dopo l'infortunio, il coagulo viene sfidato delicatamente pulendo il taglio due volte con un tampone di garza bagnato. Dopo 40 minuti, la perdita di sangue è quantificata dalla quantità di emoglobina sanguinata nella soluzione salina. Questa procedura veloce e relativamente semplice si traduce in sanguinamenti coerenti e riproducibili. Rispetto al modello di sopravvivenza TVT, utilizza una procedura più umana senza compromettere la sensibilità all'intervento farmacologico. Inoltre, è possibile utilizzare entrambi i sessi, riducendo il numero totale di animali che devono essere allevati, nel rispetto dei principi delle 3R. Una potenziale limitazione nei modelli di sanguinamento è la natura stocastica dell'emostasi, che può ridurre la riproducibilità del modello. Per contrastare questo, l'interruzione manuale del coagulo assicura che il coagulo venga sfidato durante il monitoraggio, impedendo all'emostasi primaria (piastrinica) di fermare il sanguinamento. Questa aggiunta al catalogo di modelli di lesioni emorragiche offre un'opzione per caratterizzare gli effetti procoagulanti in modo standardizzato e umano.

Introduzione

I modelli animali sono essenziali per comprendere la patogenesi dell'emofilia e sviluppare e testare regimi di trattamento e terapie. Il topo knock-out fattore VIII (F8-KO) è un modello ampiamente utilizzato per lo studio dell'emofilia A ^1,2. Questi topi ricapitolano le caratteristiche chiave della malattia e sono stati ampiamente utilizzati per lo sviluppo di trattamenti, come i prodotti FVIII ricombinanti ^3,4,5 e le strategie di terapia genica ^6,7.

Protocollo

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state approvate dall'Animal Welfare Body di Novo Nordisk A/S e dall'Ispettorato danese per gli esperimenti sugli animali, il Ministero danese dell'alimentazione, dell'agricoltura e della pesca. Il metodo ottimizzato di 40 minuti include l'anestesia e il tempo di dosaggio nella progettazione (Figura 1). Per questa procedura sono necessari topi emofili di entrambi i sessi tra le 10-16 settimane di età.

1. Preparativi prima dello studio

1. Preparare le soluzioni dosatrici nelle concentrazioni corrette.
2. Iniziare il bagno d'acqua e riscaldare a ....

Risultati

Per valutare l'applicabilità del modello ottimizzato, è stato condotto uno studio su topi F8-KO (background genetico C57BL) somministrati con una terapia sostitutiva con fattore VIII ricombinante disponibile in commercio (rFVIII); sono state testate quattro diverse dosi: 1 UI/kg, 5 UI/kg, 10 UI/kg e 20 UI/kg. Inoltre, abbiamo testato il corrispondente controllo del veicolo (negativo) nei topi F8-KO e nel gruppo wild-type (WT) utilizzando topi C57BL come gruppo di controllo positivo per valutare l'intervallo di risposta n.......

Discussione

Questo metodo ottimizzato di transezione della vena della coda (TVT) presenta diversi vantaggi rispetto al metodo di sopravvivenza TVT. Gli animali sono completamente anestetizzati per l'intera durata dello studio, il che rende più facile la manipolazione del topo e aumenta il benessere degli animali. Inoltre, a differenza del modello di sopravvivenza TVT, non è richiesta l'osservazione notturna e questo modello ottimizzato offre la possibilità di misurare la perdita di sangue e osservare il tempo esatto di sanguinamento.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
#11 Lama per bisturi	Swann-Morton	503
Provette da centrifuga da 15 mL	Greiner Bio-One, Austria	188271
aghi da 30 G collegati a 300 µ Siringhe di precisione L (insulina) per il dosaggio BD	Micro-Fine + siringa da insulina U-100	320830
Advate	Takeda, Giappone		Terapia sostitutiva del fattore VIII ricombinante (rFVIII)
Tamponi imbevuti di alcol 70% etanolo	Hartmann, Soft-Zellin	999 979
Centrifuga	Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Modello di taglio (acciaio inossidabile)	Autoprodotto, siete invitati a contattare gli autori per i disegni		Figura supplementare 2: Specifiche delle dimensioni: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Scanalatura: 3 mm di profondità e 3 mm di larghezza; raggio 1,5 mm
Soluzione di lisi eritrocitaria (RBC)	Lysebio, ABX Diagnostics	906012
Garze
Analizzatore ematologico	Sysmex	CT-2000iv
Lampada riscaldante su supporto	Phillips	IR250
Termoforo con termostato	CMA	modello 150
Standard e controlli dell'emoglobina - 8,81 mmol / l batch dependent	HemoCue, Denmark	HemoCue calibrator, 707037	Gli standard e i controlli sono costituiti da 2 diversi vetri del calibratore HemoCue. Il valore è determinato in base al metodo di riferimento internazionale per l'emoglobina (ICSH).
Sistema di anestesia isofluorano completo di tubi, maschere e scatola di induzione	Sigma Delta Dameca
Isoflurane	Baxter	26675-46-7
Lente d'ingrandimento con luci	Eschenbach
Modello di misurazione (alluminio)	Autoprodotto, siete invitati a contattare gli autori per i disegni		esattiFigura supplementare 1: Specifiche dimensionali: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x A). Scanalatura: 2,5 mm di profondità e 2,5 mm di larghezza; raggio 1,25 mm
Micropipette + punte	Fotometro Finnpipette
	Molecular Devices Corporation, CA, USA		SpectraMax 340
Prisma Software	GraphPad, San Diego, CA, USA	Versione 9.0.1
Soluzione salina 0,9% NaCl	Fresenius Kabi, Svezia	883264
Blocco marcatore di coda speciale per taglio		di coda TVT
Supporto di
Aspirazione liquidi sottovuoto	Vacusafe comfort, bagnomaria IBS
e termostato	TYP 3/8 Julabo