Qui presentiamo protocolli per rilevare l'ossido nitrico e i suoi derivati biologicamente rilevanti utilizzando saggi basati sulla chemiluminescenza ad alta sensibilità.
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Articolo metodologico
Saggi basati sulla chemiluminescenza per la rilevazione di ossido nitrico e suoi derivati da autoxidazione e composti nitrosi
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'attività dell'ossido nitrico (NO) in vivo è il risultato combinato dei suoi effetti diretti, dell'azione dei suoi derivati generati dall'autossidazione dell'NO e degli effetti dei composti nitrosi. La misurazione dei metaboliti no è essenziale per studiare l'attività dell'NO sia a livello vascolare che in altri tessuti, specialmente nei contesti sperimentali in cui viene somministrato NO esogeno. I saggi di chemiluminescenza a base di ozono consentono misurazioni precise dei metaboliti NO e NO sia nei fluidi (inclusi plasma, omogeneizzati tissutali, colture cellulari) che nelle miscele di gas (ad esempio, respiro espirato). L'NO reagisce con l'ozono per generare biossido di azoto allo stato eccitato. La conseguente emissione luminosa permette il fotorilevamento e la generazione di un segnale elettrico che riflette il contenuto di NO del campione. Le aliquote dello stesso campione possono essere utilizzate per misurare specifici metaboliti NO, come nitrati, nitriti, S-nitrosotioli e complessi ferro-nitrosilici. Inoltre, l'NO consumato dall'emoglobina priva di cellule viene anche quantificato con l'analisi di chemiluminescenza. Viene fornita un'illustrazione di tutte queste tecniche.
Introduzione
Da quando Salvador Moncada e i premi Nobel Robert Furchgott, Louis Ignarro e Ferid Murad hanno identificato l'ossido nitrico (NO) come il fattore di rilassamento derivato dall'endotelio (EDRF) precedentemente noto, il ruolo centrale dell'NO è stato stabilito in diversi meccanismi chiave che abbracciano la biologia vascolare, le neuroscienze, il metabolismo e la risposta dell'ospite 1,2,3,4,5,6,7 . La somministrazione esogena di gas NO è ....
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Protocollo
Le procedure indicate in questo protocollo sono in conformità con il comitato di revisione del Massachusetts General Hospital. I campioni di sangue utilizzati erano stati raccolti durante uno studio precedente e sono stati de-identificati per lo scopo attuale18.
NOTA: vedere le istruzioni del produttore per indicazioni specifiche sui collegamenti ottimali tra tubi e bicchieri che costituiscono il recipiente di spurgo, il lavaggio e la manutenzione generale. Le connessioni devono essere solide e fatte con cura per non danneggiare la vetreria. Identificare i componenti del recipiente di spurgo del vetro: linea di ingre....
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Risultati
Il consumo di NO mediante il saggio hb senza cellule è stato utilizzato in campioni contenenti concentrazioni note di ossiHb privo di cellule (Figura 4). Poiché un eme di oxyHb rilascia stechiometricamente una molecola NO nel test, l'oxyHb privo di cellule purificate viene utilizzato per costruire la curva di calibrazione per il test (Figura supplementare 3).
La relazione dose-risposta tra Hb senza cellule (misurata con un test colorimetrico) e co.......
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Discussione
A causa dell'elevata sensibilità, i saggi basati sulla chemiluminescenza per la determinazione dell'NO e dei composti correlati hanno un alto rischio di contaminazione da NO2-. Ogni reagente (in particolare la soluzione che blocca l'NO2) e il diluente (incluso il ddH2O) utilizzati nell'esperimento devono essere testati per il suo contenuto di NO2- per correggere il segnale di fondo. Il nitrito è estremamente reattivo con un'emivita nel sangue in.......
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Dichiarazioni
L.B. riceve supporto salariale da K23 HL128882 / NHLBI NIH come ricercatore principale per il suo lavoro sull'emolisi e l'ossido nitrico. LB riceve sovvenzioni da "Fast Grants for COVID-19 research" presso il Mercatus Center della George Mason University e da iNO Therapeutics LLC. B.Y. è supportato da sovvenzioni di un NHLBI/#R21HL130956 e DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. ha ricevuto brevetti presso MGH sulla generazione elettrica di ossido nitrico.
L.B. e B.Y. hanno depositato la domanda di brevetto per NO delivery nel numero di domanda PCT della malattia COVID-19: PCT / US2021 / 036269 depositato il 7 giugno 2021. RWC riceve sostegno salariale da Unitaid come ricercatore principale per lo sviluppo tecnologico finalizzato alla diagnosi decentralizzata della tubercolosi nei bambini situati in contesti a basso consumo di risorse.
Ringraziamenti
I protocolli riportati in questo manoscritto sono stati resi possibili dai contributi accumulati di precedenti borsisti del laboratorio di ricerca sull'anestesia in terapia intensiva del Dr. Warren Zapol, Dipartimento di Anestesia presso il Massachusetts General Hospital. Riconosciamo il contributo dei dottori Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli ed Emanuele Rezoagli.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido acetico | Sigma | 45754 | 500 mL - liquido |
| Emulsione antischiuma B | Sigma | A5757 | 250 mL - liquido |
| DETA NONOate | Cayman | 82120 | 10 mg |
| Gibco DPBS (1x) senza calcio, senza magnesio | ThermoFisher | 14190144 | 500 mL |
| Acido cloridrico 37% (1 M) | Sigma | 258148 | 500 mL - liquido |
| Iodio | SAFC | 207772 | 100 g - solido |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | |
| Mercurio (II) Cloruro ACS reagente> 99,5% | Sigma | 215465 | 100 g - solido (sciogliere in acqua) |
| Sistema di purificazione dell'acqua Mili-Q | Millipore | ||
| Modello 705 RN 50 μ Siringa L | Hamilton | 80530 | Siringa da microlitro |
| Modello 802 N 25 μ L Siringa | Hamilton | 84854 | Siringa da microlitro |
| N-etilmaleimmide | Sigma | 4260 | 25 g - |
| Analizzatore di ossido nitrico cristallino + Bundle Software - Recipiente di spurgo | Zysense | NOA 280i | Rivelatore di chemiluminescenza |
| Nonidet p-40 (NP-40) | ThermoFisher | 85125 | 10% - 500 mL |
| Reagente ACS esacianoferrato di potassio (III)≥ 99% | Sigma | 244023 | 100 g - polvere |
| Reagente ACS ioduro di potassio> 99% | Sigma | 221945 | 100 g - |
| solido Nitrito di potassio. Per analisi EMSURE ACS | Supelco | 105067 | 250 g - cristallino |
| PowerGen 125 | Fisher Scientific | 14-359-251 | Omogeneizzatore meccanico |
| RV3 Pompa rotativa a palette a due stadi | Edwards | A65201906 | Pompa per vuoto - In bundle con l'analizzatore |
| Eparina di sodio - BD Hemogard Clo | BD Biosciences | BD367871 | 75 unità USP |
| Idrossido di sodio anidro Reagente ACS ≥ 97% | Sigma | 795429 | 1 kg - pellett |
| Nitrato di sodio ACS reagente ≥ 99% | Sigma | 221341 | 500 g - polvere |
| Nitrito di sodio ≥ 99% | Sigma | S2252 | 500 g - |
| Sulfanilamide cristallina ≥ 98% | Sigma | S9251 | 100 g - solido |
| Cloruro di Vanadio (III) | Sigma | 112393 | 25 g - solido - Attenzione (esotermico) |
| Whatman 1 Carta da filtro | Sigma | WHA10010155 |
Riferimenti
- Palmer, R. M. J., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
- Furchgott, R. F.
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Ristampe e permessi
