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Summary

I microtubuli, che sono polimeri di tubulina, svolgono un ruolo cruciale come componente del citoscheletro nelle cellule eucariotiche e sono noti per la loro instabilità dinamica. Questo studio ha sviluppato un metodo per frazionare i microtubuli per separarli in microtubuli stabili, microtubuli labili e tubulina libera per valutare la stabilità dei microtubuli in vari tessuti di topo.

Abstract

I microtubuli, composti da dimeri di α/β-tubulina, sono un componente cruciale del citoscheletro nelle cellule eucariotiche. Questi polimeri tubolari mostrano instabilità dinamica poiché le subunità eterodimeriche della tubulina subiscono polimerizzazione e depolimerizzazione ripetitive. Il controllo preciso della stabilità e della dinamica dei microtubuli, ottenuto attraverso le modificazioni post-traduzionali della tubulina e le proteine associate ai microtubuli, è essenziale per varie funzioni cellulari. Le disfunzioni nei microtubuli sono fortemente implicate nella patogenesi, comprese le malattie neurodegenerative. La ricerca in corso si concentra sugli agenti terapeutici mirati ai microtubuli che modulano la stabilità, offrendo potenziali opzioni di trattamento per queste malattie e tumori. Di conseguenza, la comprensione dello stato dinamico dei microtubuli è fondamentale per valutare la progressione della malattia e gli effetti terapeutici.

Tradizionalmente, la dinamica dei microtubuli è stata valutata in vitro o in coltura attraverso il frazionamento approssimativo o l’immunodosaggio, utilizzando anticorpi mirati alle modificazioni post-traduzionali della tubulina. Tuttavia, l’analisi accurata dello stato della tubulina nei tessuti utilizzando tali procedure pone delle sfide. In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo di frazionamento dei microtubuli semplice e innovativo per separare i microtubuli stabili, i microtubuli labili e la tubulina libera nei tessuti di topo.

La procedura prevedeva l’omogeneizzazione di tessuti di topo sezionati in un tampone stabilizzante con microtubuli con un rapporto di volume di 19:1. Gli omogenati sono stati poi frazionati attraverso un processo di ultracentrifugazione in due fasi dopo una centrifugazione lenta iniziale (2.400 × g) per rimuovere i detriti. La prima fase di ultracentrifugazione (100.000 × g) ha precipitato microtubuli stabili, mentre il surnatante risultante è stato sottoposto a una seconda fase di ultracentrifugazione (500.000 × g) per frazionare i microtubuli labili e i dimeri solubili della tubulina. Questo metodo ha determinato le proporzioni di tubulina che costituiscono microtubuli stabili o labili nel cervello del topo. Inoltre, sono state osservate distinte variazioni tissutali nella stabilità dei microtubuli correlate con la capacità proliferativa delle cellule costituenti. Questi risultati evidenziano il potenziale significativo di questo nuovo metodo per l’analisi della stabilità dei microtubuli in condizioni fisiologiche e patologiche.

Introduction

I microtubuli (MT) sono strutture tubolari allungate costituite da protofilamenti costituiti da subunità eterodimeriche di α/β-tubulina. Svolgono ruoli essenziali in vari processi cellulari come la divisione cellulare, la motilità, il mantenimento della forma e il trasporto intracellulare, rendendoli componenti integrali del citoscheletro eucariotico¹. L’estremità negativa delle MT, in cui è esposta la subunità α-tubulina, è relativamente stabile, mentre l’estremità negativa, in cui è esposta la subunità β-tubulina, subisce depolimerizzazione dinamica e polimerizzazione². Questo ciclo continuo di aggiunta e dissociazione del dimero di tubulina all’estremità positiva, indicato come instabilità dinamica, si traduce in un processo ripetitivo di salvataggio e catastrofe³. Le MT presentano domini focali con variazioni localizzate nell’instabilità dinamica, inclusi domini stabili e labili⁴.

Il controllo preciso dell’instabilità dinamica delle MT è fondamentale per numerose funzioni cellulari, in particolare nei neuroni caratterizzati da morfologie complesse. L’adattabilità e la durata delle MT svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo e nel corretto funzionamento delle cellule nervose ^5,6,7. È stato riscontrato che l’instabilità dinamica delle MT è associata a varie modificazioni post-traduzionali (PTM) della tubulina, come l’acetilazione, la fosforilazione, la palmitoilazione, la detirosinazione, il delta 2, l’ossidazione della poliglutammina e la poliglicilazione. Inoltre, il legame delle proteine associate ai microtubuli (MAP) funge da meccanismo di regolazione⁸. I PTM, esclusa l’acetilazione, si trovano prevalentemente nella regione carbossi-terminale della tubulina situata sulla superficie esterna delle MT. Queste modificazioni creano diverse condizioni superficiali sulle MT, influenzando la loro interazione con le MAP e, in ultima analisi, governando la stabilità della MT⁹. La presenza di un residuo di tirosina carbossi-terminale nella α-tubulina è indicativa di MT dinamiche, che vengono rapidamente sostituite dal pool di tubulina libera. Al contrario, la detirosinazione dell’estremità carbossilica e l’acetilazione di Lys40 indicano MT stabili con ridotta instabilità dinamica ^9,10.

I PTM della tubulina sono stati ampiamente impiegati in esperimenti per valutare la dinamica e la stabilità delle MT 5,7,11,12,13,14,15. Ad esempio, negli studi sulle colture cellulari, le tubuline possono essere segregate in due pool: il pool di tubulina libera e il pool MT. Ciò si ottiene liberando la tubulina libera attraverso la permeabilizzazione cellulare prima di fissare le MT rimanenti 15,16,17,18,19. I metodi biochimici prevedono l’uso di stabilizzatori chimici MT che salvaguardano le MT dalla catastrofe, consentendo la separazione delle MT e della tubulina libera attraverso la centrifugazione^20,21,22. Tuttavia, queste procedure non distinguono tra MT stabili e meno stabili (labili), rendendo così impossibile quantificare le MT o la tubulina solubile in tessuti come il cervello. Di conseguenza, la valutazione della stabilità della MT negli organismi in condizioni fisiologiche e patologiche si è rivelata impegnativa. Per affrontare questa limitazione sperimentale, abbiamo sviluppato una nuova tecnica per separare con precisione le MT e la tubulina libera nel tessuto di topo²³.

Questo metodo unico di frazionamento MT prevede l’omogeneizzazione dei tessuti in condizioni che mantengono lo stato di tubulina nei tessuti e la centrifugazione in due fasi per separare le MT stabili, le MT labili e la tubulina libera. Questa semplice procedura può essere applicata a studi ampi, tra cui la ricerca di base su MT e MAP negli organismi viventi, analisi fisiologiche e patologiche della salute e delle malattie associate alla stabilità della MT e lo sviluppo di farmaci e altre terapie mirate alle MT.

Protocol

1. Metodo di frazionamento MT NOTA: Tutti gli esperimenti eseguiti in questo studio sono stati approvati dal Comitato Etico Animale della Doshisha University. In questo caso sono stati utilizzati topi C57BL/6J di entrambi i sessi, di 3-4 mesi di età. In questo protocollo, i tessuti sezionati, ad esempio cervello, fegato o timo, sono stati immediatamente omogeneizzati in un tampone stabilizzante dei microtubuli ghiacciato (MSB), che conteneva Taxol (stabilizzatore MT) a una concentrazione che impediva non solo la depolimerizzazione ma anche la ripolimerizzazione della MT. L’omogenato è stato separato in tre frazioni mediante un processo di ultracentrifugazione in due fasi (Figura 1). Tutte le fasi di questo protocollo sono state completate senza interruzioni in un ambiente a temperatura fredda e i tessuti e le frazioni non sono stati congelati fino a quando non sono stati disciolti in tampone per campioni di sodio dodecilsolfato (SDS). Preparazione di MSB e microprovettePer preparare l’MSB, miscelare i seguenti reagenti: acido 0,1 M di 2-(N-morfolino)etanasolfonico (MES), pH 6,8 (neutralizzato da KOH), 10% glicerolo, 0,1 mM DTT, 1 mM MgSO 4, 1 mM EGTA, 0,5% Triton X-100, inibitori della fosfatasi (1 mM NaF, 1 mM β-glicerofosfato, 1 mM Na3VO 4, 0,5 μM acido okadaico), 1x cocktail di inibitori della proteasi, e inibitori della proteasi (0,1 mM PMSF, 0,1 mM DIFP, 1 μg/mL di pepstatina, 1 μg/mL antidolorifico, 10 μg/mL di aprotinina, 10 μg/mL di leupeptina, 50 μg/mL TLCK) (vedere Tabella dei materiali) e indicano come MSB(-). Appena prima della dissezione del tessuto, aggiungere 10 μM di Taxol e 2 mM di GTP (vedere la tabella dei materiali) all’MSB(-). Questo buffer è indicato come MSB(+). Preparare il tampone il giorno dell’uso e tenerlo in ghiaccio. Preparare le microprovette per il campionamento. Microprovetta vuota da 2,0 mL per la conservazione dell’omogeneato; microprovetta vuota da 1,5 mL per la conservazione del lisato surnatante1 (S1), del precipitato2 (P2) e del precipitato3 (P3); Microprovetta da 1,5 mL con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS) per la conservazione dei tessuti sezionati; Microprovetta da 1,5 mL con 200 μL di tampone per campioni SDS 2x (0,16 M Tris pH 6,8; 20% glicerolo; 2% 2-mercaptoetanolo; 4% SDS) per la conservazione di campioni S1 e surnatante3 (S3); e microprovetta di centrifugazione per rotori da centrifuga TLA55 e TLA120.2 (vedi Tabella dei materiali). Etichettare tutte le provette e posizionarle sul ghiaccio. Omogeneizzazione dei tessuti di topoPreparare un tavolo refrigerato per la dissezione dei tessuti. Per prima cosa, riempi una scatola con ghiaccio tritato e posiziona due piastre di Petri sul ghiaccio, una con il lato interno rivolto verso l’alto e l’altra con il lato esterno. Riempi il PBS ghiacciato in un piatto per il lavaggio temporaneo e la conservazione dei tessuti sezionati. Stendere la carta da filtro inumidita con PBS su un altro piatto capovolto. Per sacrificare un topo, eseguire la lussazione cervicale in anestesia profonda con un anestetico misto di butorfanolo, midazolam e medetomidina. Quindi, sezionare immediatamente i tessuti, ad esempio cervello, fegato o timo, e lavarli con PBS ghiacciato in una capsula di Petri.NOTA: Qualsiasi tipo di tessuto molle può essere analizzato con questo metodo. Tuttavia, la dimensione del tessuto è limitata dall’intervallo di volume raccomandato dell’omogeneizzatore utilizzato. Ad esempio, se si utilizza un volume di 2 mL di omogeneizzatore, si raccomandano 50-100 mg di tessuto. Dopo aver pesato le microprovette da 1,5 mL riempite con PBS per la conservazione dei tessuti sezionati, ritagliare e conservare i tessuti all’interno delle microprovette e pesare nuovamente ciascuna microprovetta. Il peso umido di ogni tessuto può essere calcolato sottraendo il peso della provetta prima e dopo l’aggiunta del tessuto. Omogeneizzare immediatamente il tessuto in MSB ghiacciato (+) con un omogeneizzatore refrigerato (vedere la tabella dei materiali). Il volume di MSB(+) era 19 volte (μL) il peso umido del tessuto (mg). Eseguire l’omogeneizzazione con 20 colpi fino a quando i pezzi di tessuto scompaiono.NOTA: Ad esempio, 1.900 μL di MSB(+) vengono utilizzati per 100 mg di tessuto. Poiché il volume di MSB(+) da aggiungere deve essere regolato per ogni peso umido dei pezzi di tessuto analizzati, è necessario pesare accuratamente ogni pezzo di tessuto. Centrifugazione degli omogeneizzati tissutali di topoSpostare l’intero omogenato in una microprovetta da 2 mL con una pipetta Pasteur e centrifugare a 2.400 × g per 3 minuti a 2 °C per rimuovere i detriti tramite precipitazione. Trasferire l’intero surnatante (frazione S1) in una nuova microprovetta da 1,5 mL e in un vortice. Quindi, aliquotare 200 μL di frazione S1 in una microprovetta di centrifugazione e centrifugare a 100.000 × g utilizzando un rotore TLA-55 per 20 minuti a 2 °C per ottenere le proteine di peso molecolare relativamente grande come precipitato (frazione P2).NOTA: Il volume del campione sottoposto alle fasi di ultracentrifugazione influisce sul raggio di centrifugazione e sull’efficienza di precipitazione delle molecole. Mantenere il volume del campione a 200 μL o meno dopo questa fase per evitare un frazionamento impreciso. Centrifugare ulteriormente tutto il surnatante risultante (frazione S2) a 500.000 × g utilizzando un rotore TLA-120.2 per 60 minuti a 2 °C per separare i complessi proteici insolubili nel precipitato (frazione P3) dalle proteine solubili nel surnatante (frazione S3). Aggiungere 400 μL di tampone per campioni SDS 1x (0,08 M Tris pH 6,8; 10% glicerolo; 1% 2-mercaptoetanolo; 2% SDS) alle provette delle frazioni P2 e P3 e brevemente sonicare per dissolvere il precipitato. Trasferire questi campioni di frazione in una microprovetta vuota da 1,5 mL. Sciogliere la frazione totale di S3 in 200 μL di tampone per campioni SDS 2x. Miscelare le restanti frazioni S1 con un volume uguale di 2 tamponi campione SDS da utilizzare come curva standard per il Western blotting. Far bollire tutti questi campioni a 100 °C per 3 min. Dopo che i campioni si sono raffreddati a temperatura ambiente, conservarli a -20 °C. Quantificazione delle proteine in ogni frazioneQuantificare le proteine nelle frazioni P2, P3 e S3 mediante Western blotting. Innanzitutto, utilizzare l’elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS al 10% (SDS-PAGE) per separare le proteine dalle frazioni P2, P3 e S3 adeguatamente diluite e dal campione S1 diluito in serie da qualsiasi individuo come curva standard. Quindi, elettroblot i campioni su membrane di fluoruro di polivinilidene (vedi Tabella dei materiali).NOTA: Il rapporto di diluizione di ciascuna frazione dipende dalla concentrazione di una proteina obiettivo e dalla reattività dell’anticorpo. (ad esempio, α-tubulina, TUBB3, β-tub e tubulina tirosinata nel tessuto cerebrale: S3 = 1/400, P3 = 1/2.000, P2 = 1/2.000, S1 = 1/50, 000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000; tubulina acetilata nel tessuto cerebrale: S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8.000, S1 = 1/100.000, 1/40.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/4.000; α-tubulina nel fegato: S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000; α-tubulina nel timo: S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50.000, 1/20.000, 1/10.000, 1/5.000, 1/2.000 diluizione della concentrazione tissutale). Bloccare la membrana con latte scremato al 5% in soluzione salina tamponata Tris (50 mM Tris-HCl pH 7,6; 152 mM NaCl) con Tween 20 allo 0,1% (TBS-T) per oltre 30 min. Immergere la membrana in TBS-T contenente l’anticorpo primario (vedere la tabella dei materiali) per oltre 2 ore. Successivamente, lavare la membrana con TBS-T per 3 minuti (3 volte). Etichettare l’anticorpo primario utilizzando anticorpi secondari coniugati con HRP (vedere Tabella dei materiali) in TBS-T per oltre 1 ora. Successivamente, lavare la membrana con TBS-T per 3 minuti (3 volte). Sviluppare le membrane con il reagente Chemiluminescenza potenziata. Quindi, analizzare le bande di interesse con un analizzatore di immagini luminescenti (vedi Tabella dei materiali). Quantificare le intensità della banda proteica utilizzando un software di analisi delle immagini (vedere la tabella dei materiali) e creare una curva standard tracciando le unità di diluizione dei campioni S1 diluiti utilizzati per la curva standard lungo l’asse X e le intensità della banda lungo l’asse Y. Leggere la concentrazione proteica (unità) corrispondente ai campioni di frazione diluita. Moltiplicare la concentrazione letta per il fattore di diluizione del campione per ottenere un’unità proteica in ciascuna frazione. Dividi l’unità misurata di ciascuna frazione per l’unità proteica totale (P2 + P3 + S3) per ottenere una percentuale. 2. Valutazione delle proprietà della tubulina in ogni frazione NOTA: Questo metodo biochimico fornisce tre gruppi di complessi di tubulina definiti dalle proprietà di sedimentazione. Qui, lo stato dei complessi di tubulina ottenuti in queste frazioni è stato identificato in base alle dimensioni del complesso e dei PTM di tubulina. Completare tutti i passaggi di questo protocollo senza interruzioni in un ambiente a temperatura fredda, ma non congelare i campioni di frazione fino a quando non sono stati disciolti nel tampone del campione SDS. Saggio della trappola filtranteFiltrare le frazioni S2 e S3 (500 μL ciascuna) utilizzando una colonna di centrifuga di ultrafiltrazione da 300 kDa (vedere la tabella dei materiali). Eseguire una centrifugazione di 14.000 × g a 2 °C fino a quando l’intero surnatante viene filtrato, le proteine eluite vengono raccolte in provette ricevitrici e le proteine intrappolate rimangono sul filtro delle provette serbatoio. Tradurre i filtrati interi (circa 500 μL) nelle provette ricevitrici in nuove microprovette da 1,5 mL e scioglierle in 500 μL di tampone per campioni SDS 2x. Solubilizzare i residui sul filtro delle provette serbatoio in 1.000 μL di tampone per campioni SDS 1x pipettando e trasferendo i campioni in una nuova microprovetta da 1,5 mL. Far bollire i campioni a 100 °C per 3 min. Dopo che i campioni si sono raffreddati a temperatura ambiente, conservarli a -20 °C. Analizzare le quantità di tubulina mediante Western blotting con DM1A (anticorpo anti-α-tubulina, vedere Tabella dei materiali). Cromatografia ad esclusione dimensionalePreparare il tampone carrier (0,1 M MES, pH 6,8; 10% glicerolo; 1 mM MgSO4; 1 mM EGTA; 0,1 mM DTT) integrato con una concentrazione di 1/10 di inibitori della proteasi e della fosfatasi come descritto al punto 1.1.1. Quindi, filtrare la soluzione e conservarla in un ambiente freddo. Preparare una colonna per cromatografia a filtrazione su gel dotata di un sistema di cromatografia liquida preparativa in una camera cromatografica (vedere Tabella dei materiali) a 4 °C. Prima di iniettare i campioni sulla colonna, far fluire 180 mL del tampone di supporto per lavare la colonna. La portata è di 1 ml/min per 3 ore. Iniettare sulla colonna tubulina suina purificata disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) come controllo o la frazione S3 del cervello di topo (500 μL ciascuno). Eluire a una portata di 1,0 mL/min con tampone carrier. Raccogliere le frazioni da 1,5 mL per 120 min. Monitorare le proteine eluite mediante assorbanza a 280 nm. Mantenere la pressione massima al di sotto di 0,3 MPa. Dopo aver vortex le frazioni raccolte, mescolarne 50 μL con 50 μL di tampone per campioni SDS 2x in una microprovetta da 1,5 mL. Far bollire tutti i campioni a 100 °C per 3 min. Dopo che i campioni si sono raffreddati a temperatura ambiente, conservarli a -20 °C. Analizzare le quantità di tubulina mediante Western blotting con DM1A, anticorpo anti-α-tubulina e KMX-1, anticorpo anti-β-tubulina (vedi Tabella dei materiali).

Representative Results

Quantificazione della tubulina nelle frazioni P2, P3 e S3 del cervello di topo con il metodo del frazionamento MTLa tubulina nel tessuto di topo è stata separata nelle frazioni P2, P3 e S3 con il metodo del frazionamento MT e quantificata mediante Western blotting (Figura 1A). Il precipitato di MT che è rimasto nella frazione P2 mediante ultracentrifugazione a 100.000 × g per 20 minuti ha rappresentato il 34,86% ± l’1,68% della tubulina totale nel cervello d…

Discussion

Il compito più significativo quando si studia lo stato della tubulina nei tessuti di organismi viventi è prevenire la polimerizzazione o la depolimerizzazione accidentale della MT durante la preparazione. La stabilità delle MT nei campioni è influenzata da fattori quali la concentrazione di Taxol nell’MSB, la proporzione di quantità di tessuto rispetto al tampone e la temperatura durante il processo dalla rimozione del tessuto all’omogeneizzazione e centrifugazione. Pertanto, le condizioni sono state ottimizzate in …

Materials

1.5 ML TUBE CASE OF 500	Beckman Coulter	357448
1A2	Sigma-Aldrich	T9028	1:5,000 dilution
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Nacalai Tesque	02442-44
300 kDa ultrafiltration spin column	Aproscience	PT-1013
6-11B1	Sigma-Aldrich	T7451	1:5,000 dilution
AKTA prime plus	Cytiva
anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 dilution
antipain	Peptide Institute Inc.	4062
aprotinin	Nacalai Tesque	03346-84
Chemi-Lumi One L	Nacalai Tesque	07880-54
Corning bottle-top vacuum filter system	Corning	430758	0.22µm 33.2cm² Nitrocellulose membrane
DIFP	Sigma-Aldrich	55-91-4
DIGITAL HOMOGENIZER		AS ONE	HOM
DM1A	Sigma-Aldrich	T9026	1:5,000 dilution
DTT	Nacalai Tesque	14128-46
EGTA	Nacalai Tesque	37346-05
FluoroTrans W 3.3 Meter Roll	Pall Corporation	BSP0161
glycerol	Nacalai Tesque	17018-25
GTP		Nacalai Tesque	17450-61
HIGH SPEED REFRIGERATIOED MICRO CENTRIFUGE Kitman		TOMY
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column	Cytiva	28-9893-35
Image Gauge Software	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation	292-69903
KMX-1	Millipore	MAB3408	1:5,000 dilution
LAS-4000 luminescent image analyzer	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptin	Peptide Institute Inc.	43449-62
MgSO4	Nacalai Tesque	21003-75
Na3VO4	Nacalai Tesque	32013-92
NaF	Nacalai Tesque	31420-82
okadaic acid	LC Laboratories	O-2220
OPTIMA MAX-XP	Beckman Coulter	393315
pepstatin	Nacalai Tesque	26436-52
PMSF	Nacalai Tesque	27327-81
Polycarbonate Centrifuge Tubes for TLA120.2	Beckman Coulter	343778
Protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free)		Roche	5056489001
Purified tubulin	Cytoskeleton	T240
QSONICA Q55	QSonica	Q55
Taxol		LC Laboratories	P-9600
TLA-120.2 rotor	Beckman Coulter	357656
TLA-55 rotor	Beckman Coulter	366725
TLCK	Nacalai Tesque	34219-94
Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422