Summary

Protocollo economico ed efficiente per l'isolamento e la coltura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo da topi

Published: July 01, 2022
doi:
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Summary

Qui, presentiamo un metodo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo ad alta purezza dai topi dopo 7 giorni di coltura con 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.

Abstract

La domanda di cellule dendritiche (DC) sta gradualmente aumentando con l’avanzare della ricerca immunologica. Tuttavia, le DC sono rare in tutti i tessuti. Il metodo tradizionale per isolare le DC prevede principalmente l’induzione della differenziazione del midollo osseo (BM) nelle DC iniettando grandi dosi (>10 ng / mL) di fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi / interleuchina-4 (GM-CSF / IL-4), rendendo la procedura complessa e costosa. In questo protocollo, utilizzando tutte le cellule BM coltivate in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4, dopo 3-4 scambi di semicoltura, sono state raccolte fino a 2,7 x 107 cellule CD11c+ (DC) per topo (due femori) con una purezza dell’80%-95%. Dopo 10 giorni in coltura, l’espressione di CD11c, CD80 e MHC II è aumentata, mentre il numero di cellule è diminuito. Il numero di cellule ha raggiunto il picco dopo 7 giorni di coltura. Inoltre, questo metodo ha richiesto solo 10 minuti per raccogliere tutte le cellule del midollo osseo e un numero elevato di DC è stato ottenuto dopo 1 settimana di coltura.

Introduction

Le cellule dendritiche (DC) sono le più potenti cellule che presentano l’antigene (APC) per attivare le cellule T naïve e indurre risposte specifiche dei linfociti T citotossici (CTL) contro malattie infettive, malattie allergiche e cellule tumorali 1,2,3. Le DC sono il collegamento primario tra immunità innata e immunità adattativa e svolgono un ruolo essenziale nella difesa immunologica e nel mantenimento della tolleranza immunitaria. Negli ultimi 40 anni, molti ricercatori hanno cercato di definire i sottoinsiemi di DC e le loro funzioni nell’infiammazione e nell’immunità. Secondo questi studi, le DC si sviluppano lungo le linee mieloidi e linfoidi dalle cellule del midollo osseo. I vaccini contro i tumori hanno raggiunto traguardi significativi negli ultimi anni e hanno un futuro promettente. Meccanicamente, i vaccini tumorali modulano la risposta immunitaria e prevengono la crescita tumorale attivando i linfociti T citotossici utilizzando antigeni tumorali. Il vaccino a base di DC svolge un ruolo importante nell’immunoterapia tumorale ed è stato identificato come una delle terapie antitumorali più promettenti 1,4. Inoltre, i DC sono stati ampiamente utilizzati nella sperimentazione di nuovi farmaci a bersaglio molecolare e inibitori del checkpoint immunitario5.

I ricercatori hanno urgente bisogno di un numero elevato di DC ad alta purezza per studiare ulteriormente il ruolo dei DC. Tuttavia, le DC sono rare in vari tessuti e sangue, rappresentando solo l’1% delle cellule del sangue negli esseri umani e negli animali. La coltura in vitro di cellule dendritiche del midollo osseo (BMDC) è un metodo importante per ottenere grandi quantità di cellule DC. Nel frattempo, il protocollo Lutz per la generazione di DC dal midollo osseo è stato ampiamente utilizzato dai ricercatori6. Sebbene il protocollo sia efficace nell’ottenere cellule DC, è complesso e costoso, comportando l’aggiunta di alte concentrazioni di citochine e la lisi dei globuli rossi.

In questo studio, riportiamo un metodo per isolare quasi tutte le cellule del midollo osseo dal midollo osseo di topo (BM) e indurre la differenziazione in BMDC dopo 7-9 giorni di incubazione in vitro, con una concentrazione inferiore di GM-CSF e IL-4. Questa procedura richiede solo 10 minuti per raccogliere quasi tutte le cellule del midollo osseo e per sospenderle in un mezzo completo. In breve, forniamo un metodo di coltivazione efficiente ed economico per BMDC in questa ricerca.

Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la cura e l’uso degli animali dell’Università medica di Nanchino. 1. Isolamento del midollo osseo e preparazione delle cellule BM Sacrificare topi C57BL/6 (18-22 g, 6-8 settimane) tramite asfissia di CO2 . Fissare il mouse sul tavolo operatorio del mouse. Disinfettare le superfici con il 70% di etanolo. Tagliare la pelle della gamba per esporre i muscoli e l’arteria femorale. Blocca e strappa l’arteria femorale usando due pinze, quindi tira l’estremità prossimale verso l’addome.NOTA: Non tagliare direttamente l’arteria femorale. Altrimenti, causerà sanguinamento eccessivo e contaminerà il campo visivo. Taglia tutti i muscoli intorno al femore. Allungare lentamente gli arti inferiori del topo verso l’esterno fino a quando non si sente il suono della lussazione dell’articolazione dell’anca e il prolasso della testa del femore è visibile. Separare gli arti inferiori dal corpo usando le forbici lungo l’interno della testa del femore. Tagliare le zampe posteriori dall’estremità dell’articolazione del ginocchio per ottenere un femore libero e completo. Rimuovere i muscoli attaccati al femore usando una garza.NOTA: Non strappare direttamente i muscoli. Il femore dei topi è delicato, la sua integrità deve essere mantenuta. Immergere il femore in alcool al 75% per 2-5 minuti. 2. Cultura di induzione della BMDC Risciacquare l’alcol residuo con PBS. Utilizzare una pinza emostatica per bloccare la parte centrale e inferiore del femore e un altro set per bloccare l’estremità inferiore del femore. Le pinze emostatiche vengono applicate lateralmente al femore e il femore viene separato dalla linea epifisaria.NOTA: La linea epifisaria non è facilmente visibile fino a quando il femore non si frattura. Questo e i passaggi successivi vengono tutti eseguiti in un ambiente sterile. Utilizzare una siringa da 1 mL (ago: 0,6 mm x 25 mm) per penetrare nella cavità del midollo osseo dalla rottura della linea epifisaria e ruotare l’ago per penetrare nella testa del femore e attraverso la cavità del midollo osseo. Pulsare e lavare la cavità del midollo osseo utilizzando 1 mL del mezzo completo contenente GM-CSF / IL-4 fino a quando l’osso diventa bianco.NOTA: terreno di coltura completo: 10% FBS, 1% penicillina-streptomicina, 55 μM β-mercaptoetanolo, 10 ng/ mL GM-CSF e 10 ng / mL IL-4. Sospendere tutte le cellule in 24 mL di terreno di coltura completo (~5 x 105 cellule/mL). Dopo la miscelazione, tutto il mezzo è stato seminato su una piastra a 6 pozzetti con 4 ml / pozzetto, quindi incubato a 37 ° C con il 5% di CO2 per 2 giorni.NOTA: Non è necessario lisare gli eritrociti. Sostituire tutto il mezzo dopo 2 giorni con un mezzo contenente GM-CSF/IL-47. Al quarto, sesto e ottavo giorno, sostituire metà del mezzo con il mezzo completo contenente 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.NOTA: In questa fase, le cellule sospese come eritrociti e linfociti vengono rimosse. Scatta foto ogni giorno per registrare la crescita cellulare. A partire dal sesto giorno, raccogliere un pozzetto di cellule al giorno per contare il numero di cellule e rilevare l’espressione di CD11c, CD80 e MHC II 6,7. 3. Rilevazione citometrica a flusso dell’espressione di CD11c, CD80 e MHC II Dopo aver lavato i DC con PBS, risospendere 1 x 106 cellule in 100 μL di tampone FACS, aggiungere 0,5 μg di anticorpo CD16/32 anti-topo e incubare per 10 minuti sul ghiaccio per bloccare siti di antigene non specifici. Aggiungere 1 μg di Percp/cy5.5-CD11c, 0,5 μg di PE-CD80 e 0,04 μg di anticorpi APC-MHC II e incubare sul ghiaccio per 30 min. Centrifugare a 1.000 x g per 3 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante, aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4%, fissare per 30 minuti a 4 °C e sospendere in 300 μL di tampone FACS. Eseguire la citometria a flusso.

Representative Results

Le cellule 1 x 10 7-1,7 x 107 sono state estratte da due femori e sono state nuovamente sospese in 24 ml di terreno prima di essere piantate in una piastra a 6 pozzetti (Figura 1A). Dopo 2 giorni, le cellule non aderenti sono state rimosse cambiando completamente il terreno di coltura. Prima di cambiare il mezzo, è stato osservato un numero significativo di cellule sospese (Figura 1B). Dopo 3 giorni di coltura, iniziarono a formarsi coloni…

Discussion

Gli esseri umani e i topi hanno diversi sottoinsiemi dc, tra cui DC classici (cDC, inclusi cDC1 e cDC2s), DC plasmacitoidi (pDC) e DC derivati da monociti (MoDC)9,10,11. È generalmente accettato che i cDC1 regolano le risposte dei linfociti T citotossici (CTL) ai patogeni intracellulari e al cancro e i cDC2 regolano le risposte immunitarie a patogeni extracellulari, parassiti e allergeni12. Un numero sig…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dal Programma di Tianjin Science and Technology Plan (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 e TJWJ202021QN034).

Materials

β-Mercaptoethanol Solarbio M8211
6-well plate Corning 3516
APC-MHC II Biolegend 116417
FBS Gibco 10100
PE-CD80 Biolegend 104707
Penicillin-Streptomycin Solarbio P1400
Percp/cy5.5-CD11c Biolegend 117327
PRMI-1640 Thermo 11875093
Recombinant Mouse GM-CSF Solarbio P00184
Recombinant Mouse IL-4 Solarbio P00196
TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody Biolegend 156603

References

  1. Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
  2. Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
  3. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  4. Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
  5. Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).
  6. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  7. Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
  8. Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786 (2021).
  9. Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
  10. Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
  11. Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
  12. Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).
  13. Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
  14. Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
  15. Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
  16. Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
  17. Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
  18. Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
  19. Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle – An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).
  20. Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
  21. Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).

Play Video

Cite This Article
Tang, H., Xie, H., Wang, Z., Peng, S., Ni, W., Guo, L. Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice. J. Vis. Exp. (185), e63125, doi:10.3791/63125 (2022).

View Video