Articolo metodologico

Misurazione della dinamica di protrusione del bordo cellulare durante la diffusione utilizzando la microscopia a cellule vive

DOI:

10.3791/63157

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1 novembre 2021

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1The Azrieli Faculty of Medicine, Bar-Ilan University, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Neuroscience, Yale University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo ha lo scopo di misurare i parametri dinamici (protrusioni, retrazioni, volant) delle sporgenze ai margini delle celle di diffusione.

Abstract

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Lo sviluppo e l'omeostasi degli organismi multicellulari si basano sulla regolazione coordinata della migrazione cellulare. La migrazione cellulare è un evento essenziale nella costruzione e nella rigenerazione dei tessuti ed è fondamentale per lo sviluppo embrionale, le risposte immunologiche e la guarigione delle ferite. La disregolazione della motilità cellulare contribuisce a disturbi patologici, come l'infiammazione cronica e le metastasi del cancro. La migrazione cellulare, l'invasione tissutale, l'assone e la crescita del dendrite iniziano tutti con sporgenze del bordo cellulare mediate dalla polimerizzazione dell'actina. Qui, descriviamo un metodo semplice, efficiente e che consente di risparmiare tempo per l'imaging e l'analisi quantitativa delle dinamiche di protrusione del bordo cellulare durante la diffusione. Questo metodo misura le caratteristiche discrete della dinamica della membrana del bordo cellulare, come sporgenze, retrazioni e volant, e può essere utilizzato per valutare come le manipolazioni dei regolatori di actina chiave influenzano le sporgenze del bordo cellulare in diversi contesti.

Introduzione

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La migrazione cellulare è un processo critico che controlla lo sviluppo e la funzione di tutti gli organismi viventi. La migrazione cellulare avviene sia in condizioni fisiologiche, come l'embriogenesi, la guarigione delle ferite e la risposta immunitaria, sia in condizioni patologiche, come metastasi tumorali e malattie autoimmuni. Nonostante le differenze nei tipi di cellule che prendono parte a diversi eventi migratori, tutti gli eventi di motilità cellulare condividono meccanismi molecolari simili, che sono stati conservati nell'evoluzione dai protozoi ai mammiferi e coinvolgono meccanismi di controllo citoscheletrico comuni in grado di rilevare l'ambiente, rispon....

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Protocollo

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Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università Bar-Ilan.

Nota : nella Figura 1 viene visualizzata una rappresentazione grafica dettagliata della procedura descritta in questa sezione.

1. Coltura cellulare

NOTA: Le cellule utilizzate nel protocollo sono fibroblasti embrionali di topo (MEF) che sono stati generati da embrioni E11.5-13.5 di topi C57BL/6 wild-type. I MEF primari sono stati generati secondo il protocollo di laboratorio

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Risultati

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Nell'esperimento descritto nella Figura 2, i MEF immortalizzati sono stati placcati su piatti con fondo di vetro pre-rivestiti con fibronectina per attivare la segnalazione mediata dall'integrina, bloccata dalla BSA denaturata, per bloccare i siti potenziali liberi per l'adesione cellulare che non dipende dall'attivazione dell'integrina. Per raggiungere la fase di crescita logaritmica al 70%-80% di confluenza delle cellule il giorno dell'esperimento, 0,7 x 106 MEF sono stati placc.......

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Discussione

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La dinamica di protrusione del bordo cellulare, composta da protrusioni, retrazioni e volant, è sia un prerequisito che un potenziale evento limitante la velocità nella motilità cellulare. Qui descriviamo un metodo rapido e semplice per misurare la dinamica delle sporgenze del bordo cellulare durante la diffusione. Questo metodo consente l'imaging a breve termine, genera una quantità significativa di dati, non richiede l'etichettatura fluorescente delle cellule o costose apparecchiature di microscopia fluorescente e potr.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da divulgare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH MH115939, NS112121, NS105640 e R56MH122449-01A1 (ad Anthony J. Koleske) e dalla Israel Science Foundation (sovvenzioni numero 1462/17 e 2142/21) (a Hava Gil-Henn).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre per colture cellulari da 10 cmGreinerP7612-360EA
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA7906
Dulbecco' s modificato Eagle medium (DMEM)Biological Industries, Israel01-055-1AMedium contiene glucosio alto (4,5 g/L D-glucosio)
Dulbecco' s soluzione salina tamponata con fosfato (1xDPBS)Biological Industries, Israel02-023-1A
Siero fetale bovino (FBS)Biological Industries, Israel04-001-1A
Fibronectina da plasma umano, liquido, 0,1%, adatto per colture cellulariSigma-AldrichF0895
Piastre con fondo in vetroCellvisD35-20-1.5-NPiatto inferiore in vetro da 35 mm, piatto da 35 mm, pozzetto da 20 mm, vetro di copertura #1,5 (0,16-0,19 mm).
Software ImageJNIHFeely disponibile all'indirizzo:
https://imagej.nih.gov/ij/download.html LAS-AF Leica Application Suite 3.2Software di acquisizione per microscopio dotato di un CMOS digitale ORCA-Flash 4.0 V2
Leica AF6000LeicaMicroscopio a campo chiaro invertito (40x, NA 1.3 ) dotato di ottica a contrasto di fase, un incubatore e un'unità CO2 con software di acquisizione LAS AF dotato di un Fotocamera digitale CMOS ORCA-Flash 4.0 V2 .
Soluzione di L-glutamminaBiological Industries, Israele03-020-1B
Fotocamera CMOS digitale ORCA-Flash 4.0 V2Hamamatsu Photonics
Soluzione di penicillina-streptomicinaBiological Industries, Israele03-031-1B
Soluzione di tripsina-EDTA B (0,25%), EDTA (0,05%)Biological Industries, Israele03-052-1A

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kurosaka, S., Kashina, A. Cell biology of embryonic migration. Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).
  2. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112<....

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Migrazione cellulareSpandimento cellulareAnalisi chimograficaPolimerizzazione dell actinaDinamica di membranaMotilit cellulareMicroscopia a contrasto di faseDinamica del citoscheletro

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