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Articolo metodologico

Estrazione assistita da ultrasuoni di acido cannabidiolico dalla biomassa di cannabis

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DOI:

10.3791/63076

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27 maggio 2022

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1Department of Chemistry, Colorado State University-Pueblo, 2Chuncheon Bioindustry Foundation, 3Institute for Cannabis Research, Colorado State University-Pueblo

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'estrazione assistita da ultrasuoni (UAE) aumenta l'efficienza di estrazione dei solventi e quando applicata alla biomassa di Cannabis spp. riduce il tempo necessario per l'estrazione. Ciò riduce il costo e la potenziale perdita di cannabinoidi dovuta alla degradazione. Inoltre, gli Emirati Arabi Uniti sono considerati un metodo verde a causa del basso uso di solventi.

Abstract

La canapa industriale (Cannabis spp.) ha molti composti di interesse con potenziali benefici medici. Di questi composti, i cannabinoidi sono venuti al centro dell'attenzione, in particolare i cannabinoidi acidi. L'attenzione si sta rivolgendo verso i cannabinoidi acidi a causa della loro mancanza di attività psicotropa. Le piante di cannabis producono cannabinoidi acidi con piante di canapa che producono bassi livelli di cannabinoidi psicotropi. Pertanto, l'utilizzo della canapa per l'estrazione acida dei cannabinoidi eliminerebbe la necessità di decarbossilazione prima dell'estrazione come fonte per i cannabinoidi. L'uso dell'estrazione a base di solventi è ideale per ottenere cannabinoidi acidi in quanto la loro solubilità in solventi come la CO2 supercritica è limitata a causa dell'alta pressione e temperatura necessarie per raggiungere le loro costanti di solubilità. Un metodo alternativo progettato per aumentare la solubilità è l'estrazione assistita da ultrasuoni. In questo protocollo, è stato esaminato l'impatto della polarità del solvente (acetonitrile 0,46, etanolo 0,65, metanolo 0,76 e acqua 1,00) e della concentrazione (20%, 50%, 70%, 90% e 100%) sull'efficienza dell'estrazione assistita da ultrasuoni. I risultati mostrano che l'acqua era la meno efficace e l'acetonitrile era il solvente più efficace esaminato. L'etanolo è stato ulteriormente esaminato poiché ha la tossicità più bassa ed è generalmente considerato sicuro (GRAS). Sorprendentemente, il 50% di etanolo nell'acqua è la concentrazione di etanolo più efficace per estrarre la più alta quantità di cannabinoidi dalla canapa. L'aumento della concentrazione di acido cannabidiolico è stato del 28% rispetto al 100% di etanolo e del 23% rispetto al 100% di acetonitrile. Mentre è stato determinato che il 50% di etanolo è la concentrazione più efficace per la nostra applicazione, il metodo ha anche dimostrato di essere efficace con solventi alternativi. Di conseguenza, il metodo proposto è considerato efficace e rapido per l'estrazione di cannabinoidi acidi.

Introduzione

La canapa industriale (Cannabis spp.) produce cannabinoidi acidi in vari tessuti vegetali (fiori, foglie e steli), con la più alta concentrazione che si trova nel fiore1. L'industria della cannabis utilizza diversi metodi per estrarre questi composti. Uno di questi metodi è l'estrazione con solvente che utilizza un solvente non polare e / o polare, di cui l'etanolo è il più comunemente usato. Tuttavia, l'estrazione con solvente da sola è limitata nella sua capacità; pertanto, le tecniche di estrazione aumentativa, come l'estrazione assistita da microonde (MAE) e l'estrazione assistita da ultrasuoni (Emirati Arabi Uniti), sono progettate per aumentare la resa. Inoltre, il cannabidiolo ad alta concentrazione (CBD) può essere estratto utilizzando le tecnologie dei fluidi supercritici2.

L'estrazione è un processo dinamico e diversi fattori influenzano la sua efficienza, vale a dire il contenuto di umidità, la dimensione delle particelle e il solvente3. In particolare, per la tecnica degli Emirati Arabi Uniti, l'efficienza è governata da temperatura, pressione, frequenza e tempo4.

L'estrazione assistita da ultrasuoni è il processo in cui le onde ultrasoniche vengono fatte passare attraverso un liquido per agitare le particelle. Durante il processo di agitazione, i materiali vegetali subiscono cavitazione acustica, cicli di compressione ed espansione che formano bolle che collassano in soluzione con conseguente generazione di temperatura e pressione estreme5. Le variazioni di pressione e temperatura alterano le proprietà fisiche dei solventi, il che può comportare una maggiore efficacia dell'estrazione6. Inoltre, la cavitazione può interrompere le interazioni molecolari che portano alla lisciviazione di composti organici e inorganici dalla matrice vegetale7. Il processo coinvolge due tipi principali di fenomeni fisici: (1) diffusione attraverso la parete cellulare e (2) risciacquo del contenuto cellulare dopo aver rotto la parete8. Tuttavia, l'uso degli Emirati Arabi Uniti non è privo di insidie; ci sono diversi rapporti che gli Emirati Arabi Uniti possono degradare i composti 9,10. Inoltre, le temperature generate nei siti di cavitazione sono superiori a quelle necessarie per la decarbossilazione dei cannabinoidi. Tuttavia, Mudge et al.11 hanno utilizzato gli Emirati Arabi Uniti e non hanno osservato una grande decarbossilazione di CBD o tetraidrocannabinolo (THC), dimostrando così che gli Emirati Arabi Uniti sono un metodo efficiente e verde per l'estrazione dei cannabinoidi poiché possono essere estratti rapidamente utilizzando bassa energia.

De Vita et al.12 hanno esaminato l'uso specifico dei metodi MAE e degli Emirati Arabi Uniti e hanno scoperto che quando si applicano le condizioni ottimali per ciascun metodo, gli Emirati Arabi Uniti estraggono più CBD e THC acidi e neutri presenti nel materiale vegetale. Allo stesso modo, Rožanc et al.13 hanno confrontato più metodi di estrazione (Uae, soxhlet, macerazione e liquido supercritico) e hanno esaminato l'attività biologica degli estratti. Rožanc dimostrò che tutti i metodi erano efficaci nell'estrazione dei cannabinoidi; tuttavia il liquido supercritico e gli Emirati Arabi Uniti sono stati più efficaci nell'estrarre l'acido cannabidiolico (CBDA). Inoltre, l'estrazione degli Emirati Arabi Uniti ha avuto la più alta attività biologica quando misurata dal test 2,2-difenil-1-picrilidazyl (DPPH). Lo studio di Rožanc ha anche dimostrato che mentre i processi di estrazione sono efficaci nella produzione di estratti grezzi, rimane una porzione di composti non cannabinoidi che influenzano l'attività biologica degli estratti. Inoltre, questi composti possono complicare l'isolamento e la purificazione dei singoli composti cannabinoidi dagli estratti grezzi13.

Le tecniche di estrazione del fluido supercritico (SFE) sono state utilizzate per estrarre cannabinoidi neutri. Diversi studi hanno dimostrato che sfe più un solvente organico, come l'etanolo, ha portato a maggiori efficienze di estrazione di cannabinoidi neutri 2,3. Quando la pressione è stata aumentata a livelli in grado di estrarre i cannabinoidi acidi, anche il contenuto di non cannabinoidi è aumentato. Pertanto, queste alte pressioni non sono pratiche per la lavorazione industriale poiché la selettività della SFE per i cannabinoidi è diminuita ed è necessaria un'ulteriore post-elaborazione. Di conseguenza, la decarbossilazione deve essere eseguita prima della SFE, che può causare perdite di cannabinoidi fino al 18%2. Per aumentare l'efficienza nella SFE, è stato combinato con tecniche come l'estrazione in fase solida per aumentare la purezza dell'estratto finale14. Tuttavia, nonostante abbia un'elevata purezza come prodotto finale, si ottengono solo cannabinoidi neutri.

Tradizionalmente, nel laboratorio di analisi, i cannabinoidi venivano estratti in una miscela di metanolo 9:1:cloroformio. Tuttavia, Mudge et al.11 hanno dimostrato che l'estrazione efficace può essere effettuata con singoli solventi quando si impiegano gli Emirati Arabi Uniti. Lo studio ha dimostrato che l'80% di metanolo era efficace quanto la tradizionale estrazione di metanolo 9: 1: cloroformio, indicando così che solventi più verdi possono essere altrettanto efficaci. Pertanto, gli Emirati Arabi Uniti sono stati esaminati per il loro potenziale utilizzo a causa di diversi vantaggi, tra cui bassi costi di capitale, tempi di estrazione ridotti e minore consumo di energia e volumi di solventi. Tuttavia, nel caso degli Emirati Arabi Uniti, quando vengono utilizzati solventi polari, è possibile estrarre clorofilla e altri non cannabinoidi, il che può causare un problema nel colore7. Di conseguenza, per esaminare il potenziale per ottenere cannabinoidi acidi su scala commerciale, gli Emirati Arabi Uniti sono stati impiegati utilizzando la varietà di canapa industriale Cherry Wine. Cherry Wine è un ibrido di C. sativa e C. indica, un incrocio tra le varietà di The Wife e Charlotte's Cherries. La varietà Cherry Wine è una varietà ad alta produzione di CBDA (dal 15% al 25% di CBD) con bassi livelli di acido tetraidrocannabinolico (THCA). La varietà è una varietà C. indica-dominate che ha da 7 a 9 settimane di fioritura.

Al fine di stabilire il protocollo di estrazione ottimale degli Emirati Arabi Uniti, sono stati adottati due approcci: la tradizionale ottimizzazione un fattore alla volta (OFT) e un approccio Design of Experiment (DoE) utilizzando un Central Composite Design (CCD)15. Per il DoE, l'estrazione di CBDA / CBD è stata ottimizzata in base al rapporto campione / solvente, al tempo di estrazione e alla concentrazione di solvente come fattori e i dati risultanti sono stati analizzati dalla Response Surface Methodology (RSM). In conclusione, il protocollo descritto delinea il metodo ottimale per estrarre la più alta quantità di CBDA / CBD.

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Protocollo

1. Preparazione del materiale vegetale

  1. Ottenere infiorescenze di Cherry Wine da piante coltivate nel campo, piantate in una configurazione da sud a nord, con piante a 1 m di distanza al centro e file a 1,2 m di distanza (coltivazione situata a Longmont, Colorado, USA).
  2. Asciugare all'aria le infiorescenze a 35 °C per 48 ore. Macinare le infiorescenze usando una rettificatrice impostata a 177 μm.
  3. Passare il materiale polverizzato attraverso il setaccio a maglie n. 80. Conservare la polvere risultante in un sacchetto sigillato a temperatura ambiente per un uso futuro.

2. Estrazione ad ultrasuoni

  1. Pesare 0,5 g di polvere di infiorescenza di cannabis in un tubo conico da 50 ml. Aggiungere 40 ml di solvente (ad esempio, etanolo al 50% in acqua deionizzata) al recipiente.
  2. Posizionare il recipiente di estrazione nel bagno ad ultrasuoni impostato a 40 kHz e a temperatura ambiente (la potenza di sonicazione è di 100 W).
  3. Eseguire l'estrazione nel bagno ad ultrasuoni per 30 min, aumentando la temperatura del bagno da 25 °C a 30 °C.
  4. Decantare il fluido di estrazione in un tubo centrifugo.
  5. Centrifugare il fluido a 3.000 x g a 15 °C per 15 min. Filtrare il surnatante sotto vuoto attraverso una carta da filtro da 8 μm.

3. Analisi quantitativa della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)

  1. Diluire sette standard cannabinoidi: cannabicromene (CBC), CBD, CBDA, cannabinolo (CBN), acido tetraidrocannabinolico (THCA), Δ8-THC e Δ9-THC a concentrazioni operative di 100, 50, 25 e 12,5 μg / mL in metanolo al 100%. Mixare e sonicare per 5 minuti in un bagno ad ultrasuoni impostato a 40 kHz e potenza di sonicazione di 100 W
  2. Filtrare gli standard attraverso un filtro a siringa in politetrafluoroetilene (PTFE) da 0,45 μm. Filtrare il surnatante campione (dal punto 2.5) attraverso un filtro a siringa in PTFE da 0,45 μm.
  3. Inserire il campione da analizzare in un flaconcino da 1,5 mL nell'autocampionatore HPLC e caricare 10 μL alla volta.
  4. Eseguire HPLC secondo le condizioni e i parametri forniti nella Tabella 1. Ricavare concentrazioni di cannabinoidi in 50-200 μg/mL dalla curva standard generata.
  5. Moltiplicare con il volume del solvente (40 ml) utilizzato nel processo di estrazione per ottenere μg di cannabinoide. Converti i μg di cannabinoidi in mg di cannabinoidi dividendoli per 1000.
  6. Dividere con il peso originale del materiale vegetale (0,5 g) utilizzato nell'estrazione per ottenere mg/g di peso secco.

4. Ottimizzazione utilizzando la metodologia della superficie di risposta

  1. Stabilire il modello, composto da 15 esecuzioni sperimentali con 12 punti fattoriali e tre punti centrali come mostrato nella Tabella 4 utilizzando uno strumento di analisi dei dati.
  2. Ottimizzare i parametri di estrazione, il tempo di estrazione (T), la concentrazione di solvente (S) e il rapporto campione/solvente (R) utilizzando la metodologia della superficie di risposta e la progettazione composita centrale. Impostare l'intervallo di variabili T, S e R rispettivamente come 5-30 min, 20%-100% e 60-100 (1:X).
  3. Seleziona la resa totale dell'estratto lipofilo e le rese di CBD e CBDA estratti come fattori di risposta (RF).

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Risultati

I solventi utilizzati vanno dal centro dell'indice di polarità (0,460 - ACN) al polare (1.000 - acqua). Dalla Tabella 2, si può vedere che l'acqua non ha reso un estrattore efficace per i cannabinoidi, il che non è inaspettato, poiché i cannabinoidi hanno una solubilità limitata in acqua a causa della loro idrofobicità13. A differenza dell'acqua, gli altri solventi avevano valori estratti simili di CBD e CBDA, con il solvente meno polare acetonitrile (ACN) che aveva un'estrazione ...

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Discussione

La polarità di un solvente svolge un ruolo fondamentale nell'estrazione efficace dei composti. Poiché i cannabinoidi acidi sono leggermente polari in natura, in gran parte a causa della porzione di acido carbossilico, si è ipotizzato che un solvente polare come il metanolo o l'etanolo sarebbe stato più efficace. Garrett e Hunt19, nel loro studio che utilizzava THC, hanno dimostrato che la solubilità nell'etanolo acquoso si basava sulla percentuale di etanolo nella soluzione e sulla forza ionica de...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sostenuta dall'Institute of Cannabis Research della Colorado State University-Pueblo, dalla sovvenzione della Korea Innovation Foundation finanziata dal governo coreano (MSIT) (2021-DD-UP-0379) e dalla città di Chuncheon (Hemp R&D and industrialization, 2020-2021).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AcetonitrileJ.K.Baker9017-88solvente
CannabicromeneCerilliantC-143Cannabinoidi standard
CannabidioloCerilliantC-045Cannabinoidi standard
Acido cannabidiolicoCerilliantC-144Cannabinoidi standard
CannabidivarinaCerilliantC-140Cannabinoidi standard
CannabigeroloCerilliantC-141Cannabinoidi standard
CannabinoloCerilliantC-046Cannabinoidi standard
CentrifugaHanil Scientific IncSupra 22KCentrifuga
Cherry Wine canapaCFH, Ltd.-Materiale di estrazione dei fiori
Acqua distillataTEDIAWS2211-001
solvente EtanoloTEDIAES1431-001
solvente Carta da filtroWhatman# 2Macinatore filtrante
Daesung ArtlonDA280-SMacinazione
HPLCShimadzuLC-10 sistemaAnalisi dei cannabinoidi
MetanoloTEDIAMS1922-001solvente
Minitab 16.2.0Minitab Inc.
Filtri per siringheWhatman6779-1304Filtraggio
TetraidrocannabivarinaCerilliantT-094Cannabinoidi standard Acido
trifluoroaceticoSigma-aldrich302031-1LSolvente a flusso HPLC
Bagno non trasonicoJinwoo4020PEstrazione ad ultrasuoni
Zorbax Eclipse plus C18 ColonnaHPLCColonna HPLC Agilent9599990-902
Delta; 8 - TetraidrocannabinoloCerilliantT-032Cannabinoidi standard
& Delta; 9 - TetraidrocannabinoloCerilliantT-005Cannabinoidi standard
& Delta; 9 - Acido tetraidrocannabinolicoCerilliantT-093Standard dei cannabinoidi
&

Riferimenti

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