Una procedura post-fissazione modificata aumenta il contrasto delle particelle di glicogeno nei tessuti. Questo documento fornisce un protocollo passo-passo che descrive come gestire il tessuto, condurre l'imaging e utilizzare metodi stereologici per ottenere dati imparziali e quantitativi sulla distribuzione del glicogeno subcellulare specifico della fibra nel muscolo scheletrico.
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Articolo metodologico
Quantificazione della distribuzione subcellulare del glicogeno nelle fibre muscolari scheletriche mediante microscopia elettronica a trasmissione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Con l'uso della microscopia elettronica a trasmissione, è possibile ottenere immagini ad alta risoluzione di campioni fissi contenenti singole fibre muscolari. Ciò consente di quantificare aspetti ultrastrutturali come frazioni di volume, rapporti superficie/volume, morfometria e siti di contatto fisico di diverse strutture subcellulari. Nel 1970, un protocollo per la colorazione migliorata del glicogeno nelle cellule è stato sviluppato e ha aperto la strada a una serie di studi sulla localizzazione subcellulare della dimensione delle particelle di glicogeno e glicogeno utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione. Mentre la maggior parte delle analisi interpreta il glicogeno come se fosse distribuito in modo omogeneo all'interno delle fibre muscolari, fornendo solo un singolo valore (ad esempio, una concentrazione media), la microscopia elettronica a trasmissione ha rivelato che il glicogeno è immagazzinato come particelle di glicogeno discrete situate in compartimenti subcellulari distinti. Qui, viene descritto il protocollo passo-passo dalla raccolta dei tessuti alla determinazione quantitativa della frazione di volume e del diametro delle particelle del glicogeno nei distinti compartimenti subcellulari delle singole fibre muscolari scheletriche. Considerazioni su come 1) raccogliere e macchiare campioni di tessuto, 2) eseguire analisi di immagini e gestione dei dati, 3) valutare la precisione delle stime, 4) discriminare tra i tipi di fibre muscolari e 5) sono incluse insidie e limitazioni metodologiche.
Introduzione
Le particelle di glicogeno sono composte da polimeri ramificati di glucosio e varie proteine associate1 e costituiscono un combustibile importante durante le elevate richieste metaboliche2. Sebbene non ampiamente riconosciute, le particelle di glicogeno costituiscono anche un combustibile locale, dove alcuni processi subcellulari utilizzano preferenzialmente il glicogeno nonostante la disponibilità di altri e più combustibili di lunga durata come il glucosio plasmatico e gli acidi grassi3,4.
L'importanza di immagazzinare il glicogeno c....
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Protocollo
Il presente protocollo che utilizza campioni di muscolo scheletrico bioptico umano è stato approvato dai Comitati regionali per l'etica della ricerca sanitaria per la Danimarca meridionale (S-20170198). Le biopsie muscolari sono state ottenute attraverso un'incisione nella pelle dal muscolo vasto laterale utilizzando un ago bergström con aspirazione dopo che l'anestesia locale è stata somministrata per via sottocutanea (1-3 ml di lidocaina 2% per incisione). Se sono stati utilizzati muscoli interi di ratto isolati, gli animali sono stati sacrificati dalla lussazione cervicale prima che le biopsie muscolari fossero ottenute, in conformità con le linee guida de....
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Risultati
Utilizzando questo protocollo, le particelle di glicogeno appaiono nere e distinte (Figure 1 e Figura 2). I valori normali del glicogeno sono rappresentati nella Figura 3. Questi dati si basano su un totale di 362 fibre di 41 giovani uomini sani come raccolto in diversi studi precedenti19,24,29,30,31........
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Discussione
Il passaggio critico del metodo è l'uso di osmio ridotto da ferrocianuro di potassio durante la post-fissazione. La selettività di questo fissativo modificato per il rilevamento del glicogeno non può essere completamente spiegata dalla chimica, ma include anche risultati sperimentali che dimostrano che non è stata rilevata alcuna particella in tessuti noti per essere privi di glicogeno o nello spazio extracellulare11.
I parametri critici sono la precisione delle stime e.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Comitato Olimpico Svedese.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,2-Ossido di propilene | Merck | 75-56-9 | |
| Kit medio di resina 812 per inclusione | Taab | T031 | |
| Soluzione di glutaraldeide 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ARTICOLO | Software di imaging Olympus | ||
| Leica EM AC20 | Leica | Sistema di contrasto automatico | |
| Fotocamera digitale OSIS Veleta | Olympus | ||
| Osmio tetrossido 4% soluzione | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Trasmissione EM | Philips | ||
| Esacianoferrato di potassio (II) triidrato | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodio cacodilatotampone 0,2 M ph 7,4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtomo Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain piombo citrato 3%, soluzione stabilizzata | Leica | 16707235 | |
| Acetato di uranile diidrato | Polysciences | 6159-44-0 |
Riferimenti
- Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
- Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in hum....
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Ristampe e permessi
