Toolkit open source: array di microelettrodi in fibra di carbonio da banco per la registrazione nervosa

Gran parte della ricerca neuroscientifica si basa sulla registrazione di segnali neurali utilizzando l'elettrofisiologia (ePhys). Questi segnali neurali sono cruciali per comprendere le funzioni delle reti neurali e nuovi trattamenti medici come la macchina cerebrale e le interfacce nervose periferiche1,2,3,4,5,6. La ricerca che circonda i nervi periferici richiede elettrodi di registrazione neurale personalizzati o disponibili in commercio. Gli elettrodi di registrazione neurale, strumenti unici con dimensioni in scala micron e materiali fragili, richiedono un insieme specializzato di competenze e attrezzature da fabbricare. Una varietà di sonde specializzate sono state sviluppate per usi finali specifici; tuttavia, ciò implica che gli esperimenti devono essere progettati attorno a sonde commerciali attualmente disponibili, o un laboratorio deve investire nello sviluppo di una sonda specializzata, che è un processo lungo. A causa dell'ampia varietà di ricerche neurali nel nervo periferico, c'è una forte domanda di una sonda ePhys versatile4,7,8. Una sonda ePhys ideale sarebbe caratterizzata da un piccolo sito di registrazione, bassa impedenza9 e un prezzo finanziariamente realistico per l'implementazione in un ^sistema3.

Gli attuali elettrodi commerciali tendono ad essere elettrodi extraneurali o a bracciale (Neural ^Cuff10, MicroProbes Nerve Cuff ^Electrode11), che si trovano all'esterno del nervo, o intrafascicolari, che penetrano nel nervo e si trovano all'interno del fascicolo di interesse. Tuttavia, poiché gli elettrodi del bracciale si trovano più lontano dalle fibre, raccolgono più rumore dai muscoli vicini e da altri fascicoli che potrebbero non essere il bersaglio. Queste sonde tendono anche a restringere il nervo, che può portare al biofouling - un accumulo di cellule gliali e tessuto cicatriziale - all'interfaccia dell'elettrodo mentre il tessuto guarisce. Gli elettrodi intrafascicolari (come ^LIFE12, ^TIME13 e Utah Arrays14) aggiungono il vantaggio della selettività del fascicolo e hanno un buon rapporto segnale-rumore, che è importante per discriminare i segnali per l'interfacciamento della macchina. Tuttavia, queste sonde hanno problemi di biocompatibilità, con i nervi che si deformano nel tempo3,15,16. Se acquistate commercialmente, entrambe queste sonde hanno design statici senza possibilità di personalizzazione specifica dell'esperimento e sono costose per i laboratori più recenti.

In risposta ai problemi di costo elevato e biocompatibilità presentati da altre sonde, gli elettrodi in fibra di carbonio possono offrire una strada per i laboratori di neuroscienze per costruire le proprie sonde senza la necessità di attrezzature specializzate. Le fibre di carbonio sono un materiale di registrazione alternativo con un fattore di forma ridotto che consente un basso inserimento di danni. Le fibre di carbonio forniscono una migliore biocompatibilità e una risposta cicatriziale notevolmente inferiore rispetto al ^{silicio17,18,19} senza l'intensa lavorazione in camera bianca5,13,14. Le fibre di carbonio sono flessibili, durevoli, facilmente integrabili con altri ^{biomateriali19} e possono penetrare e registrare da ^nerve7,20. Nonostante i numerosi vantaggi delle fibre di carbonio, molti laboratori trovano ardua la fabbricazione manuale di questi array. Alcuni ^gruppi21 combinano fibre di carbonio in fasci che collettivamente si traducono in un diametro maggiore (~ 200 μm); tuttavia, per quanto ne sappiamo, questi fasci non sono stati verificati nel nervo. Altri hanno fabbricato array di elettrodi in fibra di carbonio individuati, sebbene i loro metodi richiedano guide in fibra di carbonio fabbricate in camera ^{bianca22,23,24} e apparecchiature per popolare i loro ^{array17,23,24}. Per risolvere questo problema, proponiamo un metodo per fabbricare un array in fibra di carbonio che può essere eseguito al banco del laboratorio che consente modifiche estemporanee. L'array risultante mantiene le punte degli elettrodi individuate senza strumenti specializzati per il popolamento delle fibre. Inoltre, vengono presentate più geometrie per soddisfare le esigenze dell'esperimento di ricerca. Basandosi su lavori precedenti8,17,22,25, questo documento fornisce metodologie dettagliate per costruire e modificare manualmente diversi stili di array con il minimo tempo di formazione in camera bianca necessario.

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Michigan.

1. Scegliere un array in fibra di carbonio

1. Scegliere un circuito stampato (PCB) da uno dei tre progetti mostrati nella Figura 1.
   NOTA: per questo protocollo, gli array Flex saranno al centro dell'attenzione.
   1. Fare riferimento ai progetti PCB sul sito Web di Chestek Lab (https://chestekresearch.engin.umich.edu), gratuitamente e pronti per essere inviati e ordinati per la stampa tramite una tipografia PCB.
   2. Vedere la Tabella 1 per un riepilogo dei connettori per ogni scheda e le relative specifiche per facilitare la scelta del connettore che funzionerà per la configurazione sperimentale specifica.

2. Saldatura del connettore al circuito stampato

1. Impostare un saldatore a 315 °C (600 °F).
2. Applicare il flusso a tutti i pad di saldatura sul PCB.
   NOTA: il flusso all'interno di un tubo può essere schiacciato attraverso i cuscinetti, mentre il flusso in una pentola può essere applicato con l'estremità in legno di un applicatore con punta di cotone spalmando liberamente il flusso su tutti i cuscinetti.
3. Formare piccoli cumuli di saldatura sui cuscinetti posteriori del Flex Array (Figura 2A).
4. Saldare la fila inferiore di pin del connettore alla fila posteriore di pad di saldatura (Figura 2B).
   NOTA: tutti i progetti di schede forniti dal laboratorio Chestek sono stati progettati in modo che i connettori si accoppiassero esattamente con la scheda designata.
   1. Per fare ciò, saldare i pin su entrambi i lati del connettore con un facile accesso ai tumuli di saldatura. Una volta fissato, spingere delicatamente la punta del saldatore tra i perni anteriori per saldare le connessioni rimanenti nella parte posteriore.
      NOTA: una volta fissata la fila posteriore di pin, il resto del connettore si allineerà con ciascun pin sopra il pad di saldatura assegnato.
5. Saldare la prima fila di perni alla scheda applicando una piccola quantità di saldatura a ciascun pin. Applicare un ulteriore strato di flusso se la saldatura non avviene rapidamente.
   1. Pulire il flusso in eccesso con alcool isopropilico al 100% (IPA) e una spazzola a setole corte.
6. Incapsulare le connessioni saldate in resina epossidica ritardata (Figura 2 C,D) utilizzando un ago da 23 G e una siringa da 1 mL posizionata con smussata lateralmente verso il basso sui perni. Spingere lentamente la resina epossidica attraverso la siringa in modo che scorra dentro e lungo le connessioni.
   1. Lasciare la scheda durante la notte in modo che la resina epossidica ritardata possa polimerizzare.
      NOTA: Mentre l'inserto del prodotto per il set epossidico ritardato afferma che polimerizza in 30 minuti, lasciarlo durante la notte consente di formare una connessione più stabile.
7. Fissare il retro della scheda ai lati del connettore posando una piccola linea di resina epossidica ritardata sul lato posteriore della scheda e tirandola sui bordi del connettore.
   1. Lascia la tavola per curare di nuovo durante la notte.
      Nota : a questo punto, archiviare le matrici o continuare la compilazione. Se si ferma nella build, conservare gli array in una scatola pulita e asciutta a temperatura ambiente.

3. Popolazione di fibre

1. Tagliare un capillare di vetro tirato in modo che la sua punta si inserisca tra le tracce dell'array (Figura 3A).
   1. Usando un estrattore di vetro e un filamento, crea capillari usando le seguenti impostazioni: Calore = 900, Pull = 70, Velocità = 35, Tempo = 200, Pressione = 900.
      NOTA: i numeri sono senza unità e specifici per questo dispositivo (vedere la Tabella dei materiali).
2. Utilizzare le estremità in legno di due applicatori con punta di cotone (uno per ogni parte di resina epossidica d'argento) per raccogliere un piccolo rapporto ~ 1: 1 di resina epossidica d'argento in un piatto di plastica e mescolare usando gli stessi bastoncini usati per raccogliere. Scartare gli applicatori dopo la miscelazione.
3. Tagliare 2-4 mm dall'estremità del fascio in fibra di carbonio su un pezzo di carta per stampanti usando una lama di rasoio. Per separare facilmente le fibre nel fascio, che sono difficili da separare, tirare delicatamente un pezzo di carta laminato sopra la parte superiore del fascio.
   NOTA: Il pezzo di carta laminato trasferisce la statica nelle fibre, che si separeranno da sole.
4. Applicare resina epossidica d'argento tra ogni altra coppia di tracce su un lato della tavola con il capillare di vetro (Figura 3B).
   1. Prendi una piccola goccia di resina epossidica all'estremità di un capillare tirato. Applicare delicatamente tra ogni altra traccia all'estremità della scheda, riempiendo lo spazio.
      NOTA: lo spazio deve essere riempito fino alla parte superiore delle due tracce senza traboccare per toccare le tracce vicine. Ogni traccia è collegata a un canale. Questo metodo di popolazione epossidica significa che ogni fibra avrà due canali collegati ad essa. Questo perché due tracce consentono un migliore allineamento della fibra e la ridondanza nel canale aiuta a garantire la connessione elettrica.
5. Utilizzare pinzette rivestite in teflon per posizionare una fibra di carbonio in ogni traccia epossidica (Figura 3C).
6. Utilizzare un capillare tirato pulito per regolare le fibre di carbonio, in modo che siano perpendicolari all'estremità della scheda Flex Array e sepolte sotto la resina epossidica (Figura 3D).
7. Posizionare gli array su un blocco di legno con estremità in fibra a strapiombo sul bordo del blocco.
   NOTA: il peso del back-end manterrà l'array sul blocco.
8. Cuocere il blocco di legno e le matrici a 140 °C per 20 minuti per polimerizzare la resina epossidica d'argento e bloccare le fibre in posizione.
9. Ripetere i passaggi da 3,4 a 3,8 per l'altro lato della scheda.
   NOTA: gli array possono essere memorizzati dopo qualsiasi fase di cottura; tuttavia, la statica dalle scatole di stoccaggio può causare l'allontanamento delle fibre dalla scheda se è stata applicata troppo poca resina epossidica d'argento durante il popolamento della scheda.
   1. Creare una piattaforma adesiva rialzata all'interno di una scatola in modo che la maggior parte della scheda possa essere attaccata all'adesivo consentendo alle estremità in fibra della scheda di essere sospese all'interno della scatola per evitare la rottura della fibra. Conservare a temperatura ambiente.
      NOTA: se le fibre si allontanano dalla scheda durante lo stoccaggio, raschiare la resina epossidica dalle tracce con un capillare di vetro tirato pulito e ripetere i passaggi 3.1-3.8 per sostituire le fibre. Da questo punto in poi, gli array devono essere conservati con le fibre sospese in questo modo per evitare la rottura della fibra.

4. Applicazione di resina epossidica ultravioletta (UV) per isolare le fibre di carbonio

1. Utilizzare un capillare pulito e applicare una piccola goccia (~ 0,5 mm di diametro di resina epossidica UV sulle tracce esposte su un lato della scheda (Figura 4A). Continuare ad aggiungere goccioline epossidiche UV fino a quando le tracce non sono completamente coperte.
   NOTA: non lasciare che la resina epossidica UV penetri sulle fibre di carbonio oltre l'estremità del PCB per garantire un inserimento regolare in seguito.
2. Polimerizzare la resina epossidica UV sotto una pen light UV per 2 minuti (Figura 4B).
3. Ripetere i passaggi 4.1-4.2 per l'altro lato della scheda.
4. Tagliare le fibre a 1 mm usando un reticolo stereoscopico e forbici chirurgiche.
   NOTA: le matrici possono essere memorizzate a questo punto fino a quando non sono pronte per procedere ai passaggi successivi. Dovrebbero essere conservati in una scatola che eleverà le fibre di carbonio lontano dalla scatola stessa. Gli array possono essere conservati a temperatura ambiente a tempo indeterminato.

5. Controllo dei collegamenti elettrici con scansioni di impedenza a 1 kHz (Figura 5)

1. Immergere le fibre di carbonio di 1 mm in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
2. Per completare il circuito, utilizzare un cloruro argento-argento (Ag| AgCl) elettrodo di riferimento e un'asta in acciaio inossidabile (controelettrodo).
   1. Utilizzando un morsetto per becher, sospendere l'Ag| Elettrodo AgCl nel PBS 1x e collegarlo al riferimento del sistema di impedenza in uso.
   2. Utilizzando un morsetto per becher, sospendere l'asta di acciaio inossidabile nel PBS 1x e collegarsi all'ingresso del controelettrodo del sistema di impedenza utilizzato.
3. Eseguire una scansione dell'impedenza di 1 kHz per ogni fibra utilizzando un potenziostato impostato su una frequenza di scansione di 1 kHz a 0,01 Vrms in una singola forma d'onda _sinusoidale . Impostare il potenziostato su 0 V all'inizio di ogni scansione per 5 s per stabilizzare il segnale registrato. Registrare le misurazioni tramite il software associato al potenziostato.
   NOTA: le misurazioni possono essere effettuate in qualsiasi punto della costruzione; tuttavia, sono necessari solo prima dell'isolamento e durante la preparazione della punta. La tabella 2 elenca gli intervalli tipici di impedenze dopo ogni fase di costruzione a 1 kHz per riferimento dell'utente.
4. Risciacquare le fibre in acqua deionizzata (DI) immergendole in un piccolo becher tre volte e lasciarle asciugare a temperatura ambiente.
   NOTA: gli array possono essere lasciati in archivio fino a quando l'utente non può continuare con il passaggio successivo.

6. Isolamento Parylene C

NOTA: Parylene C è stato scelto come materiale isolante per le fibre di carbonio in quanto può essere depositato a temperatura ambiente su lotti di array e fornisce un rivestimento altamente conforme.

1. Mascherare il connettore Flex Array utilizzando il connettore di accoppiamento.
2. Posizionare un lotto di 8-12 array in una scatola di stoccaggio con una piattaforma adesiva rialzata in modo che possano essere isolati in un'unica corsa. Posizionare gli array in modo che l'estremità del connettore dell'array si trovi sulla piattaforma adesiva con l'estremità in fibra dell'array sporgente (Figura 6) per evitare che le fibre si attacchino all'adesivo e si stacchino e per garantire un rivestimento parylene uniforme sulle fibre.
3. Rivestire gli array in un sistema di deposizione Parylene C a uno spessore di 800 nm in una camera bianca, indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) come definito dalla singola camera bianca utilizzata.
   NOTA: Qui, i DPI sono stati definiti come scarpe da camera bianca, tuta, copricapo, occhiali, maschera e guanti in lattice. Va notato che questo è un DPI standard per entrare in una camera bianca. Questo passaggio può essere esternalizzato a un'azienda di rivestimento Parylene a pagamento; tuttavia, un servizio commerciale può essere in grado di rivestire più array contemporaneamente. Ogni sistema di deposizione di Parylene C può avere diverse precauzioni di sicurezza. Contattare il tecnico prima dell'uso per garantire la sicurezza dell'utente.
4. Rimuovere il connettore di accoppiamento utilizzato come maschera dal Flex Array.
5. Posizionare gli array in una nuova scatola per l'archiviazione fino al momento dell'uso.

7. Metodi di preparazione della punta

NOTA: due preparazioni di punta in questa sezione utilizzano laser per tagliare le fibre. I DPI adeguati, come gli occhiali resistenti alle lunghezze d'onda utilizzate, dovrebbero sempre essere indossati quando si utilizza il laser e anche altri utenti di laboratorio nelle vicinanze del laser dovrebbero essere in DPI. Sebbene le lunghezze delle fibre elencate in questi passaggi siano lunghezze consigliate, gli utenti possono provare qualsiasi lunghezza adatta alle loro esigenze. L'utente deve scegliere uno dei seguenti metodi di preparazione della punta poiché il taglio a forbice da solo non sarà sufficiente per riesporre l'elettrodo25.

1. Granato di alluminio di ittrio drogato al neodimio (Nd: YAG) tagliato al laser
   1. Tagliare le fibre a 550 μm con le forbici chirurgiche.
   2. Utilizzare un laser pulsato Nd:YAG da 532 nm (5 mJ/impulso, durata 5 ns, 900 mW) per tagliare 50 μm dalla punta delle fibre per riesporre il carbonio sotto il Parylene C (di solito richiede 2-3 impulsi).
      1. Allineare le punte in fibra utilizzando lo stereoscopio integrato fornito con questo sistema laser.
         NOTA: Questo sistema consente all'utente di allineare una finestra (qui, 50 μm x 20 μm (altezza x larghezza)) è stata utilizzata per comprendere l'estremità della fibra.
      2. Focalizza lo stereoscopio sull'estremità della fibra con un ingrandimento di 500x per un taglio accurato e preciso.
         NOTA: Parylene C si abla leggermente (<10 μm) dalla punta lasciando una punta smussata e cilindrica.
2. Affilatura fiamma ossidrica25,26,27
   1. Tagliare le fibre a 300 μm con le forbici chirurgiche.
   2. Immergere l'array in un piatto di acqua deionizzata, il connettore verso il basso e fissato al fondo del piatto con una piccola quantità di stucco.
   3. Utilizzare una fotocamera a penna per allineare le fibre con la superficie dell'acqua in modo che le fibre tocchino a malapena la superficie dell'acqua.
   4. Regolare una fiamma della fiamma della fiamma ossidrica a butano a 3-5 mm e farla scorrere sulla parte superiore delle fibre in un movimento avanti e indietro per affilare le fibre.
      NOTA: le punte in fibra si illuminano di arancione quando la fiamma passa sopra di esse.
   5. Rimuovere l'array dallo stucco e ispezionarlo sotto uno stereoscopio per punte appuntite con ingrandimento 50x.
      NOTA: se si osservano punte appuntite, non è necessaria alcuna ulteriore fiamma ossidrica. Se le punte appaiono smussate, ripetere i passaggi 7.2.2-7.2.5.
3. Taglio laser ^UV28
   NOTA: il laser UV può essere utilizzato solo su progetti a forza di inserimento zero (ZIF) e Wide Board al momento a causa del grande punto focale del laser UV utilizzato che è più grande del passo delle fibre di carbonio Flex Array.
   1. Tagliare le fibre di carbonio a 1 mm con le forbici chirurgiche.
   2. Applicare un laser UV a tre stadi motorizzati configurati ortogonalmente.
      NOTA: Il laser UV è un semiconduttore multimodale al nitruro di indio gallio (InGaN) con potenza di uscita di 1,5 W e lunghezza d'onda di 405 nm.
      1. Assicurarsi che il laser abbia un raggio continuo per un allineamento e un taglio rapidi ed efficaci.
   3. Fissare l'array in posizione per mantenere un piano fermo e livellato di elettrodi in modo che il laser possa passare sopra. Assicurarsi che l'array sia tenuto a una distanza appropriata dal laser in modo che le fibre siano in luce con il punto focale del laser. Per fare ciò, fornire una potenza inferiore al laser e regolare la distanza per concentrarsi al meglio sulla ^fibra28.
   4. Spostare il punto focale del laser UV sul piano della fibra ad una velocità di 25 μm/s per tagliare le fibre alla lunghezza desiderata (qui, tutte le fibre vengono tagliate a 500 μm).
      NOTA: le fibre emetteranno una luce intensa prima di essere tagliate. Conservare le fibre dopo il trattamento fino a quando non sono pronte per essere rivestite con un polimero conduttivo.

8. Rivestimento conduttivo poli(3,4-etilendiossitiofene):p-toluensolfonato (PEDOT:pTS) per impedenza ridotta

1. Mescolare soluzioni di 0,01 M 3,4-etilendiossitiofene e 0,1 M sodio p-toluensolfonato in 50 mL di acqua DI e mescolare per una notte su una piastra di agitazione (~ 450 rpm) o fino a quando non si possono osservare particelle nella soluzione.
   NOTA: Conservare la soluzione in un contenitore resistente alla luce. Conservare in frigorifero la soluzione dopo la miscelazione per mantenere la soluzione utilizzabile per un massimo di 30 giorni.
2. Eseguire una scansione dell'impedenza a 1 kHz utilizzando gli stessi parametri di prima (passaggi 5.2-5.3) in 1x PBS. Si noti quali fibre hanno una buona connessione (<1 MΩ, in genere 14-16 di 16 fibre).
3. Piastra elettrolitica con PEDOT:pTS per abbassare l'impedenza degli elettrodi.
   1. Immergere le punte in fibra nella soluzione PEDOT:pTS.
   2. Seguire i passaggi superati nel passaggio 5.2, commutando la soluzione PBS 1x per PEDOT:pTS e accorciando tutte le connessioni alla scheda al canale corrente applicato.
   3. Applicare 600 pA per buona fibra per 600 s utilizzando un potenziostato.
   4. Spegnere la cella e lasciarla riposare per 5 s alla fine della corsa.
4. Rimuovere le fibre dalla soluzione e sciacquarle in acqua DI.
5. Riprendere le impedenze a 1 kHz per verificare che le fibre siano state rivestite correttamente (utilizzare gli stessi parametri elencati nei passaggi 5.2-5.3).
   NOTA: le fibre buone sono designate come qualsiasi fibra con un'impedenza inferiore a 110 kΩ.

9. Collegamento di fili di terra e di riferimento

1. Raschiare delicatamente Via Parylene C da terra e le vie di riferimento sulla scheda usando una pinzetta. Accorciare il terreno e le vie di riferimento insieme in coppia su questo design della scheda.
   NOTA: le vie di terra e di riferimento si trovano vicino al connettore sull'array Flex e sono i quattro piccoli cerchi dorati vicino ai connettori. Gli utenti dovranno solo rimuovere Parylene C dalle vie più vicine alle fibre di carbonio per le misurazioni.
2. Tagliare due lunghezze di 5 cm di filo d'argento isolato con una lama di rasoio. Deinsulare le estremità dei fili a 2-3 mm da un'estremità da fissare al Flex Array e ~ 10 mm dalle estremità opposte per consentire una più facile messa a terra e referenziazione durante l'intervento chirurgico.
3. Riscaldare il saldatore a 600 ° F. Applicare una piccola quantità di flusso alle vie.
4. Inserire un filo (estremità esposta da 2-3 mm) in ciascuna delle vie ePhys sulla scheda. Applicare la saldatura sulla parte superiore delle vie (Figura 7A). Lasciare raffreddare la sonda, quindi capovolgerla per applicare una piccola quantità di saldatura sul retro della via (Figura 7A).
5. Utilizzando le forbici chirurgiche, tagliare via qualsiasi filo esposto che sporge dal tumulo di saldatura posteriore in quanto ciò aiuta a ridurre il rumore visto nella registrazione (Figura 7B).
6. Riposizionare gli array nella scatola di stoccaggio, piegando i fili all'indietro e lontano dalla fibra. Fissare i fili sul nastro adesivo per evitare potenziali interazioni fibra-filo (Figura 7C).

10. Procedura chirurgica

NOTA: La corteccia di ratto è stata utilizzata per testare l'efficacia delle fibre preparate al laser UV come descritto in ^{precedenza7,20}. Queste sonde funzioneranno in nervo a causa della loro geometria e dei livelli di impedenza simili alle fibre preparate con fiamma ossidrica. Questo intervento chirurgico è stato eseguito con molta cautela per convalidare che il laser UV non ha cambiato la risposta degli elettrodi.

1. Anestetizzare un ratto Long Evans maschio adulto utilizzando una combinazione di ketamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Confermare l'anestesia con un test del pizzico della punta. Applicare un unguento sugli occhi per evitare che gli occhi del ratto si secchino durante l'intervento chirurgico.
2. Creare una craniotomia di 2 mm x 2 mm sopra la corteccia motoria dell'emisfero destro. Identificare l'angolo inferiore sinistro della craniotomia misurando 1 mm anteriore di bregma e 1 mm laterale della linea mediana.
3. Montare l'array in uno strumento stereotassico e azzerare lo strumento stereotassico sulla dura abbassando delicatamente le fibre fino a quando non toccano la superficie della dura. Sollevare l'array lontano dal sito chirurgico e spostarlo di lato fino a quando non è pronto per l'inserimento.
4. Resettare la dura tirando delicatamente un ago con un'estremità spinata sulla superficie del tessuto. Una volta che una parte della dura si apre al cervello, usa un paio di pinze sottili per aiutare ulteriormente a tirare via la dura.
5. Inserire le fibre nella craniotomia e 1,2 mm nel cervello utilizzando uno strumento stereotassico, abbassando lentamente a mano.
6. Registra i dati ePhys per 10 minuti con un headstage e un preamplificatore specifici per ePhys.
   1. Impostare il filtro passa-alto del preamplificatore per elaborare il segnale a 2,2 Hz, le antialie a 7,5 kHz e il campione a 25 kHz.
      NOTA: per queste misurazioni, viene registrata solo l'attività spontanea. Non viene applicato alcuno stimolo.
7. Eutanasia
   1. Posizionare il ratto sotto isoflurano al 5% sotto 1 L/min di ossigeno fino a quando i segni di vita non sono cessati (20-30 min). Confermare l'eutanasia con decapitazione.

11. Ordinamento dei picchi

1. Utilizzare un software di ordinamento spike per ordinare e analizzare i dati utilizzando metodi precedentemente ^segnalati8.
2. Utilizzare un filtro passa-alto su tutti i canali (angolo a 250 Hz, Butterworth di 4^° ordine) e impostare il livello di rilevamento della forma d'onda su -3,5 × soglia RMS.
   1. Utilizzare un modello gaussiano per raggruppare e picchi con caratteristiche simili. Combinare e mediare cluster di almeno 10 forme d'onda da includere in ulteriori analisi.
   2. Eliminare o eliminare tutte le forme d'onda che non sono picchi dal set di dati.
3. Esporta i dati una volta che tutti i canali sono stati ordinati e utilizza un software di analisi per tracciare e analizzare ulteriormente le forme d'onda.

12. Imaging a scansione al microscopio elettronico (SEM)

NOTA: questo passaggio renderà le matrici inutilizzabili e deve essere utilizzato solo per ispezionare i risultati del trattamento della punta per verificare che le matrici vengano elaborate correttamente. Non è necessario eseguire questo passaggio per creare una matrice di successo. Di seguito è riassunta una descrizione generale del processo SEM; tuttavia, gli utenti che non hanno precedentemente utilizzato SEM dovrebbero ricevere aiuto da un utente addestrato.

1. Tagliare l'estremità in fibra del PCB e montarlo su uno stub SEM mascherato con nastro di carbonio. Posizionare gli array su una piccola piattaforma di nastro di carbonio impilato (4-5 strati) per evitare che le fibre di carbonio si attacchino allo stub SEM.
2. Sputter-rivestire le matrici con oro (100-300 Å) seguendo le procedure descritte dal produttore del rivestimento sputter d'oro.
3. Per ispezionare gli effetti del trattamento della punta, visualizzare gli array in un SEM a una distanza di lavoro di 15 mm e una resistenza del fascio di 20 kV.
   NOTA: le matrici possono essere visualizzate senza sputter-coating sotto un basso vuoto, come mostrato nella Figura 8D per le fibre tagliate al laser UV. Per questa configurazione, si consiglia di avere una distanza di lavoro di 11-12 mm e una resistenza del fascio di 4 kV.

Convalida del suggerimento: immagini SEM
Lavori precedenti20 hanno dimostrato che il taglio a forbice ha provocato impedenze inaffidabili poiché Parylene C si è piegato attraverso il sito di registrazione. Il taglio a forbice viene utilizzato qui solo per tagliare le fibre alla lunghezza desiderata prima della lavorazione con un metodo di taglio di finitura aggiuntivo. Le immagini SEM delle punte sono state utilizzate per determinare la lunghezza del carbonio esposto e la geometria della punta (Figura 8).

Le fibre tagliate al laser a forbice e Nd:YAG sono state precedentemente riviste17,20. Le fibre tagliate a forbice (Figura 8A) hanno geometrie della punta incoerenti, con Parylene C che si piega all'estremità quando viene tagliato20. Le fibre tagliate al laser Nd:YAG rimangono coerenti nell'area, nella forma e nell'impedenza del sito di registrazione (Figura 8B). Le fibre ossidrica20 portano alla più grande dimensione dell'elettrodo e alla variabilità della forma e una punta affilata, consentendo l'inserimento nel tessuto duro. In media, 140 μm di carbonio sono stati riesposti, con un'area di transizione regolare tra il carbonio e l'isolamento Parylene C (Figura 8C). Le fibre tagliate al laser UV erano simili alle fibre ossidite, mostrando 120 μm di carbonio esposte dalla punta (Figura 8D). Le impedenze hanno indicato che i metodi di taglio della punta del laser UV o della fiamma ossidrica sono adatti per ePhys e sono soluzioni praticabili per i laboratori senza accesso a un laser Nd: YAG.

Convalida del suggerimento: registrazione elettrica
La Figura 9 mostra le impedenze risultanti da ciascun metodo di preparazione utilizzando Flex Arrays. I valori risultanti si trovano all'interno di un intervallo appropriato per la registrazione ePhys. Le fibre tagliate al laser Nd:YAG hanno prodotto la superficie più piccola ma le impedenze più elevate, anche con il rivestimento PEDOT:pTS (carbonio nudo: 4138 ± 110 kΩ; con PEDOT:pTS: 27 ± 1,15 kΩ; n = 262). Segue la relazione inversa in fibra fiamma soffiata (carbonio nudo: 308 ± 7 kΩ; con PEDOT:pTS: 16 ± 0,81 kΩ; n = 262) e UV taglio laser (carbonio nudo: 468 ± 85,7 kΩ; con PEDOT:pTS: 27 ± 2,83 kΩ; n = 7) che hanno un'ampia superficie e basse impedenze. Tuttavia, in tutti i casi, le fibre rivestite in PEDOT:pTS rientrano nella soglia di 110 kΩ impostata in precedenza per indicare un elettrodo buono e a bassa impedenza.

Le registrazioni acute di ePhys sono state prese da un ratto Long Evans impiantato acutamente con un array ZIF con fibre tagliate al laser UV e trattate con PEDOT: pTS per dimostrare la fattibilità di questo metodo. ePhys è stato precedentemente testato e testato con scissor-cut20 e Nd:YAG-17 e fibre trattate con fiamma ossidrica7,8 e quindi non è stato riconvalidato in questo testo. Le registrazioni acute di quattro fibre di trattamento laser UV (2 mm di lunghezza) che sono state contemporaneamente impiantate nella corteccia motoria del ratto (n = 1) sono presentate nella Figura 10. Tre unità sono state trovate su tutte le fibre, suggerendo che il trattamento delle fibre con il laser UV economico è simile ad altri metodi di taglio che consentono alla fibra di carbonio di registrare le unità neurali, come ci si aspetterebbe dai SEM e dalle impedenze. Mentre gli array in fibra di carbonio sono facilmente costruiti e modificati per soddisfare le esigenze dell'utente, va notato che è necessaria una convalida aggiuntiva per alcune build (Tabella 3), mentre altre sono meno adatte per determinate attività finali.

Parylene C commerciale
Gli array rivestiti commercialmente sono stati determinati dal fornitore per avere uno spessore Parylene C di 710 nm, ben all'interno della gamma target di isolamento. Gli array sono stati preparati per le registrazioni ePhys utilizzando la preparazione della punta della fiamma ossidrica. Le impedenze sono state prese dopo la preparazione delle punte e confrontate con i dati esistenti. Una sonda con fiamma ossidrica e rivestita in PEDOT:pTS aveva una media di 14,5 ± impedenza di 1,3 kΩ su 16 fibre. Sono state scattate immagini SEM della punta e del gambo per confrontare la deposizione di Parylene C (Figura 11 A, B, rispettivamente). Questi risultati mostrano che l'uso di un fornitore commerciale non ha modificato i valori di impedenza attesi, suggerendo che questa sarà una sostituzione altrettanto praticabile alla deposizione nella camera bianca dell'università.

Analisi dei costi dei dispositivi
A condizione che tutti gli strumenti e i materiali sfusi (ad esempio, epossidici, saldature) siano accessibili al ricercatore, una tassa utente Parylene C di $ 41 e un lotto di 8 sonde, il costo totale dei materiali è di $ 1168 ($ 146 per sonda). Lo sforzo del personale (Tabella 4) è di ~ 25 ore per il lotto. Se si utilizza una fase di fabbricazione sostituita, il costo delle sonde varierà in base al costo del rivestimento commerciale Parylene C ($ 500-800 quotati). Il tempo per i passaggi di compilazione (Tabella 4) è raggruppato per tutte le istanze di un'attività ripetuta per semplicità. I tempi di costruzione per i progetti con un passo più grande (Wide Board e ZIF) sono drasticamente ridotti in quanto i passaggi ad alta intensità manuale (ad esempio, il posizionamento in fibra di carbonio) sono più facili e veloci da completare.

Figura 1: Connettori e circuiti stampati associati. (A) Wide Board con uno dei sedici connettori necessari nell'inserto (barra della scala incassata = 5 mm). (B) ZIF e uno dei due connettori e un sudario. (C) Flex Array con connettore a 36 pin; barra della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Fasi di saldatura e isolamento per il Flex Array. (A) Posa della saldatura per i pin del connettore inferiore. (B) Perni posteriori fissati in posizione con i perni anteriori pronti per la saldatura. (C) Flex Array isolato con resina epossidica ritardata; si noti che la resina epossidica a montaggio ritardato non copre le vie di riferimento e di terra su entrambi i lati. (D) Retro del Flex Array con una banda di resina epossidica ritardata attraverso le vie del pad (non le vie di terra e di riferimento) e avvolta attorno al lato della scheda verso il bordo del connettore. Barra della scala = 0,5 cm (B) e 1 cm (A, C, D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Applicazione di resina epossidica d'argento e allineamento delle fibre di carbonio tra le tracce del Flex Array. I capillari sono stati evidenziati con una sovrapposizione bianca. (A) L'estremità del capillare si inserisce tra le tracce per ottenere (B) una deposizione epossidica d'argento pulita (indicata con frecce all'estremità del capillare e all'interno delle tracce) senza spillover al di fuori delle coppie di tracce. (C) Le fibre di carbonio vengono inserite nella resina epossidica e quindi (D) raddrizzate con un capillare pulito. Barre di scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Isolamento con applicazione epossidica UV (A) La resina epossidica UV viene applicata utilizzando un capillare pulito e due gocce di resina epossidica UV (contrassegnate con sovrapposizioni bianche). La resina epossidica UV viene applicata in goccioline di diametro 0,25-0,75 mm fino a quando la resina epossidica UV forma una bolla liscia sopra la parte superiore delle tracce. (B) La resina epossidica UV viene polimerizzata sotto la luce UV. Il Flex Array è posizionato in stucco su un blocco di legno per facilitare il movimento e l'allineamento sotto la luce UV. La luce UV è tenuta con un supporto ~ 1 cm sopra l'estremità del Flex Array. L'inserto (B) mostra il profilo laterale di un Flex Array correttamente isolato con resina epossidica UV. La bolla epossidica UV su entrambi i lati della scheda è alta circa 50 μm. Barre di scala = 500 μm (A e inserto B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Configurazione per le misure di impedenza. Tutte le parti sono etichettate e i connettori e gli adattatori di sistema dipendono dal sistema. PBS è contrassegnato da speciali quando la soluzione viene scambiata con PEDOT:pTS più avanti nella build; tuttavia, l'installazione è identica altrimenti. Abbreviazioni: PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; PEDOT:pTS = poli(3,4-etilendiossitiofene):p-toluensolfonato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Flex Array preparato per il rivestimento Parylene C. Il Flex Array è fissato a una piattaforma di schiuma rialzata con nastro adesivo, lato adesivo verso l'alto durante il processo di rivestimento. Barra della scala = 10 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Fili di terra e di riferimento collegati al Flex Array finalizzato. La saldatura è stata applicata su ciascun lato della via su entrambi i lati della scheda (A) per creare un legame sicuro. Le vie ePhys sono etichettate sulla scheda come GND e Ref e accoppiate sui lati opposti della scheda l'una dall'altra. Ci sono due vias aggiuntive etichettate anche GND e Ref2. Entrambe le vie GND sono accorciate insieme. Ref2 è pensato per essere utilizzato in esperimenti elettrochimici. Il filo in eccesso in (A) è indicato con una scatola rossa e viene rimosso (B) dal retro della sonda (la casella rossa mostra dove si trovava il filo) per aiutare con la riduzione del rumore e la gestione della sonda. (C) Final Flex Array memorizzato per un uso futuro. Si noti che le vie GND e Ref accoppiate su questa scheda lo rendono designato per le registrazioni ePhys. Barre di scala = 200 μm (A, B). Abbreviazioni: ePhys = elettrofisiologia; GND = terra; Ref = riferimento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Immagini SEM di fibre con diverse tecniche di taglio della punta. (A) Fibra tagliata a forbice con pochissimo carbonio esposto. (B) Taglio laser Nd:YAG. (C) Fibra ossidrica con ~ 140 mm di carbonio esposto dalla punta. (D) Fibre tagliate al laser UV con ~ 120 mm di carbonio esposto dalla punta. Le frecce rosse indicano l'area di transizione tra Parylene C e fibra di carbonio nuda. Barre di scala = 5 μm (A), 10 μm (B), 50 μm (C, D). Abbreviazioni: SEM = microscopia elettronica a scansione; Nd:YAG = Granato di alluminio di ittrio drogato al neodimio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Differenze di impedenza tra la sola applicazione del trattamento (nudo esposto al carbonio) e con l'aggiunta di PEDOT:pTS. In tutti i casi, l'aggiunta di PEDOT:pTS diminuisce l'impedenza di un ordine di grandezza. Dimensione del campione: Nd:YAG = 262, Fiamma ossidrica = 262, UV = 7. La differenza di dimensioni del campione UV è dovuta alla novità del metodo di preparazione; tuttavia, mostra una gamma simile alla fiamma ossidrica, come previsto. I dati di impedenza sono espressi come errori medi ± standard. Abbreviazioni: PEDOT:pTS = poli(3,4-etilendiossitiofene):p-toluensolfonato; Granato di alluminio ittrio drogato al neodimio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Dati di spiking elettrofisiologico acuto da quattro elettrodi tagliati al laser UV. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11: Array commerciali rivestiti con Parylene C. (A) L'array affilato mostra un'affilatura uniforme su tutte le fibre, indicando che non ci sono inconvenienti nel rivestimento commerciale. (B) Dopo la fiamma ossidrica, la transizione (scatola rossa) tra fibra di carbonio nuda e Parylene C non mostra alcuna differenza percepibile tra gli array rivestiti in una camera bianca. Barre di scala = 200 μm (A) e 10 μm (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Ogni PCB ha un connettore e un passo diversi ad esso associati. Abbreviazione: PCB = circuito stampato.

Tabella 2: Intervallo tipico di impedenze dopo ogni fase di costruzione (n = 272). *n = 16. Le sonde trattate con PEDOT:pTS superiori a 110 kΩ possono ancora registrare segnali; tuttavia, tutti gli elettrodi trattati in genere rientrano in questo valore. Abbreviazioni: PEDOT:pTS = poli(3,4-etilendiossitiofene):p-toluensolfonato; Granato di alluminio ittrio drogato al neodimio.

Tabella 3: Usi convalidati di ogni tavola con i metodi di taglio descritti. Tutti i metodi di taglio includevano l'elettrodeposizione di PEDOT:pTS. "Non vitale" indica che un fattore di forma del progetto impedisce che questo trattamento della punta venga testato in questo momento (ad esempio, il passo della fibra). Abbreviazioni: Granato di alluminio ittrio drogato al neodimio; SEM = microscopia elettronica a scansione; ePhys = elettrofisiologia; ZIF = forza di inserimento zero.

Tabella 4: Tempo necessario per ogni fase di un processo di fabbricazione. La saldatura del connettore e dei fili di terra e di riferimento sono stati combinati qui per semplificare l'elenco delle attività. Abbreviazioni: PEDOT:pTS = poli(3,4-etilendiossitiofene):p-toluensolfonato; Granato di alluminio ittrio drogato al neodimio.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.