Articolo metodologico
La valutazione della fosforilazione ossidativa mediante respirometri ad alta risoluzione è diventata parte integrante dell'analisi funzionale dei mitocondri e del metabolismo energetico cellulare. Qui, presentiamo protocolli per l'analisi del metabolismo energetico cellulare utilizzando respirometri ad alta risoluzione basati su camera e micropiastre e discutiamo i principali vantaggi di ciascun dispositivo.
La respirometria ad alta risoluzione (HRR) consente di monitorare la fosforilazione ossidativa in tempo reale per l'analisi dei singoli stati energetici cellulari e la valutazione dei complessi respiratori utilizzando protocolli diversificati di titolazione substrato-disaccoppiatore-inibitore (SUIT). Qui viene dimostrato l'uso di due dispositivi di respirometria ad alta risoluzione e viene presentata una raccolta di base di protocolli applicabili per l'analisi di cellule in coltura, fibre muscolari scheletriche e cardiache e tessuti molli come il cervello e il fegato. I protocolli per cellule e tessuti in coltura sono forniti per un respirometro a camera e cellule coltivate per un respirometro basato su micropiastre, entrambi comprendenti protocolli di respirazione standard. A scopo comparativo, le cellule HEK293 ingegnerizzate con CRISPR carenti di traduzione mitocondriale che causano una carenza multipla del sistema respiratorio vengono utilizzate con entrambi i dispositivi per dimostrare difetti cellulari nella respirazione. Entrambi i respirometri consentono una misurazione completa della respirazione cellulare con i rispettivi meriti tecnici e l'idoneità a seconda della domanda di ricerca e del modello in studio.
I mitocondri soddisfano la fornitura chiave di energia e sono un organello compartimentato che contribuisce a processi bioenergetici e metabolici cellulari essenziali come l'anabolismo di nucleotidi, lipidi e amminoacidi, biogenesi del cluster ferro-zolfo e sono implicati nella segnalazione come la morte cellulare controllata 1,2,3 . La bioenergetica mitocondriale attraverso la fosforilazione ossidativa contribuisce a quasi tutti i processi cellulari all'interno della cellula e, di conseguenza, le disfunzioni mitocondriali di origine primaria o secondaria
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Tutta la sperimentazione animale viene eseguita in conformità con il National Animal Experiment Review Board e l'Agenzia amministrativa regionale statale per la Finlandia meridionale. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6JOlaHsd (4-6 mesi) Il consenso per l'uso di linee cellulari umane è stato ottenuto dal comitato etico istituzionale dell'Università di Helsinki.
1. Respirometria ad alta risoluzione: respirometro a camera (cHRR)
NOTA: Gli esperimenti in questa sezione del protocollo sono stati eseguiti utilizzando l'Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (Tabella dei materiali<....
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Qui, forniamo protocolli per determinare la bioenergetica mitocondriale nelle cellule eucariotiche, nel tessuto non fibroso (ad esempio, cervelletto) e nel tessuto fibroso (ad esempio, muscolo scheletrico). Per le cellule eucariotiche, HEK293 con knockout ingegnerizzato CRISPR di due diverse proteine associate alla traduzione mitocondriale con conseguente deficit multiplo (CRISPRKO1) e grave/completo di OXPHOS (CRISPRKO2) è stato misurato con cHRR (Figura 3A-C
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Tradizionalmente, la bioenergetica mitocondriale è stata studiata con elettrodi di ossigeno di tipo Clark. Una mancanza di risoluzione e throughput, tuttavia, giustificata per il progresso tecnologico. Ad oggi, l'O2k (indicato come cHRR) e il Seahorse XF96 Flux Analyzer (denominato mHRR) sono stati ampiamente adottati nel campo della bioenergetica cellulare. Qui, presentiamo una raccolta comprensibile di protocolli per l'analisi del metabolismo energetico cellulare attraverso la valutazione della respirazione mitocondria.......
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Nessun conflitto di interessi da divulgare.
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti dell'Accademia di Finlandia (C.B.J),della Magnus Ehrnroot Foundation (C.B.J) e da una borsa di dottorato della Integrated Life Sciences Graduate School (R.A.).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2 mL Potter-Elvehjem Glass/PTFE Tissue Grinder/Omogeneizzatore | Omni International | 07-358029 | |
| 95% O2, 5% CO2 miscela | Potter per la macinazione dei tessuti | ||
| ADP | Sigma | A 4386 | |
| Antimicina A | Sigma | A 8674 | |
| Ascorbato | Merck | PHR1279-1G | Chimico, sciogliere in etanolo |
| BSA (grasso privo di accido) | Sigma | A 6003 | Chimico |
| CaCO3 | Sigma | C 4830 | |
| Chimico Citocromo c | Sigma | C 7752 | Chimico |
| Digitonina | Sigma | D 5628 | Chimico |
| Ditiotreitolo | Sigma | D 0632 | Chimico, sciogliere in DMSO |
| D-Saccarosio | Roth | 4621.1 | |
| Chimico Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (Glucosio alto) | Fisher Scientific | 41965-039 | Chimico |
| Dulbecco' s Eagle modificato' s medio (senza glucosio) | Fisher Scientific | A14430-01 | |
| EGTA | Sigma | E 4378 | |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | Chemical |
| Falcon Provette coniche da centrifuga da 15 ml | Fisher Scientific | AM12500 Chemical | |
| Falcon Provette da centrifuga coniche da 50 ml | Fisher | Scientific AM12501 | |
| FCCP | Sigma | C 2920 | |
| Glucosio | Sigma | G7021 | Chimico, sciogliere in etanolo |
| Glutammato | Sigma | G 1626 | Chimico |
| GlutaMax ( 100x) (200 nM L-alanil-L-glutammina dipeptide) | Fisher Scientific | 35050061 | Chimico |
| HEK293 cellule | ATTC | CRL-1573 | |
| Emocitometro | Fisher Scientific | 0267151B | Strumento per il conteggio delle cellule |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chimico |
| Imidazolo | Fluka | 56750 | Chimico |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chimico |
| L-carnitina | Sigma | C0283 | Chimico |
| Malato | Sigma | M 1000 | Chimico |
| MES idrato | Sigma | M8250 | Chimico |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chimico |
| Na2ATP | Sigma | A 2383 | Chimico |
| Na2Fosfocreatina | Sigma | P 7936 | Chimico |
| Na-piruvato ( 100 mM) (100x) | Fisher Scientific | 11360070 | |
| NEAA ( Aminoacidi non essenziali) 100x | Fisher Scientific | 11140035 | |
| Normal FBS ( 10x) | Fisher Scientific | 10500064 | |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | Strumento per respirometria ad alta risoluzione |
| O2k-Titration Set | Oroboros Instruments | 20820-03 | Siringhe Hamilton per iniezioni chimiche |
| Oligomicina | Sigma | O 4876 | Chimico, sciogliere in etanolo |
| Palmitoiletlcarnitina | Sigma | P 4509 | Chimico |
| Penicillina-Streptomicina | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Kit per il dosaggio delle proteine BCA Pierce | Fisher | Scientific 23227 | |
| Piruvato | Sigma | P 2256 | |
| Chimico RIPA-Buffer | Fisher Scientific | 89900 | |
| Chimico Rotenone | Sigma | R 8875 | Chimico, sciogliere in etanolo |
| Saponina | Sigma | S7900 | Chimico |
Seahorse XF DMEM assay medium pack, pH 7,4 | Agilent, Santa Clara, CA | 103680-100 | |
| Seahorse XFe96 Analizzatore di flusso extracellulare | Agilent, Santa Clara, CA | Strumento per respirometria ad alto rendimento Seahorse | |
| XFe96 FluxPak | Agilent, Santa Clara, CA | br/> Include piastre di analisi, cartucce, guide di caricamento per il trasferimento dei composti alla cartuccia di analisi e soluzione calibrante. | |
| Forbici piccole | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Sodio azide | Sigma | S2002 | Chimico |
| Succinato | Sigma | S 2378 | Chimico |
| Taurina | Sigma | T 8691 | Chimico |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chimico |
| Trypan Soluzione blu | Merck | 72-57-1 | Chimico |
| Tripsina 0,25% EDTA | Fisher Scientific | 25200056 | |
| Due pinze a lama sottile | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Stock di uridina (500x) | Sigma | U3750 | Chemical |
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