Protocollo basato sulla microdissezione laser per l'analisi LC-MS/MS del profilo proteomico dei granuli di neuromelanina

Maximilian Wulf; Katalin Barkovits-Boeddinghaus; Paula Sommer; Karin Schork; Martin Eisenacher; Peter Riederer; Manfred Gerlach; Steffen Kösters; Britta Eggers; Katrin Marcus

doi:10.3791/63289

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Protocollo basato sulla microdissezione laser per l'analisi LC-MS/MS del profilo proteomico dei granuli di neuromelanina

2.4K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/63289

⸱

16 dicembre 2021

Maximilian Wulf¹^,² , Katalin Barkovits-Boeddinghaus¹^,² , Paula Sommer¹^,² , Karin Schork¹^,² , Martin Eisenacher¹^,² , Peter Riederer³^,⁴ , Manfred Gerlach⁵ , Steffen Kösters¹^,² , Britta Eggers^*¹^,² , Katrin Marcus^*¹^,²

¹Medizinisches Proteom-Center, Medical Faculty, Ruhr-University Bochum, ²Medical Proteome Analysis, Center for Proteindiagnostics (PRODI), Ruhr-University Bochum, ³Center of Mental Health; Clinic and Policlinic for Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy, University Hospital Wuerzburg, ⁴Psychiatry Department of Clinical Research, University of Southern Denmark Odense University Hospital, ⁵Center of Mental Health, Department of Child and Adolescent Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy, University Hospital of Wuerzburg, University of Wuerzburg

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Un robusto protocollo è presentato qui per isolare i granuli di neuromelanina dal tessuto umano post-mortem substantia nigra pars compacta tramite microdissezione laser. Questo protocollo rivisto e ottimizzato riduce drasticamente il tempo necessario per la raccolta dei campioni, riduce la quantità di campione richiesta e migliora l'identificazione e la quantificazione delle proteine mediante analisi LC-MS/MS.

Abstract

La neuromelanina è un pigmento nero-brunastro, presente nei cosiddetti granuli di neuromelanina (NMG) nei neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta. Oltre alla neuromelanina, gli NMG contengono una varietà di proteine, lipidi e metalli. Sebbene i neuroni dopaminergici contenenti NMG siano persi preferenzialmente nelle malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson e la demenza con corpi di Lewy, si sa solo poco sul meccanismo di formazione di NMG e sul ruolo dei NMG nella salute e nella malattia. Pertanto, ulteriori ricerche sulla caratterizzazione molecolare degli NMG sono essenziali. Sfortunatamente, i protocolli standard per l'isolamento delle proteine si basano sull'ultracentrifugazione a gradiente di densità e quindi richiedono elevate quantità di tessuto umano. Pertanto, qui viene stabilito un protocollo automatizzato basato sulla microdissezione laser (LMD) che consente la raccolta di NMG e tessuto circostante di substantia nigra (SN) utilizzando quantità minime di tessuto in modo imparziale e automatizzato. I campioni asportati vengono successivamente analizzati mediante spettrometria di massa per decifrare la loro composizione proteomica. Con questo flusso di lavoro, sono state identificate 2.079 proteine, di cui 514 proteine sono state identificate esclusivamente in NMG e 181 in SN. I risultati attuali sono stati confrontati con uno studio precedente utilizzando un approccio simile basato su LMD raggiungendo una sovrapposizione dell'87,6% per entrambi i proteomi, verificando l'applicabilità del protocollo rivisto e ottimizzato qui presentato. Per convalidare i risultati attuali, le proteine di interesse sono state analizzate mediante spettrometria di massa mirata, ad esempio esperimenti di monitoraggio delle reazioni parallele (PRM).

Introduzione

Ogni tessuto è costituito da una miscela eterogenea di diversi tipi cellulari, ma l'isolamento specifico di un tipo di cellula è spesso indispensabile per una caratterizzazione più precisa. La microdissezione laser (LMD), che accoppia un microscopio con un'applicazione laser, è un potente strumento per l'isolamento specifico di aree tissutali, singole cellule o sottostrutture cellulari da un composito complesso. L'applicazione di LMD in combinazione con la spettrometria di massa (LMD-MS) è già stata implementata con successo per diverse domande di ricerca, tra cui l'isolamento del DNA¹, RNA² e proteine ^....