Il reclutamento di leucociti e piastrine costituisce una componente essenziale necessaria per l’efficace crescita delle arterie collaterali durante l’arteriogenesi. La microscopia multifotonica è uno strumento efficiente per tracciare la dinamica cellulare con alta risoluzione spazio-temporale in vivo e meno fototossicità per studiare il reclutamento e lo stravaso dei leucociti durante l’arteriogenesi.
L’arteriogenesi dipende fortemente dal reclutamento di leucociti e piastrine nello spazio perivascolare dei vasi collaterali in crescita. L’approccio standard per l’analisi delle arterie collaterali e dei leucociti nell’arteriogenesi è la metodologia istologica ex vivo (immuno-). Tuttavia, questa tecnica non consente la misurazione di processi dinamici come il flusso sanguigno, lo sforzo di taglio, le interazioni cellula-cellula e la velocità delle particelle. Questo articolo presenta un protocollo per monitorare i processi in vivo nelle arterie collaterali in crescita durante l’arteriogenesi utilizzando l’imaging intravitale. Il metodo qui descritto è uno strumento affidabile per la misurazione dinamica e offre un’analisi ad alto contrasto con fotocitotossicità minima, fornita dalla microscopia ad eccitazione multifotonica. Prima di analizzare le arterie collaterali in crescita, l’arteriogenesi è stata indotta nel muscolo adduttore dei topi mediante legatura unilaterale dell’arteria femorale.
Dopo la legatura, le arterie collaterali preesistenti hanno iniziato a crescere a causa dell’aumento dello stress da taglio. Ventiquattro ore dopo l’intervento, la pelle e il grasso sottocutaneo sopra le arterie collaterali sono stati rimossi, costruendo una tasca per ulteriori analisi. Per visualizzare il flusso sanguigno e le cellule immunitarie durante l’imaging in vivo , gli anticorpi CD41-fluoresceina isotiocianato (FITC) (piastrine) e CD45-ficoeritrina (PE) (leucociti) sono stati iniettati per via endovenosa (e.v.) tramite un catetere posto nella vena della coda di un topo. Questo articolo introduce l’imaging multifotonico intravitale come complemento alternativo o di vivo alle analisi istologiche statiche ex vivo (immuno-) comunemente utilizzate per studiare i processi rilevanti per l’arteriogenesi. In sintesi, questo articolo descrive un nuovo e dinamico metodo in vivo per studiare il traffico di cellule immunitarie, il flusso sanguigno e lo stress da taglio di un modello di arteriogenesi degli arti posteriori, che aumenta notevolmente le possibilità di valutazione.
Nonostante l’intenso interesse della ricerca negli ultimi anni, le malattie cardiovascolari, ad esempio la cardiopatia ischemica e l’ictus, sono ancora la principale causa globale di morte1. I trattamenti attuali per queste malattie sono terapie altamente invasive come l’angioplastica transluminale percutanea, l’angioplastica coronarica transluminale percutanea o la chirurgia di bypass2. Pertanto, è urgentemente necessario lo sviluppo di opzioni terapeutiche alternative e non invasive. Il corpo può creare bypass naturali attorno a un vaso stenosed o occluso per reindirizzare il flusso sanguigno interrotto alla parte distale della stenosi. Questo processo è chiamato arteriogenesi2. Molti studi recenti hanno dimostrato che l’aumento del taglio dei fluidi influisce sul reclutamento dei leucociti, che svolge un ruolo importante durante l’arteriogenesi3. Le principali opzioni attuali per analizzare il reclutamento dei leucociti durante l’arteriogenesi sono le analisi istologiche ex vivo (immuno-) o la metodologia di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)4. Per consentire la valutazione della dinamica dei leucociti durante l’arteriogenesi, questo articolo presenta un protocollo di imaging intravitale con microscopia multifotonica.
I leucociti sono le principali cellule del sangue reclutate durante il processo di arteriogenesi3. Questo protocollo utilizza l’imaging multifotonico per mostrare il crawling di leucociti aderenti marcati con anticorpi anti-CD45-PE iniettati nelle arterie collaterali, 24 ore dopo l’induzione dell’arteriogenesi mediante legatura dell’arteria femorale (FAL) impiegando un’ischemia murina degli arti posteriori modello 5,6. In alternativa, le cellule immunitarie possono essere marcate ex vivo e iniettate con cura nei topi, come mostrato negli studi sull’angiogenesi utilizzando la microscopia intravitale7. Il flusso sanguigno all’interno dei vasi e delle arterie può essere visualizzato da CD41-FITC (per etichettare le piastrine), destrano-FITC (plasma) o dalla seconda generazione armonica (SHG), che visualizza il collagene di tipo 1 presente nella membrana basale di alcune parti dell’albero vascolare. SHG è un effetto unico di etichettatura libera dell’eccitazione multifotonica. L’imaging multifotonico consente il tracciamento cellulare a lungo termine senza danneggiare il tessuto e attivando le cellule mediante eccitazione di potenza laser. La microscopia multifotonica è il metodo di imaging scelto per visualizzare cellule e strutture marcate con fluorescenza in animali viventi grazie alla sua capacità di eccitare i fluorofori più in profondità nei tessuti / organi con una fototossicità minima8.
L’uso di laser a infrarossi sintonizzati con impulsi erogati entro intervalli di femtosecondi eccita il fluorocromo solo sul piano focale, senza eccitazione sopra e sotto il piano focale8. Pertanto, la microscopia multifotonica consente un’elevata risoluzione spazio-temporale, meno foto-danni e una maggiore penetrazione tissutale per lo studio di eventi biologici dinamici all’interno degli organi. È uno strumento di microscopia ideale per l’imaging di animali vivi. Tuttavia, il multifotone e qualsiasi altra arte della microscopia intravitale è limitata dal movimento dei tessuti a causa del battito cardiaco, della respirazione, dei movimenti peristaltici, della tonalità muscolare e di altre funzioni fisiologiche, che disturbano l’acquisizione e l’analisi delle immagini. Poiché questi movimenti compromettono la risoluzione temporale e spaziale e talvolta impediscono persino analisi successive, devono essere affrontati in modo appropriato per consentire un’analisi e un’interpretazione accurate dei dati. Sono state sviluppate diverse strategie per ridurre o prevenire gli artefatti dal movimento dei tessuti. Questo protocollo applica un software di correzione della deriva in situ chiamato VivoFollow9 per correggere la deriva del tessuto durante l’acquisizione delle immagini. Questo approccio fornisce la stabilizzazione dell’immagine richiesta, consentendo l’imaging a lungo termine e l’analisi del tracciamento cellulare.
Il metodo descritto di analisi multifotonica in vivo del reclutamento dei leucociti rappresenta un’aggiunta agli strumenti comunemente usati per gli studi di reclutamento dei leucociti come le analisi istologiche (immuno-) o FACS. Con questo metodo di imaging, è possibile visualizzare in modo più dettagliato i processi dinamici nell’aderenza e nello stravaso dei leucociti durante l’arteriogenesi10. Nonostante il valore aggiunto di questo metodo, il protocollo offerto include alcuni pass…
The authors have nothing to disclose.
Lo studio è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A/SM, progetto Z01). Ringraziamo la dottoressa Susanne Stutte per aver letto il manoscritto.
1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
Silk braided suture (0/7) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |