Questo protocollo ha lo scopo di misurare i parametri dinamici (protrusioni, retrazioni, volant) delle sporgenze ai margini delle celle di diffusione.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Misurazione della dinamica di protrusione del bordo cellulare durante la diffusione utilizzando la microscopia a cellule vive
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo sviluppo e l'omeostasi degli organismi multicellulari si basano sulla regolazione coordinata della migrazione cellulare. La migrazione cellulare è un evento essenziale nella costruzione e nella rigenerazione dei tessuti ed è fondamentale per lo sviluppo embrionale, le risposte immunologiche e la guarigione delle ferite. La disregolazione della motilità cellulare contribuisce a disturbi patologici, come l'infiammazione cronica e le metastasi del cancro. La migrazione cellulare, l'invasione tissutale, l'assone e la crescita del dendrite iniziano tutti con sporgenze del bordo cellulare mediate dalla polimerizzazione dell'actina. Qui, descriviamo un metodo semplice, efficiente e che consente di risparmiare tempo per l'imaging e l'analisi quantitativa delle dinamiche di protrusione del bordo cellulare durante la diffusione. Questo metodo misura le caratteristiche discrete della dinamica della membrana del bordo cellulare, come sporgenze, retrazioni e volant, e può essere utilizzato per valutare come le manipolazioni dei regolatori di actina chiave influenzano le sporgenze del bordo cellulare in diversi contesti.
Introduzione
La migrazione cellulare è un processo critico che controlla lo sviluppo e la funzione di tutti gli organismi viventi. La migrazione cellulare avviene sia in condizioni fisiologiche, come l'embriogenesi, la guarigione delle ferite e la risposta immunitaria, sia in condizioni patologiche, come metastasi tumorali e malattie autoimmuni. Nonostante le differenze nei tipi di cellule che prendono parte a diversi eventi migratori, tutti gli eventi di motilità cellulare condividono meccanismi molecolari simili, che sono stati conservati nell'evoluzione dai protozoi ai mammiferi e coinvolgono meccanismi di controllo citoscheletrico comuni in grado di rilevare l'ambiente, rispon....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università Bar-Ilan.
Nota : nella Figura 1 viene visualizzata una rappresentazione grafica dettagliata della procedura descritta in questa sezione.
1. Coltura cellulare
NOTA: Le cellule utilizzate nel protocollo sono fibroblasti embrionali di topo (MEF) che sono stati generati da embrioni E11.5-13.5 di topi C57BL/6 wild-type. I MEF primari sono stati generati secondo il protocollo di laboratorio
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Nell'esperimento descritto nella Figura 2, i MEF immortalizzati sono stati placcati su piatti con fondo di vetro pre-rivestiti con fibronectina per attivare la segnalazione mediata dall'integrina, bloccata dalla BSA denaturata, per bloccare i siti potenziali liberi per l'adesione cellulare che non dipende dall'attivazione dell'integrina. Per raggiungere la fase di crescita logaritmica al 70%-80% di confluenza delle cellule il giorno dell'esperimento, 0,7 x 106 MEF sono stati placc.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La dinamica di protrusione del bordo cellulare, composta da protrusioni, retrazioni e volant, è sia un prerequisito che un potenziale evento limitante la velocità nella motilità cellulare. Qui descriviamo un metodo rapido e semplice per misurare la dinamica delle sporgenze del bordo cellulare durante la diffusione. Questo metodo consente l'imaging a breve termine, genera una quantità significativa di dati, non richiede l'etichettatura fluorescente delle cellule o costose apparecchiature di microscopia fluorescente e potr.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH MH115939, NS112121, NS105640 e R56MH122449-01A1 (ad Anthony J. Koleske) e dalla Israel Science Foundation (sovvenzioni numero 1462/17 e 2142/21) (a Hava Gil-Henn).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre per colture cellulari da 10 cm | Greiner | P7612-360EA | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco' s modificato Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contiene glucosio alto (4,5 g/L D-glucosio) |
| Dulbecco' s soluzione salina tamponata con fosfato (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectina da plasma umano, liquido, 0,1%, adatto per colture cellulari | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Piastre con fondo in vetro | Cellvis | D35-20-1.5-N | Piatto inferiore in vetro da 35 mm, piatto da 35 mm, pozzetto da 20 mm, vetro di copertura #1,5 (0,16-0,19 mm). |
| Software ImageJ | NIH | Feely disponibile all'indirizzo: | |
| https://imagej.nih.gov/ij/download.html LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Software di acquisizione per microscopio dotato di un CMOS digitale ORCA-Flash 4.0 V2 | ||
| Leica AF6000 | Leica | Microscopio a campo chiaro invertito (40x, NA 1.3 ) dotato di ottica a contrasto di fase, un incubatore e un'unità CO2 con software di acquisizione LAS AF dotato di un Fotocamera digitale CMOS ORCA-Flash 4.0 V2 . | |
| Soluzione di L-glutammina | Biological Industries, Israele | 03-020-1B | |
| Fotocamera CMOS digitale ORCA-Flash 4.0 V2 | Hamamatsu Photonics | ||
| Soluzione di penicillina-streptomicina | Biological Industries, Israele | 03-031-1B | |
| Soluzione di tripsina-EDTA B (0,25%), EDTA (0,05%) | Biological Industries, Israele | 03-052-1A |
Riferimenti
- Kurosaka, S., Kashina, A. Cell biology of embryonic migration. Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112<....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
