Frattura trasversale del femore del topo con perno stabilizzante

Fratture, rotture nella continuità della superficie ossea, si verificano in tutti i segmenti della popolazione. Diventano gravi nelle persone che hanno ossa fragili a causa dell'invecchiamento o della malattia e i costi sanitari delle fratture da fragilità dovrebbero superare i 25 miliardi di dollari in 5 anni 1,2,3,4,5. Comprendere i meccanismi biologici coinvolti nella riparazione delle fratture sarebbe un punto di partenza per lo sviluppo di nuove terapie volte a migliorare il processo di guarigione. Ricerche precedenti hanno dimostrato che, dopo la frattura, si verificano quattro passaggi significativi che consentono all'osso di guarire: (1) formazione dell'ematoma; (2) formazione di un callo fibrocartilagineo; (3) mineralizzazione del callo molle per formare l'osso; e (4) rimodellamento dell'osso guarito ^6,7. Molti processi biologici sono attivati per guarire con successo la frattura. In primo luogo, una risposta pro-infiammatoria acuta viene avviata immediatamente dopo una frattura ^6,7. Quindi, il periostio si attiva e si espande, e le cellule periosteali si differenziano in condrociti per formare un callo cartilagineo che cresce per riempire il vuoto lasciato dai segmenti ossei interrotti 6,7,8,9. Le cellule neurali e vascolari invadono il callo appena formato per fornire ulteriori cellule e molecole di segnalazione necessarie per facilitare la riparazione 6,7,8,9,10. Oltre a contribuire alla formazione del callo, le cellule periosteali si differenziano anche in osteoblasti che depongono l'osso tessuto nel callo ponte. Infine, gli osteoclasti rimodellano l'osso appena formato per tornare alla sua forma originale e alla struttura lamellare 7,8,9,10,11. Molti gruppi hanno sviluppato modelli murini di riparazione delle fratture. Uno dei primi e più spesso utilizzati modelli di frattura nei topi è l'approccio Einhorn, in cui un peso viene lasciato cadere sulla gamba da un'altezza specifica¹². La mancanza di controllo sull'angolo e la forza applicata per indurre la frattura crea molta variabilità nella posizione e nelle dimensioni della discontinuità ossea. Successivamente, si traduce in variazioni nella specifica risposta di guarigione della frattura osservata. Altri approcci popolari sono l'intervento chirurgico per produrre un difetto monocorticale tibiale o fratture da stress, procedure che inducono risposte di guarigione relativamente più lievi^10,13. La variabilità in questi modelli è dovuta principalmente alla persona che conduce la procedura¹⁴.

Qui, un modello dettagliato di lesione del femore del topo consente il controllo della rottura per fornire una lesione riproducibile e consentire una valutazione quantitativa e qualitativa della riparazione della frattura del femore. In particolare, viene introdotta una svolta completa nei femori dei topi adulti e stabilizza le estremità della frattura per tenere conto del ruolo che il carico fisico gioca nella guarigione ossea. I metodi per la raccolta dei tessuti e l'imaging delle diverse fasi del processo di guarigione utilizzando l'istologia e la tomografia microinciuta (microCT) sono anche forniti in dettaglio.

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Harvard Medical Area. In questo protocollo sono stati utilizzati topi C57BL/6J di 12 settimane (maschi e femmine). I topi maschi e femmine C57BL / 6J raggiungono il picco di massa ossea intorno alle 12 settimane di età con i femori abbastanza larghi da adattarsi a un perno stabilizzatore, rendendoli un ceppo appropriato da utilizzare per questo protocollo¹⁵.

1. Preparazione per l'intervento chirurgico

1. Autoclave l'attrezzatura chirurgica, tra cui forbici chirurgiche, pinze diritte, pinze curve, morsetti chirurgici e ruota di taglio diamantato (vedi Tabella dei materiali) per ridurre al minimo il rischio di infezione.
2. Posizionare una gabbia per topi pulita su una piastra riscaldante per facilitare il recupero post-chirurgico. Impostare il termoforo in modo che raggiunga una temperatura compresa tra 37-45 °C.
3. Posizionare il mouse in anestesia utilizzando una camera isoflurano. Impostare il flusso di ossigeno di induzione a 2 L/min, l'induzione isoflurano al 2-4%, l'ossigeno del cono del naso di mantenimento a 2 L/min e l'isoflurano di mantenimento è dell'1,4%.
4. Verificare che la respirazione del mouse sia stabile e che non rispondano a un pizzico di punta. Applicare un sottile strato di unguento oftalmico su ciascun occhio per prevenire graffi corneali. Trasferire il mouse su un tampone sterile e mantenere l'anestesia utilizzando un cono nasale per erogare isoflurano continuamente alla stessa velocità del passaggio 1.3.
   NOTA: si consiglia l'uso di topi di 12 settimane o più vecchi poiché i femori dei topi più giovani potrebbero essere troppo sottili per ospitare un perno stabilizzante.
5. Iniettare il topo per via sottocutanea con 0,05 mg/kg di peso corporeo di buprenorfina a lento rilascio (vedere Tabella dei materiali).
6. Utilizzando un trimmer elettrico, radere un quadrato di 2 x 2 cm su entrambe le cosce corrispondente alla posizione del femore.
7. Disinfettare l'area rasata utilizzando garze sterili o tamponi per stendere uno strato di iodio seguito da un risciacquo con etanolo al 70% (Figura 1A).

2. Chirurgia

1. Usando un bisturi sterile, fai un'incisione di 5 mm nella regione rasata e disinfettata e stacca la pelle per esporre la fascia sottostante.
2. Usa una pinza dritta e forbici sottili per afferrare delicatamente e tagliare la fascia che copre direttamente il femore per esporre il muscolo. Un taglio di 5 mm della fascia è sufficiente per accedere al muscolo sottostante.
3. Usando un paio di pinze dritte, separare delicatamente il muscolo dal femore con un danno tissutale minimo.
4. Una volta che il femore è visibile, far scorrere la pinza curva sotto il femore tra il muscolo separato e l'osso. Lascia che la pinza si apra lentamente per mantenere la separazione muscolare e fissare il femore per facilitare un taglio pulito.
   NOTA: Il femore deve rimanere esposto e separato dal muscolo e dalla pelle quando la pinza non viene tenuta, come mostrato nella Figura 1B.
5. Effettuare un taglio trasversale al centro dell'albero del femore utilizzando una sega portatile sull'impostazione a bassa potenza (vedere Tabella dei materiali per la lama e il kit di utensili rotanti utilizzati).
   NOTA: Una volta che il femore è completamente tagliato, vengono create due estremità di frattura: la sezione prossimale (attaccata all'osso dell'anca) e la sezione distale (attaccata al ginocchio, nota anche come articolazione soffocante). Evitare di tagliare il femore con un solo movimento. Invece, fai 3-5 passaggi fino a quando il femore non è completamente tagliato. Questo è fondamentale per evitare il surriscaldamento del tessuto circostante e la generazione di detriti ossei significativi, con un impatto negativo sulla guarigione.
6. Inserire un ago guida (23 G x 1 TW IM, 0,6 mm x 25 mm) (vedere Tabella dei materiali) nella cavità midollare della sezione distale. Utilizzare le dita per ruotare delicatamente l'ago mentre si spinge per infilare attraverso l'articolazione del ginocchio (Figura 1C).
   1. Rimuovere l'ago guida dall'estremità distale e ripetere sull'estremità prossimale, utilizzando lo stesso delicato movimento di torsione per spingere l'ago guida attraverso l'articolazione dell'anca. Lasciare l'ago guida all'estremità prossimale, con la punta emersa dalla pelle (Figura 1D).
      NOTA: Per stabilizzare le estremità della frattura, è stato prima utilizzato un ago guida per creare un percorso attraverso le estremità della frattura, quindi un perno stabilizzatore è stato infilato attraverso questo percorso per fissare le estremità della frattura¹⁴.
7. Inserire il perno stabilizzatore (ago, 27 G x 1 1/4, 0,4 mm x 30 mm) (vedere Tabella dei materiali) nella punta dell'ago guida (Figura 1E). Spingere delicatamente in modo che il perno stabilizzatore entri quando l'ago guida esce dalla cavità midollare dell'estremità prossimale.
   1. Scartare l'ago guida. Utilizzare una pinzetta per tenere e allineare l'estremità distale con l'estremità prossimale e continuare a infilare il perno stabilizzatore attraverso la cavità del midollo distale fino a quando non esce dall'articolazione del ginocchio utilizzando il percorso realizzato in 2.6 (Figura 1F).
      NOTA: il perno stabilizzatore dovrebbe ora sporgere dall'anca e dalle articolazioni del ginocchio.
8. Usando il morsetto chirurgico, tirare la punta del perno per avvicinare le sezioni prossimale e distale, in modo che si tocchino a malapena. Riallineare le estremità della frattura con una pinza, se necessario, e piegare le estremità del perno stabilizzatore verso il sito di frattura utilizzando il morsetto chirurgico (vedere Tabella dei materiali).
   1. Rimuovere la plastica dalla base dell'ago usando tagliafili. Utilizzando il morsetto, ruotare entrambe le estremità del perno fino a quando non sono smussate per evitare danni ai tessuti interni.
      NOTA: le estremità della frattura sono ora bloccate in posizione in modo che il mouse possa ingrassare sulla gamba ferita. Il perno è fissato se le estremità della frattura non sono in grado di separarsi. Un tagliafilo può anche essere usato per smussare le estremità. Il perno stabilizzatore deve rimanere in posizione per tutta la durata dello studio fino all'eutanasia del topo. I tentativi di spostare il perno rischiano di destabilizzare la risposta alla frattura e causare danni all'animale. Il perno può essere rimosso alla dissezione.
9. Utilizzare una pinza dritta per riposizionare il muscolo sul femore. Usando una pinza curva, pizzicare le estremità della pelle insieme e chiudere l'apertura usando clip per ferite.
   NOTA: Non chiudere la pelle troppo strettamente con le clip o il mouse eviterà di mettere peso su questa gamba. Limitare il carico fisico durante il recupero potrebbe ritardare il processo di guarigione.
10. Ripetere i passaggi da 2,2 a 2,4 sull'altra gamba e chiudere la ferita senza eseguire la frattura del femore.
    NOTA: Questo femore azionato da finzione funge da controllo controlaterale.
11. Ritirare l'esposizione isoflurano, posizionare il topo nella gabbia riscaldata e assicurarsi che riprenda conoscenza entro 10-15 minuti.
12. Monitorare l'attività del topo e il sito di incisione ogni giorno per 5 giorni dopo l'intervento chirurgico per segni di angoscia o infezione.
    NOTA: Se l'animale mostra segni di dolore, non sta mangiando e / o esita a camminare sugli arti posteriori, consultare il personale veterinario e somministrare ulteriori analgesici.
13. Rimuovere le clip della ferita 10 giorni dopo l'intervento chirurgico.
    NOTA: Se la ferita non sembra essersi chiusa dopo 10 giorni, consultare il personale veterinario e IACUC prima di rimuovere le clip.

3. Raccolta dei tessuti

1. Eutanasia dei topi tramite inalazione di CO₂ seguita da lussazione cervicale.
   NOTA: questa procedura è coerente con il gruppo di esperti scientifici sull'eutanasia dell'American Veterinary Medical Association.
2. Usando forbici e pinze, rimuovere la pelle da entrambe le gambe del topo, dislocare la testa del femore dall'osso dell'anca e tagliare il muscolo adiacente per liberare la gamba.
   NOTA: Evitare di rimuovere troppo muscolo intorno al femore in quanto il callo potrebbe essere spostato o danneggiato.
3. Evitando il perno stabilizzante, tagliare l'articolazione del ginocchio per separare il femore dalla tibia.
4. Sezionare intorno alle parti distali e prossimali del femore per esporre le estremità del perno stabilizzatore.
5. Con una fresa a filo duro, tagliare le estremità smussate piegate del perno in modo che rimanga solo la parte diritta del perno. Utilizzare una pinza per far scorrere lentamente e delicatamente il perno stabilizzatore fuori dal femore.
   NOTA: se il perno non scivola facilmente fuori, non applicare la forza in quanto ciò potrebbe rimuovere il callo e danneggiare il campione. Invece, prova a ruotare il perno e rimuoverlo delicatamente. La rimozione del perno può anche essere più facile dopo la fissazione.

4. Istologia - Colorazione Alcian Blue / Eosin / Orange G

NOTA: La colorazione Alcian Blue / Orange G / Eosin viene abitualmente utilizzata per visualizzare la cartilagine (blu) e l'osso (rosa). L'area cartilaginea può essere quantificata in proporzione all'area totale del callo (Figura 2A,B).

1. Fissare i femori in formalina tamponata neutra al 10% durante la notte a 4 °C.
2. Lavare i campioni fissi in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
3. Posizionare i campioni in 0,5 M EDTA, pH 8,0 su uno shaker a rotazione lenta per 2 settimane. Cambia la soluzione EDTA a giorni alterni per garantire una decalcificazione efficiente.
   NOTA: non è richiesto alcun numero di giri specifico per lo shaker; assicurarsi che il liquido scorra nel contenitore per coprire tutti i campioni. La decalcificazione completa può essere testata mediante radiografia dei femori.
4. Per elaborare i campioni per l'incorporamento di paraffina incubarli nelle seguenti soluzioni (1 h ciascuna): 70% EtOH, 95% EtOH, 100% EtOH, 100% EtOH, Xilene, Xilene, Paraffina, Paraffina.
5. Incorporare i campioni in paraffina per il sezionamento.
6. Tagliare sezioni longitudinali spesse 5-7 μm dei femori fratturati usando un microtomo.
7. Deparaffinizzare le sezioni incubandole in 2 bagni di Xilene (5 min ciascuno).
8. Reidratare le sezioni incubando nel seguente gradiente di etanolo (2 min ciascuna): 100% EtOH, 100% EtOH, 80% EtOH, 70% EtOH.
9. Metti gli scivoli nell'acqua del rubinetto per 1 minuto.
10. Preparare le soluzioni di blu alciano, alcool acido, acqua di ammonio ed eosina / arancia G per l'istologia come menzionato nel file supplementare 1.
    NOTA: I volumi suggeriti di ciascuna soluzione devono essere sufficienti per immergere completamente i vetrini per la colorazione.
11. Posizionare i vetrini in alcool acido per 30 s e incubare in blu Alcian per 40 min.
12. Lavare delicatamente sotto il rubinetto fino a quando l'acqua è limpida per circa 2 minuti.
13. Immergere rapidamente i vetrini in alcool acido per 1 s.
14. Risciacquare come descritto al punto 4.9.
15. Incubare in acqua di ammonio per 15 s.
16. Risciacquare come descritto al punto 4.9.
17. Mettere in 95% EtOHper 1 min e incubare in Eosin/Orange G per 90 s.
18. Disidratare rapidamente le diapositive con un singolo tuffo in 70% EtOH, 80% EtOH e 100% EtOH.
19. Posizionare le diapositive in xilene per 1 minuto per cancellare le diapositive.
20. Applicare un supporto di montaggio e un coperchio per l'imaging.
    NOTA: Per l'analisi molecolare, l'RNA e le proteine possono essere isolati dal callo. Sezionare attentamente il muscolo sotto un ambito di dissezione e separare il callo dall'osso sottostante usando un bisturi.

5. MicroCT

NOTA: Nelle fasi successive della guarigione, la microCT può essere eseguita per visualizzare e quantificare la mineralizzazione nel callo duro e il gap di frattura. Nei topi C57BL/6J, il callo è solitamente mineralizzato e rilevabile da microCT dopo 10 giorni dopo la frattura (dpf) (Figura 2C).

1. Fissare i femori in formalina tamponata neutra al 10% durante la notte a 4 °C.
   NOTA: MicroCT può essere eseguito sugli stessi femori utilizzati per l'istologia purché sia fatto prima della decalcificazione EDTA (passo 4.3). Quando si utilizzano gli stessi femori per entrambe le tecniche, eseguire microCT, recuperare i campioni e andare al passaggio 4.3.
2. Lavare i campioni fissi in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e conservare in EtOH al 70%.
3. Eseguire microCT con una dimensione del voxel isotropo di 7 μm a un livello di energia di 55 kVP e un'intensità di 145 μA (vedi Tabella dei materiali).
4. Contornare le fette microCT per includere il callo ed escludere l'osso corticale.
   NOTA: Man mano che il callo diventa più mineralizzato con il tempo, la soglia può essere regolata per visualizzare e misurare il volume del callo in diverse fasi.
5. Ottenere il volume osseo contenuto nei contorni del callo come misura del volume del callo.
   NOTA: Il gap di frattura può essere misurato direttamente sulle fette microCT come la distanza occupata dalla rottura.

Nei topi C57BL / 6J, un intervento chirurgico di successo completa le fasi di guarigione menzionate in precedenza con poca o nessuna risposta infiammatoria locale o coinvolgimento periostale nel femore controlaterale operato da finzione. Un ematoma si forma poche ore dopo l'intervento chirurgico e il periostio viene attivato per reclutare progenitori scheletrici per la condrogenesi. Varie popolazioni cellulari, come i progenitori mesenchimali Prx1+, possono essere rintracciate durante il processo di riparazione utilizzando modelli murini reporter fluorescenti disponibili in commercio (Figura 3). A 5 giorni dalla frattura (dpf), la colorazione Alcian Blue può essere utilizzata per visualizzare il callo molle e successivamente quantificare l'area della cartilagine (Figura 2A,B). La mineralizzazione è rilevabile mediante microCT a 28 dpf (Figura 2C). Il volume del callo mineralizzato, la distanza del gap di frattura e la resistenza ossea misurata dai test meccanici sono comunemente usati come risultati quantificabili della riparazione della frattura. La modificazione genetica o l'intervento farmacologico possono cambiare il corso del recupero, quindi si consiglia di eseguire uno studio a tempo per caratterizzare le fratture in diverse fasi di riparazione. L'intero callo può essere sezionato per l'analisi molecolare e l'albero osseo controlaterale può essere utilizzato come controllo.  Se le estremità della frattura non sono allineate o adeguatamente fissate con il perno, le immagini risultanti mostreranno una mancanza di formazione del callo su tutto o un lato del sito di frattura (Figura 4).

Figura 1: Frattura e inserimento del perno stabilizzatore. (A) Un quadrato viene rasato sulla gamba destra di un mouse C57BL/6J. (B) Dopo un'incisione nella pelle e nella fascia, una pinza curva viene fissata sotto il femore per separare il muscolo, la pelle e l'osso. (C) Dopo aver effettuato il taglio, vengono create due estremità di frattura: la sezione prossimale del femore attaccata all'osso dell'anca e la sezione distale attaccata al ginocchio. L'ago guida (verde) viene inserito nella sezione distale e spinto attraverso l'articolazione del ginocchio. (D) L'ago guida viene rimosso dalla sezione distale, inserito nella sezione prossimale e spinto attraverso l'articolazione dell'anca. (E) Il perno stabilizzatore (ago grigio) è inserito nell'ago guida che sporge dall'articolazione dell'anca. (F) Il perno stabilizzatore viene spinto attraverso la sezione prossimale, nella sezione distale e attraverso l'articolazione del ginocchio utilizzando il percorso fatto dall'ago guida in C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Istologia e microCT della frattura del femore. (A) Le sezioni di paraffina fissate in formalina delle fratture del femore sono state raccolte a 5, 10 e 28 dpf e colorate con Alcian Blue/Eosin/Orange G. Scale bar = 500 μm. (B) L'area della cartilagine è stata quantificata utilizzando il software ImageJ a 5, 10 e 28 dpf. (C) A 28 dpf, è stata osservata mineralizzazione e il volume del callo e il gap di frattura potevano essere misurati mediante microCT. Barra della scala = 1.000 μm. Dati mostrati come SEM ± media. Il volume del callo mineralizzato è stato misurato mediante contorno attorno all'osso corticale nel sito di frattura. L'area grigio scuro delinea il callo mineralizzato sull'immagine, mentre l'osso corticale (grigio chiaro) non è incluso nella misurazione. Dati indicati come Mean ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Modello reporter fluorescente utilizzato per visualizzare l'espansione delle cellule periostale Prx1+ dopo la frattura. Prx1CreER; I topi Rosa26tdTomato sono stati iniettati quotidianamente per cinque giorni con 80 mg/kg di peso corporeo di tamoxifene per indurre l'espressione di tdTomato. Tre giorni dopo l'iniezione finale, è stata avviata la frattura del femore e i topi sono stati sacrificati a 7 o 14 dpf per tracciare dove si trovano le cellule che esprimono Prx1 e la loro progenie (Prx1 +) all'interno del callo della frattura e del periostio espanso. Barra della scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Esempio di guarigione irregolare dovuta a problemi chirurgici. Le estremità della frattura non erano allineate correttamente e il perno stabilizzatore perforava la sezione prossimale del femore in questo esempio. Questi errori hanno provocato la formazione del callo in cui il femore è stato forato (scatola gialla) piuttosto che nel sito di taglio. Barra della scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Composizione delle soluzioni necessarie per l'istologia. Fare clic qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.