Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento di cellule endoteliali retiniche postnatali murine ottimizzate per la resa, la purezza e la vitalità delle cellule. Queste cellule sono adatte per approcci di sequenziamento di prossima generazione.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Isolamento di cellule endoteliali retiniche murine per il sequenziamento di nuova generazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
I recenti miglioramenti nel sequenziamento di prossima generazione hanno fatto progredire la conoscenza dei ricercatori sulla biologia molecolare e cellulare, con diversi studi che rivelano nuovi paradigmi nella biologia vascolare. L'applicazione di questi metodi a modelli di sviluppo vascolare richiede l'ottimizzazione delle tecniche di isolamento cellulare da tessuti embrionali e postnatali. La resa cellulare, la vitalità e la purezza devono essere tutte massime per ottenere risultati accurati e riproducibili dagli approcci di sequenziamento di prossima generazione. Il modello di vascolarizzazione retinica neonatale del topo viene utilizzato dai ricercatori per studiare i meccanismi dello sviluppo vascolare. I ricercatori hanno utilizzato questo modello per studiare i meccanismi dell'angiogenesi e la specifica del destino arterioso-venoso durante la formazione e la maturazione dei vasi sanguigni. L'applicazione di tecniche di sequenziamento di nuova generazione per studiare il modello di sviluppo vascolare retinico richiede l'ottimizzazione di un metodo per l'isolamento delle cellule endoteliali retiniche che massimizzi la resa, la vitalità e la purezza delle cellule. Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento, la digestione e la purificazione del tessuto retinico murino utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). I risultati indicano che la popolazione di cellule endoteliali CD31+/CD45- purificata da FACS è altamente arricchita per l'espressione genica delle cellule endoteliali e non mostra alcun cambiamento nella vitalità per 60 minuti post-FACS. Sono inclusi risultati rappresentativi degli approcci di sequenziamento di nuova generazione su cellule endoteliali isolate con questo metodo, tra cui il sequenziamento dell'RNA di massa e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula, dimostrando che questo metodo per l'isolamento delle cellule endoteliali retiniche è compatibile con le applicazioni di sequenziamento di prossima generazione. Questo metodo di isolamento delle cellule endoteliali retiniche consentirà tecniche avanzate di sequenziamento per rivelare nuovi meccanismi di sviluppo vascolare.
Introduzione
L'elevata capacità di sequenziamento degli acidi nucleici tramite approcci di sequenziamento di nuova generazione ha notevolmente migliorato la conoscenza dei ricercatori sulla biologia molecolare e cellulare. Queste tecniche avanzate includono il sequenziamento dell'RNA dell'intero trascrittoma, il sequenziamento del DNA di regioni mirate per identificare i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), il sequenziamento del DNA dei fattori di trascrizione legati nel sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) o le regioni aperte della cromatina nel sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi (ATAC) e il sequenziamento dell'RNA a....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
I comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Yale e dell'Università della Virginia hanno approvato tutti gli esperimenti sugli animali elencati in questo protocollo.
1. Ottenere occhi di topo per l'isolamento della retina
- Preparare 1x PBS ghiacciato e aggiungere 500 μL a ciascun pozzetto di una piastra da 48 pozzetti.
- Eutanasia dei topi neonatali al sesto giorno postnatale (P6) secondo le linee guida istituzionali approvate. Per questo esperimento, cucciolate di circa 4-8 topi neonatali vengono eutanasizzati a P6 tramite inalazione di isoflurano per almeno tre mi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La digestione del tessuto retinico e l'immunocolorazione per CD31 e CD45 si traducono in una popolazione identificabile di cellule endoteliali CD31+/CD45- dopo il gating per cellule, singole cellule e vitalità (Figura 2A). L'immunocolorazione CD45 è necessaria per eliminare le cellule CD31+/CD45+, che includono piastrine e alcuni leucociti21. I controlli devono essere eseguiti per ogni esperimento per mostrare la specificità degli anticorpi e guidare la strategia di g.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento delle cellule endoteliali dal tessuto retinico murino postnatale che è stato ottimizzato per un elevato numero di cellule, purezza e vitalità. La purezza cellulare è ottenuta mediante isolamento FACS di popolazioni di cellule endoteliali dalla sospensione monocellulare digerita mediante immunocolorazione CD31+/CD45-. La qualità dell'isolamento è quantificata nei saggi per la vitalità mediante colorazione blu di Trypan ed espressione genica mediante qPCR per CD31, CD45.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno divulgazioni rilevanti.
Ringraziamenti
Grazie alla Yale Flow Cytometry Facility, alla University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, allo Yale Center for Genomic Analysis e alla University of Virginia Genome Analysis and Technology Core per il loro impegno, competenza e consulenza nel contribuire agli esperimenti presentati. Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni NIH a N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) e K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2 ml di Eppendorf provette con chiusura di sicurezza | USA Scientific | 4036-3352 | |
| 5 ml Provette Falcon con filtro cellulare Tappo a scatto | Corning | 352235 | |
| 60 mm Piatto di coltura non trattato | TC Corning | 430589 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Controllo degli isotipi | BD Biosciences | 553932 | |
| BD FACSChorus Software | BD Biosciences | FACSCHORUS | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | FACSMELODY | |
| Collagenasi di tipo II | Sigma-Aldrich | 234115 | |
| Costar Piastre a pozzetti multipli trasparenti a 48 pozzetti trattate con TC, confezionate singolarmente, sterili | Corning | 3548 | |
| D-Glucose | Gibco | A2494001 | |
| Pipette monouso a trasferimento graduato | Fisher Scientific | 12-711-9AM | |
| Vaschetta di dissezione Cera | Carolina | 629100 | |
| Forbici da dissezione | Strumenti per scienze | 14085-08 | |
| Stereomicroscopio da dissezione M165 FC | Leica | M165FC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-052 | |
| Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Eppendorf Provette flessibili Provette per microcentrifuga 1,5 mL | Sigma-Aldrich | 22364120 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Pinze per dissezione fine | Strumenti per scienze fini | 11250-00 | |
| Soluzione salina tamponata di Hank (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630130 | |
| iScript cDNA Kit di sintesi | Bio-Rad | 1708890 | |
| isoflurano, USP | Covetrus | 11695067772 | |
| Isotemp Bagnomaria Deluxe per uso generico | Fisher Scientific | FSGPD20 | |
| Primer: ActB_Forward: 5'- agagggaaatcgtgcgtgac -3' | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: ActB_Reverse: 5'- caatagtgatgacctggccgt -3' | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Forward: 5'- gagcccaatcacgtttcagttt -3' | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Reverse: 5'- tccttcctgcttcttgctagct -3' | Tecnologie DNA integrate | N/A | |
| Primer: CD45_Forward: 5'- gggttgttctgtgccttgtt -3' | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Reverse: 5'- ctggacggacacagttagca -3' | Tecnologie del DNA integrate | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Forward: 5'- tcctctgcatcctcactatcaca -3' | Tecnologie del DNA integrate | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5'- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3' | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Ioduro di propidio | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Centrifuga Sorvall Legend Micro 21R, refrigerata | ThermoFisher | 75002477 | |
| SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5120 | |
| Soluzione blu di tripano | ThermoFisher | 15250061 | |
| V450 Rat Anti-Mouse CD45 | BD Biosciences | 560501 | |
| V450 Rat IgG2b, κ Controllo degli isotipi | BD Biosciences | 560457 |
Riferimenti
- Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59(2018).
- Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine<....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
