Un modello di roditore dell'operazione di Ross: impianto di innesto di arteria polmonare singenica in una posizione sistemica

La stenosi congenita della valvola aortica è un sottogruppo di cardiopatia congenita caratterizzata da un'ostruzione del tratto ventricolare sinistro in cui la lesione si trova a livello valvolare. La malformazione colpisce circa 0,04-0,38 per 1000 nati ^vivi1.

Le opzioni disponibili per la correzione sono molte, ognuna con i suoi vantaggi e svantaggi. Per i pazienti idonei a una correzione biventricolare2, l'approccio può essere finalizzato alla riparazione valvolare (valvulotomia percutanea o chirurgica) o alla sua ^{sostituzione3}. Quest'ultimo è preferito quando la valvola aortica è considerata irrecuperabile; tuttavia, le opzioni disponibili sono limitate per i pazienti pediatrici. Infatti, le valvole bioprotesiche non sono indicate per la sostituzione aortica nella popolazione giovane a causa della loro calcificazione ^precoce4. D'altra parte, la degenerazione nelle valvole meccaniche è considerevolmente più lenta, ma queste richiedono una terapia anticoagulante per tutta la ^vita5. Inoltre, la principale limitazione di queste protesi è rappresentata dalla mancanza di potenziale di crescita, che predispone i pazienti a ulteriori reinterventi.

Un'opzione terapeutica interessante nella popolazione pediatrica è il trasferimento dell'autotrapianto polmonare nella posizione aortica denominata "operazione di Ross". In questo caso, la valvola polmonare viene quindi sostituita con un omoinnesto (Figura 1)⁶. Questa procedura può rappresentare la migliore scelta chirurgica per i bambini perché l'autoinnesto polmonare preserva il suo potenziale di crescita e non comporta i rischi della terapia anticoagulante per tutta la vita. Inoltre, la procedura di Ross può essere di grande valore anche nei giovani adulti per evitare una valvola meccanica o biologica, avendo il potenziale per diventare la migliore soluzione chirurgica.

I risultati dopo la sostituzione della valvola aortica con autoinnesto polmonare sono eccellenti, con una sopravvivenza superiore al 98% e buoni risultati a lungo ^termine7. Studi di letteratura riportano il 93% e il 90% di libertà dalla sostituzione dell'omotrapianto polmonare rispettivamente a 4 e 12 ^anni8.

Il principale limite di questa procedura è la tendenza dell'autoinnesto a dilatarsi a lungo termine, specialmente se impiegato come sostituto della radice indipendente. Ciò può causare incompetenza valvolare che può richiedere un nuovo intervento. In effetti, lo studio di follow-up più lungo eseguito finora riporta l'assenza di reintervento per la sostituzione dell'autotrapianto dell'88% a 10 anni e del 75% a 20 ^anni9.

La possibilità di ricreare un'operazione di Ross in ambito sperimentale rappresenta un prerequisito fondamentale per indagare il meccanismo alla base dell'adattamento dell'autoinnesto polmonare alle pressioni sistemiche. Diversi modelli sono stati proposti in passato. Tuttavia, questi sono solitamente limitati a esperimenti ex-vivo o modelli animali in vivo con animali di grandi dimensioni relativamente costosi. In questo studio, abbiamo cercato di stabilire un modello di roditore di impianto di innesto di arteria polmonare (PAG) in posizione sistemica, come radice indipendente.

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la Cura degli Animali dell'Università di Padova (OPBA, numero di protocollo n° 55/2017) e autorizzate dal Ministero della Salute italiano (Autorizzazione n° 700/2018-PR), in conformità alla Direttiva dell'Unione Europea 2010/63/UE e alla Legge Italiana 26/2014 per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio.

1. Cura degli animali e modello sperimentale

1. Assicurarsi che tutti i ratti Lewis siano ottenuti da un'unica azienda (Tabella dei materiali). Mantenere i ratti in strutture convenzionali con libero accesso a cibo e acqua.
2. Assicurarsi che il peso dei ratti varia da 320-400 g per il gruppo ricevente e 200-250 g per il gruppo donatore.

2. Protocollo preoperatorio

NOTA: tutte le operazioni devono essere eseguite in condizioni pulite. Utilizzare ratti Lewis adulti maschi e femmine come riceventi e donatori per eseguire un trapianto singenico.

1. Eseguire un'iniezione intraperitoneale di tramadolo (5 mg / kg) 15 minuti prima dell'intervento chirurgico.
2. Somministrare una singola dose di Gentamicina intramuscolare (5 mg/kg) immediatamente prima dell'intervento chirurgico.
3. Per l'induzione dell'anestesia, fornire il 4% di sevoflurano in 1 L/min di ossigeno a una camera di poli(metilmetacrilato) dove è collocato l'animale. Per il mantenimento dell'anestesia, utilizzare il 2,0-2,5% di sevoflurano in 1 L / min di ossigeno durante la procedura.
4. Rasare l'animale lungo la linea mediana per 2 cm di larghezza dallo sterno a 1 cm sopra l'area genitale con un rasoio. Quindi, sterilizzare la pelle con una soluzione di iodio.
5. Per evitare che l'animale si bagni e per evitare la dispersione del calore durante l'intervento chirurgico, coprire l'animale con un film plastico trasparente.
6. Valutare il livello di anestesia prima di eseguire la procedura valutando l'assenza di risposta a uno stimolo nocivo.

3. Operazione del donatore

1. Preparazione animale e cuore:
   1. Posizionare l'animale anestetizzato su un vassoio di sughero con il lato caudale rivolto verso il chirurgo. Eseguire un'incisione xifo-pubica di circa 5-6 cm e ritrarre lateralmente i due lembi muscolocutanei.
   2. Somministrare un volume di 1 mL di soluzione salina a 4 °C contenente 500 UI di eparina attraverso la vena cava addominale.
   3. Dopo 1 minuto, tagliare il diaframma da sinistra a destra ed eseguire una toracotomia anteriore per esporre il cuore.
   4. Raffreddare il cuore pulsante gocciolando soluzione salina a 4 °C.
   5. Eseguire una pericardiectomia e una timectomia al fine di ottenere una visione completa dell'arco aortico. Rimuovere i tessuti adiposi rimanenti che circondano l'aorta.
   6. Tagliato ad arco, appena sopra l'origine dell'arteria innominata; tagliare anche quest'ultimo.
   7. Tagliare la vena cava toracica inferiore (IVC) e inserire una cannula da 22 G per infondere al cuore 20-25 ml di soluzione salina a 4 °C, esercitando una leggera pressione. Interrompere la perfusione quando il cuore smette di battere e il flusso dall'aorta diventa chiaro.
2. Espianto PAG:
   NOTA: Una raccolta accurata e una delicata manipolazione del PAG sono obbligatorie per ottenere un impianto ottimale nel ricevente. Non toccarlo direttamente con gli strumenti, usa invece tamponi di cotone.
   1. Eseguire uno studio ecografico per valutare il diametro del PA nella sua posizione nativa.
   2. Inserire un micro-pinza sotto la parete posteriore del vaso e tagliare quest'ultimo utilizzando una microforbice il più vicino possibile alla sua biforcazione per massimizzare la lunghezza del PAG.
   3. Tenere delicatamente il PA con la microforza ad anello e separarlo dal ventricolo destro con le forbici a micro-molla. Raccogli il PAG, incluso un po 'di muscolo ventricolare destro.
3. Preparazione PAG:
   1. Posizionare il PAG su una garza inumidita con soluzione salina fredda sul tavolo operatorio e ispezionare il recipiente al microscopio operatorio.
   2. Tagliare qualsiasi abbondante tessuto circostante, lasciando solo 1 mm di muscolo ventricolare. Impostare la lunghezza della nave a 5 mm.

4. Impianto di innesto di arteria polmonare (PAG)

1. Preparazione dell'animale ricevente:
   1. Posizionare l'animale anestetizzato su un vassoio di sughero con il lato caudale rivolto verso il chirurgo.
   2. Eseguire un'incisione longitudinale mediana e utilizzare due mini riavvolgitori per mantenere aperto l'addome.
   3. Estrarre l'intestino con due tamponi di cotone e coprirlo con una garza imbevuta di soluzione salina a 39 °C che consente la visualizzazione dell'area retroperitoneale con esposizione dell'aorta addominale infra-renale (AA).
      NOTA: Durante l'intervento chirurgico, è importante inumidire occasionalmente l'intestino utilizzando una siringa contenente soluzione salina a 39 °C per prevenire l'ipotermia, una condizione critica comune nei roditori.
   4. Rimuovere il peritoneo parietale posteriore tra le due arterie renali e la biforcazione iliaca usando due tamponi di cotone e rimuovere il tessuto adiposo intorno all'AA infrarenale. Lasciare solo una piccola porzione di grasso sopra l'AA, per facilitare la manipolazione sulla nave.
   5. Separare l'AA dall'IVC. Per eseguire questa procedura, in primo luogo, passare una pinza curva dietro la parete aortica posteriore e utilizzarla per aprire un passaggio tra AA e IVC. Quindi, utilizzare una sutura di seta 2-0 per creare un anello attorno all'AA, al fine di sollevare la nave e separare l'AA dall'IVC. Ligare qualsiasi arteria lombare derivante dall'AA infrarenale con sutura di seta 6/0 e dividerla.
   6. Ruotare l'animale di 90° in senso antiorario, posizionando la testa sul lato sinistro dell'operatore. L'AA ora giaceva orizzontalmente nel campo microscopico.
   7. Utilizzare due clip Yasargil per bloccare l'AA infrarenale e posizionarle a una distanza di 1,5 cm l'una dall'altra. Eseguite il transetto dell'AA nel punto medio tra le due clip.
   8. Irrigare le due estremità dei vasi con eparina (1 UI/mL) in soluzione salina per rimuovere eventuali coaguli. Rimuovere eventuali detriti avventiziali dalle navi.
2. Impianto PAG:
   1. Posizionare il PAG tra le due estremità, con l'estremità ventricolare verso la porzione cranica dell'animale.
   2. Utilizzare una sutura in polipropilene 10-0 per eseguire due punti singoli di riferimento che collegano il PG all'AA. Eseguire la procedura su entrambe le estremità del PAG posizionando la sutura sui lati opposti della circonferenza del vaso.
   3. Eseguire un'anastomosi end-to-end tra PAG e AA, iniziando con l'estremità distale. Utilizzare una delle due estremità della sutura di riferimento distale per l'anastomosi posteriore utilizzando una sequenza da destinatario a innesto out-in/in-out per eseguire una sutura in esecuzione di circa sei punti.
   4. Una volta che la sutura raggiunge il punto di riferimento prossimale, eseguire un doppio mezzo intoppo completato da un nodo quadrato usando la sutura e una delle due estremità della sutura del punto di riferimento prossimale. Applicare pinze per zanzare in gomma alle suture per fornire trazione.
   5. Eseguire la stessa anastomosi sulla parete anteriore. Eseguire l'intera procedura all'estremità prossimale del PAG. Prestare particolare attenzione quando si esegue l'anastomosi prossimale per evitare di includere qualsiasi foglietto illustrativo nella linea di sutura.
   6. Rilasciare prima la clip distale per lasciare che il PAG sia riempito di sangue retrogrado (flusso a bassa pressione) al fine di controllare l'anastomosi. Ripara qualsiasi perdita di sangue con una singola sutura. Una volta valutata l'anastomosi distale, eseguire la stessa procedura all'estremità prossimale.
3. Fasi finali dell'operazione sul destinatario:
   1. Valutare la pervietà del PAG e applicare due strisce di spugna di gelatina sulle linee di sutura su entrambi i lati del PAG (se necessario). Esercitare una leggera pressione per alcuni secondi con due tamponi di cotone per aiutare l'emostasi.
   2. Spostare l'intestino nella cavità addominale e chiudere le pareti con una sutura corrente in polipropilene 4/0.

5. Procedura operata da Sham

1. Eseguire una preparazione identica dell'animale come precedentemente illustrato per i ratti riceventi.
2. Tagliare l'AA infra-renale, a metà strada tra l'origine delle arterie renali e iliache.
3. Riapprossimare le due estremità dell'AA utilizzando un'anastomosi end-to-end, come descritto in precedenza. Rimuovere le due clip ed eseguire una procedura di emostasi accurata.
4. Riposizionare l'intestino e chiudere la parete addominale a strati, come per gli animali riceventi.

6. Assistenza postoperatoria e follow-up

1. Somministrare una soluzione salina calda (5 ml) nel tessuto sottocutaneo della schiena dell'animale per l'idratazione. Posizionare il topo sotto una lampada riscaldante e monitorarlo visivamente fino al risveglio, che di solito richiede fino a 5 minuti dopo l'arresto dell'anestesia. Collocare l'animale in una gabbia a una temperatura ambiente di 22-24 °C, con accesso immediato e illimitato al cibo e all'acqua.
2. Somministrare tramadolo intramuscolare (5 mg/kg) per l'analgesia postoperatoria due volte al giorno per le prime 48 ore dopo l'intervento chirurgico. Successivamente, monitorare lo stato di salute del ricevente e il peso corporeo ogni giorno, su base regolare.
3. Follow-up: Durante il follow-up, eseguire studi ecografici seriati a una settimana, un mese e due mesi per valutare la funzione PAG. Durante questi studi, misurare il diametro del vaso, la velocità sistolica di picco (PSV) e la velocità diastolica finale. Misurare questi parametri all'interno del PAG e a livello di AA prossimale e distale.
4. Eutanasizzare gli animali dopo due mesi di follow-up mediante applicazione di _CO2 per alcuni minuti, e poi espiantare il PAG, che sarà sottoposto ad analisi istopatologica.

Un totale di 39 ratti Lewis adulti sono stati inclusi in questo studio: 17 animali sono stati utilizzati come donatori di PAG, 17 animali come riceventi e 5 come finti (gruppo di controllo) (Tabella 1). I ratti maschi erano 22 (56%) e le femmine 17 (44%); questi ultimi sono stati utilizzati solo nel gruppo dei donatori.

Nessun evento fatale si è verificato durante l'operazione con una sopravvivenza del 100%. Durante il follow-up, due animali del gruppo di trapianto hanno avuto un esito fatale, rispettivamente a 12 e 51 giorni; il tasso di sopravvivenza alla fine dello studio era del 91% (Tabella 1).

Il peso mediano dei ratti era di 387 g (intervallo interquartile, QIR, 358-394 g) per il gruppo ricevente e di 328 g (IQR=304-337 g) per il gruppo donatore. A una settimana dall'intervento, il peso mediano era di 363 g (IQR = 350-376 g) con una diminuzione del 6% rispetto al peso preoperatorio. Gli animali hanno riacquistato il loro peso entro il primo mese di follow-up (mediana 387 g, IQR 369-392 g), con un peso finale a due mesi di 397 g (IQR = 391-402 g) (Figura 2).

Il tempo mediano di follow-up è stato di 62,5 giorni (IQR = 60-68 giorni) nel gruppo trapianto e 62 giorni (IQR = 61-67 giorni) nel gruppo sham-operated (p = 0,68).

Il diametro mediano preoperatorio del PA nella sua posizione nativa era di 3,20 mm (IQR = 3,18-3,23 mm). Il diametro mediano del PAG era di 4,03 mm (IQR = 3,74-4,13 mm) a una settimana, 4,07 mm (IQR = 3,80-4,28 mm) a un mese e 4,27 mm (IQR = 3,90-4,35 mm) a due mesi (Figura 3A). Si tratta di un aumento del 25,9%, 27,2% e 33,5% rispetto al diametro in posizione nativa, rispettivamente. L'aumento del diametro è stato significativamente diverso quando si confronta il valore nella posizione nativa e il valore a una settimana (p = 0,003), mentre nessun aumento significativo è stato trovato durante i seguenti studi. Il diametro dell'aorta nel gruppo azionato da sham era di 1,41 mm (IQR = 1,35-1,62 mm) a una settimana e 1,41 mm (IQR = 1,29-1,70 mm) a due mesi. Il PSV mediano al livello del PAG era di 220,07 mm/s (IQR=210,43-246,41 mm/s) a una settimana, 430,88 mm/s (IQR=375,28-495,56 mm/s) a un mese e 373,68 mm/s (IQR=305,78-429,81 mm/s) a due mesi. Rispetto al gruppo sham-operated, è stata riscontrata una differenza significativa nel PSV a una settimana (mediana 419,12 mm/s, IQR=408,42-561,32 mm/s; p<0,001), mentre nessuna differenza è stata trovata alla fine dello studio (392,92 mm/s, IQR=305,89-514,27 mm/s; p=0,5) (Figura 3B).

Alla fine dello studio, l'analisi istologica non ha mostrato segni di trombosi endoteliale e la calcificazione della parete non era significativa nella maggior parte dei casi (Figura 4).

Figura 1: Immagine rappresentativa dell'operazione Ross. La foto mostra le fasi dell'operazione Ross. A) valvola aortica ed espianto radicale; (B) Trasposizione dell'autotrapianto dell'arteria polmonare in posizione aortica; (C) Sostituzione dell'autoinnesto dell'arteria polmonare con un omoinnesto. A: valvola aortica e radice; H: omoinnesto; P: valvola polmonare e radice. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Decorso temporale del peso corporeo nel gruppo trapiantato. Il grafico mostra il decorso nel tempo del peso del ratto nel gruppo di trapianto. I valori sono espressi come intervallo mediano e interquartile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Variazione del diametro e della velocità sistolica di picco nell'innesto dell'arteria polmonare. I grafici mostrano la variazione del diametro (A) e della velocità sistolica di picco (B) all'interno dell'innesto dell'arteria polmonare durante le valutazioni ecografiche seriate. I valori sono espressi come intervallo mediano e interquartile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Valutazione microscopica del PAG. L'immagine mostra il PAG dopo l'espianto (A). B) valutazione radiografica; (C) Colorazione di ematossilina ed eosina, ingrandimento originale 12,5x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Caratteristiche e risultati dello studio. *I valori sono espressi come intervallo mediano e interquartile.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.