Caratterizzazione delle cellule endoteliali di escrescenza del sangue (BOEC) dal sangue periferico suino

L'endotelio è una struttura altamente complessa e dinamica e una componente vitale della parete vascolare. Allinea la superficie interna dei vasi sanguigni per fornire un'interfaccia fisica tra il sangue circolante e i tessuti circostanti. Questa struttura eterogenea è nota per svolgere varie funzioni come l'angiogenesi, l'infiammazione, la vasoregolazione e l'emostasi 1,2,3,4. Le cellule endoteliali della vena ombelicale umana sono un tipo di cellula ampiamente studiato per valutare la funzionalità delle cellule endoteliali. Tuttavia, la variabilità del lotto specifico del paziente, il fenotipo incoerente e l'efficienza minima di scissione suggeriscono la necessità di determinare una fonte cellulare che potrebbe migliorare tutte queste caratteristiche⁵.

Ottenere una popolazione omogenea di cellule endoteliali primarie può essere tecnicamente impegnativo e le cellule endoteliali primarie non possiedono un'elevata capacità proliferativa⁶. Quindi, per studiare la rigenerazione vascolare e valutare i processi fisiopatologici, vari gruppi hanno cercato di ottenere e valutare diversi tipi di cellule endoteliali derivate dal sangue periferico, ad esempio cellule progenitrici endoteliali (EPC) o cellule endoteliali di estratzione del sangue (BOEC)6,7,8,9 . Le EPCs precoci a forma di fuso provengono da cellule staminali ematopoietiche (HSC) e hanno una potenza di crescita limitata e una limitata capacità angiogenica di produrre cellule endoteliali mature. Inoltre, assomigliano molto ai monociti infiammatori. Inoltre, la loro capacità di differenziarsi ulteriormente in cellule endoteliali funzionali, proliferanti e mature è ancora discutibile 6,7,9,10. La coltura continua di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) può dare origine a una popolazione secondaria di cellule note come EPC a crescita tardiva, BOEC o cellule formanti colonie endoteliali (ECFC)6,7,9,10. Medina et al. nel 2018, hanno riconosciuto i limiti delle EPC, l'ambiguità della loro nomenclatura, insieme a una generale mancanza di concordanza con molti tipi di cellule distinti continuamente raggruppati sotto EPC¹¹. Al contrario, i BOEC sono stati riconosciuti per il loro ruolo nella riparazione vascolare, nella salute e nella malattia e nella terapia cellulare. Ulteriori studi e l'uso terapeutico di queste cellule si baseranno su protocolli per derivare coerentemente questi tipi di cellule da cellule progenitrici circolanti.

Le cellule primarie come le BOEC possono essere utilizzate come surrogato per ottenere cellule endoteliali mature altamente proliferative⁶. Le BOEC sono fenotipicamente distinte dalle EPC precoci e presentano caratteristiche endoteliali tipiche come la morfologia del ciottolo e l'espressione delle giunzioni aderenti e delle caveole¹². Il profilo genico di Hebbel et ^al.13,14,15 ha scoperto che le BOEC o ECFC sono le vere cellule endoteliali in quanto promuovono la formazione di microvasi e grandi vasi. Pertanto, i BOEC possono essere utilizzati come strumento per valutare i processi fisiopatologici e la variazione genetica¹⁶. Sono anche considerati un'eccellente fonte cellulare per la terapia cellulare per la rigenerazione vascolare¹⁷. Quindi, un protocollo standardizzato per derivare costantemente queste cellule altamente proliferative è essenziale.

Mentre le BOEC forniscono un potente strumento per studiare la variazione fisiopatologica e genetica umana, una fonte più omogenea di BOEC può fornire risultati sperimentali e terapeutici più robusti e affidabili. Una maggiore omogeneità può essere ottenuta utilizzando fonti cellulari xenogeniche derivate da animali geneticamente simili allevati in condizioni simili¹⁸. Mentre le fonti cellulari xenogeniche sono inclini a suscitare una risposta immunitaria dell'ospite, si stanno sviluppando strategie di immunomodulazione con l'obiettivo di generare animali e prodotti animali immunocompatibili, comprese le cellule. I maiali, in particolare, sono una fonte abbondante di sangue periferico e sono comunemente usati per studiare dispositivi medici e altre terapie a causa delle somiglianze anatomiche e fisiologiche con gli esseri umani. Quindi, questo studio perfeziona il protocollo per l'isolamento e l'espansione di BOEC altamente proliferativi dal sangue periferico suino. Il protocollo descritto di seguito è un metodo semplice e affidabile per ottenere un gran numero di BOEC da un volume relativamente piccolo di sangue. Le colture possono essere espanse attraverso diversi passaggi per generare milioni di cellule da un singolo campione di sangue.

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dai rispettivi Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) presso il Medical College of Wisconsin e la Mayo Clinic.

NOTA: In questo studio sono stati utilizzati suini domestici incrociati Yorkshire/Landrace/Duroc (Sus domesticus), maschi e femmine, 40-80 kg, 3-6 mesi.

1. Raccolta di sangue periferico suino

1. Preparare i materiali.
   1. Diluire la soluzione di eparina a 100 U/mL in soluzione salina sterile.
   2. Aggiungere 3-4 mL di soluzione di eparina a ciascuno dei due tubi conici da 50 mL e due siringhe da 60 mL.
   3. Aspirare la soluzione di eparina non diluita (1.000 U/ml) in un tubo di prolunga.
   4. Collegare un ago da 19 G a un'estremità del tubo di prolunga riempito di eparina e una siringa contenente eparina da 60 ml all'altra estremità.
2. Anestetizzare un maiale secondo le politiche istituzionali
   1. Somministrare un'iniezione IM di atropina (0,05 mg/kg), tiletamina/zolazepam (2-5 mg/kg) e xilazina (2 mg/kg) per indurre l'anestesia.
      NOTA: un'adeguata anestesia si ottiene una volta che l'animale è incosciente e i muscoli mandibolari non sono rigidi.
   2. Stendere l'animale in posizione supina e posizionare asciugamani arrotolati su entrambi i lati per fornire stabilità.
   3. Applicare un unguento oftalmico agli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
   4. Fornire supporto termico durante l'anestesia, comprese coperte, termofori e/o tavolo da procedura riscaldato.
3. Pulire l'area inguinale del femore con la soluzione di scrub betadine.
4. Perforare la vena o l'arteria femorale con l'ago da 19 G e aspirare lentamente (~1-2 mL/s) 50 mL di sangue nella siringa.
   NOTA: disegnare troppo velocemente può danneggiare le celle.
5. Lasciando l'ago in posizione, attorcigliare immediatamente il tubo di prolunga e scollegare la siringa da 60 mL
6. Trasferire lentamente il sangue in un tubo conico contenente eparina da 50 ml.
7. Tappare bene il tubo conico da 50 ml, capovolgere delicatamente alcune volte per mescolare e posizionare sul ghiaccio.
8. Collegare la restante siringa da 60 mL contenente eparina al tubo di prolunga, snocciolare il tubo di prolunga e aspirare lentamente altri 50 ml di sangue nella siringa.
9. Rimuovere immediatamente l'ago dall'arteria o dalla vena e aspirare lentamente il sangue rimanente dal tubo di prolunga nella siringa.
10. Scollegare la siringa da 60 mL dal tubo di prolunga e trasferire lentamente il sangue al tubo conico da 50 mL contenente eparina.
11. Tappare bene il tubo conico da 50 ml, capovolgere delicatamente alcune volte per mescolare e posizionare sul ghiaccio.
12. Applicare l'emostasi a pressione sull'area inguinale del femore del maiale.
13. Recuperare il maiale secondo le politiche istituzionali. Monitorare continuamente l'animale fino a quando non riacquista sufficiente coscienza per mantenere la reclinazione sternale e tornare alla normale area di alloggiamento / canile.

2. Isolamento delle cellule mononucleate

1. Diluire il sangue 1:1 con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) in quattro provette coniche da 50 ml.
   NOTA: Questo lavoro deve essere eseguito in una cappa di coltura cellulare utilizzando una tecnica asettica per evitare di contaminare la coltura cellulare.
2. Aggiungere 25 ml di soluzione di gradiente di densità pronta all'uso a temperatura ambiente in otto tubi conici da 50 ml.
3. Pipettare molto lentamente 25 mL di soluzione ematica/salina lungo l'interno di ciascuna soluzione a gradiente di densità contenente 50 mL di tubo conico tenendo il tubo ad angolo acuto rispetto alla punta della pipetta.
   NOTA: La soluzione di sangue deve sovrapporsi delicatamente alla soluzione a gradiente di densità e mantenere un'interfaccia ben definita.
4. Centrifugare i tubi per 30 minuti a 560 x g e temperatura ambiente (RT).
   NOTA: per ottenere risultati ottimali, disattivare il freno della centrifuga, se possibile.
5. Utilizzare una pipetta sottile per raccogliere con cura il buffy coat (strato torbido di celle mononucleate sopra la soluzione a gradiente di densità e sotto il plasma trasparente) da ciascuna provetta e distribuirla uniformemente in due nuove provette coniche da 50 ml. Eliminare la soluzione di gradiente di densità contenente tubi.
   NOTA: Raccogliere il maggior numero possibile di buffy coat raccogliendo il meno possibile della soluzione del gradiente di densità e del plasma.

3. Lavaggio e placcatura delle celle

1. Rivestire una piastra a 6 pozzetti con fibronectina.
   1. Preparare una soluzione madre di fibronectina plasmatica umana diluendola a 1 mg/ml in acqua sterile. Conservare le aliquote a -20 °C.
   2. Produrre 3,6 ml di una soluzione di lavoro di fibronectina diluendo 600 μL di soluzione madre di fibronectina in 3 ml di PBS.
   3. Trasferire 600 μL della soluzione di lavoro di fibronectina in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e oscillare delicatamente fino a quando non sono uniformemente rivestiti.
   4. Attendere 30 minuti affinché la fibronectina ricopra i pozzetti e aspirare delicatamente la soluzione da ciascun pozzetto.
2. In attesa che la fibronectina si rivesta, lavare le cellule mononucleate
   1. Rabbboccare i tubi con un massimo di 45 ml di PBS
   2. Centrifugare per 5 min a 560 x g e 4 °C con freno basso. Aspirare il surnatante da entrambi i tubi.
   3. Risospendere ogni pellet cellulare in 25 ml di PBS.
   4. Ripetere per lavare una seconda volta.
3. Risospendere ogni pellet cellulare in 5 ml di PBS e aggiungere 15 ml di soluzione di cloruro di ammonio allo 0,8% in ciascuna provetta.
   NOTA: Questo passaggio consiste nel lisare i globuli rossi rimanenti.
4. Incubare su ghiaccio per 10 min.
5. Lavare le celle come prima rabboccando i tubi con PBS e centrifugare per 5 minuti a 560 x g e 4 °C con freno basso. Aspirare il surnatante da entrambi i tubi.
6. Risospendere ogni pellet cellulare in 25 ml di PBS e ripetere per lavare una seconda volta.
7. Risospendere ogni pellet cellulare in 6 mL di terreno di coltura EGM-2 integrato con siero bovino fetale (FBS) al 10% e 1x soluzione antibiotica/antimicotica contenente 10.000 U/mL di penicillina, 10 mg/mL di streptomicina e 25 μg/mL di amfotericina.
   NOTA: il terreno di coltura EGM-2 è costituito da terreno di coltura EBM-2 integrato con 200 μL di idrocortisone, 2 ml di fattore di crescita dei fibroblasti umani (hFGF-B), 500 μL di fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), 500 μL di analogo ricombinante del fattore di crescita insulino-simile (R₃ IGF-1), 500 μL di acido ascorbico, 500 μL di fattore di crescita epidermico umano (hEGF), 500 μL di gentamicina/amfotericina e 500 μL di eparina per 500 ml.
8. Trasferire delicatamente 2 ml della sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti rivestita di fibronectina e oscillare delicatamente fino a quando non sono uniformemente rivestiti.
   NOTA: L'obiettivo è quello di seminare il maggior numero possibile di cellule per massimizzare il numero di colonie endoteliali che si formeranno.

4. Coltura cellulare

1. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO₂ e 100% di umidità.
2. Il giorno successivo, aggiungere delicatamente 1 ml di terreno di coltura fresco a ciascun pozzetto.
   NOTA: è importante essere delicati per non disturbare le cellule che sono vagamente aderenti al rivestimento della fibronectina.
3. Il giorno successivo, eseguire un mezzo cambio di terreno di coltura aspirando delicatamente 1,5 ml di terreno di coltura da ciascun pozzetto e sostituendolo con 1,5 ml di terreno di coltura fresco.
4. In ciascuno dei prossimi 5 giorni, eseguire delicatamente un cambio completo del terreno di coltura in ciascun pozzetto (2 ml di terreno di coltura fresco per pozzetto).
5. Successivamente, cambia delicatamente il terreno di coltura tre volte a settimana.
6. Visualizza regolarmente le colture cellulari al microscopio ottico a bassa potenza (obiettivo 4x).
   NOTA: Le colonie di cellule endoteliali aderenti alla crescita del sangue (BOEC) inizieranno ad apparire nei pozzetti 7-10 giorni dopo la placcatura. I tipi di cellule non aderenti verranno scartati con cambiamenti di mezzo e altri tipi di cellule aderenti si dissiperanno gradualmente man mano che le colonie BOEC crescono.
7. Passare i BOEC in un pallone T-75 rivestito di fibronectina quando ~ 70% -80% confluente e continuare a cambiare terreno di coltura tre volte alla settimana.
   NOTA: La densità di semina può essere controllata passando le colonie in un pallone T25. I passaggi successivi non richiedono il rivestimento della fibronectina e i cambiamenti del terreno di coltura possono essere ridotti a due volte a settimana.
8. Le cellule dei passaggi 1-3 possono essere utilizzate per esperimenti o trasferite in un mezzo di congelamento e conservate in azoto liquido per un uso futuro.

La morfologia delle cellule in coltura è stata osservata dall'inizio della coltura fino all'osservazione delle colonie di BOEC (Figura 1). Una popolazione più piccola di cellule aderenti ha iniziato ad attaccarsi ai piatti di coltura e a crescere, mentre le cellule non aderenti sono state rimosse con cambiamenti del terreno di coltura (Figura 1B). Le colonie sono apparse per la prima volta il giorno 6 come una raccolta di cellule simili all'endotelio che proliferano radialmente verso l'esterno da un punto centrale (Figura 1D). Man mano che la coltura progrediva, le colonie cellulari diventavano più dense e mostravano una morfologia di ciottoli simile alle cellule endoteliali mature (Figura 1F). La tipica morfologia del ciottolo endoteliale fornisce una facile identificazione preliminare dei BOEC utilizzando un microscopio ottico.

Le colonie di cellule endoteliali sono tipicamente pronte per il passaggio a 10-14 giorni di coltura. In questo momento, la piastra a 6 pozzetti produrrà in genere ~ 1 milione di celle con una vitalità percentuale del 93% -98%. Durante il primo passaggio, le cellule endoteliali si espanderanno per produrre ~ 6-10 milioni di cellule in un pallone T75.

Per valutare la morfogenesi dei BOEC, la matrice della membrana basale (ad esempio, Matrigel) è stata placcata su 15 piastre di angiogenesi a 10 μL/pozzetto e incubata a 37 °C per 30 minuti per consentire la polimerizzazione. Le cellule di passaggio 2 sono state seminate su piastre rivestite di matrice di membrana basale e riprodotte in punti temporali di 14 ore e 24 ore. Una densità di circa 3.500 celle per pozzo è stata in grado di formare una rete e strutture simili a tubi. La formazione del tubo è stata notata entro 14 ore per il terreno libero da siero (EGM-2 con supplementi ad eccezione di FBS) ed entro 24 ore per il terreno di crescita completo (EGM-2 con integratori incluso FBS). L'aggiunta di FBS può aver diluito i fattori di crescita specifici delle cellule endoteliali (ad esempio, VEGF) e introdotto altri fattori di segnalazione con conseguente ritardo del processo di formazione del tubo. La microscopia a contrasto di fase 2D è stata utilizzata per visualizzare la formazione di tubi in mezzo privo di siero (Figura 2A,B) e terreno di crescita completo (Figura 2C,D). Le cellule in entrambe le condizioni dei mezzi hanno subito una differenziazione morfologica e rapidamente organizzate in estese reti di strutture capillari simili a tubi. Queste strutture erano composte da cordoni cellulari organizzati simili a reti capillari in vivo. Inoltre, micrografie con ingrandimento 20x illustrano in dettaglio la complessa organizzazione multicellulare delle cellule endoteliali e la loro differenziazione morfologica. Non sono state osservate differenze morfologiche tra le condizioni dei mezzi. L'estesa rete di strutture capillari simili a tubi suggerisce fortemente la differenziazione delle cellule in coltura in cellule endoteliali mature e funzionali.

Le BOEC sono state ulteriormente caratterizzate dall'espressione del marcatore di cellule endoteliali mature CD31 o della molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche-1 (PECAM1) (Figura 3A,B). I BOEC hanno mostrato un'espressione uniforme di CD31. Inoltre, l'analisi della citometria a flusso ha confermato l'assenza di EPC poiché le cellule sono risultate negative per il marcatore monocitario CD14 rispetto al gruppo di controllo positivo delle PBMC (Figura 3C, D).

Figura 1: Immagini al microscopio ottico fenotipico. Le immagini al microscopio ottico dei BOEC in coltura osservate con ingrandimento 10x il giorno 0, (B) il giorno 2, (C) il giorno 4, (D) il giorno 6, (E) il giorno 8 e (F) dopo il primo passaggio. Barre di scala: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Differenziazione morfologica e organizzazione delle BOEC di passaggio 2. La differenziazione morfologica e l'organizzazione dei BOEC di passaggio 2 in strutture capillari simili a tubi sono state notate nella matrice della membrana basale entro 14 ore per il mezzo privo di siero ed entro 24 ore per il terreno di crescita completo. (A) Terreno senza siero a 4x, (B) Mezzo senza siero a 20x, (C) Terreno di coltura completo a 4x e (D) Mezzo di crescita completo a 20x. Barre di scala: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Caratterizzazione delle BOEC con CD31 e CD14. (A) Le BOEC di passaggio 2-3 sono state colorate per PECAM1 utilizzando l'anticorpo anti-CD31-FITC visto in verde e (B) corrispondenti immagini al microscopio a contrasto di fase. Le cellule sono state colorate in sospensione e la sospensione è stata ripresa su un vetrino da microscopio. Barre della scala: 200 μm. (C) Analisi citometrica a flusso di BOEC con anticorpo CD14-AF700 rispetto a (D) cellule mononucleate del sangue periferico di controllo positivo (PBMC). Colorazione CD14 positiva mostrata in blu e cellule non colorate mostrate in rosso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.