Tecnica di frazionamento quantitativo dei microtubuli per separare microtubuli stabili, microtubuli labili e tubulina libera nei tessuti di topo

Ayaka Hagita-Tatsumoto; Tomohiro Miyasaka

doi:10.3791/63358

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Articolo metodologico

Tecnica di frazionamento quantitativo dei microtubuli per separare microtubuli stabili, microtubuli labili e tubulina libera nei tessuti di topo

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DOI:

10.3791/63358

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17 novembre 2023

Ayaka Hagita-Tatsumoto¹^,² , Tomohiro Miyasaka¹^,²^,³

¹Department of Neuropathology, Faculty of Life and Medical Sciences, Doshisha University, ²Center for Research in Neurodegenerative Diseases, Doshisha University, ³Laboratory of Physiology and Anatomy, School of Pharmacy, Nihon University

In questo articolo

Sommario

I microtubuli, che sono polimeri di tubulina, svolgono un ruolo cruciale come componente del citoscheletro nelle cellule eucariotiche e sono noti per la loro instabilità dinamica. Questo studio ha sviluppato un metodo per frazionare i microtubuli per separarli in microtubuli stabili, microtubuli labili e tubulina libera per valutare la stabilità dei microtubuli in vari tessuti di topo.

Abstract

I microtubuli, composti da dimeri di α/β-tubulina, sono un componente cruciale del citoscheletro nelle cellule eucariotiche. Questi polimeri tubolari mostrano instabilità dinamica poiché le subunità eterodimeriche della tubulina subiscono polimerizzazione e depolimerizzazione ripetitive. Il controllo preciso della stabilità e della dinamica dei microtubuli, ottenuto attraverso le modificazioni post-traduzionali della tubulina e le proteine associate ai microtubuli, è essenziale per varie funzioni cellulari. Le disfunzioni nei microtubuli sono fortemente implicate nella patogenesi, comprese le malattie neurodegenerative. La ricerca in corso si concentra sugli agenti terapeutici mirati ai microtubuli che modulano la stabilità, offrendo potenziali opzioni di trattamento per queste malattie e tumori. Di conseguenza, la comprensione dello stato dinamico dei microtubuli è fondamentale per valutare la progressione della malattia e gli effetti terapeutici.

Tradizionalmente, la dinamica dei microtubuli è stata valutata in vitro o in coltura attraverso il frazionamento approssimativo o l'immunodosaggio, utilizzando anticorpi mirati alle modificazioni post-traduzionali della tubulina. Tuttavia, l'analisi accurata dello stato della tubulina nei tessuti utilizzando tali procedure pone delle sfide. In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo di frazionamento dei microtubuli semplice e innovativo per separare i microtubuli stabili, i microtubuli labili e la tubulina libera nei tessuti di topo.

La procedura prevedeva l'omogeneizzazione di tessuti di topo sezionati in un tampone stabilizzante con microtubuli con un rapporto di volume di 19:1. Gli omogenati sono stati poi frazionati attraverso un processo di ultracentrifugazione in due fasi dopo una centrifugazione lenta iniziale (2.400 × g) per rimuovere i detriti. La prima fase di ultracentrifugazione (100.000 × g) ha precipitato microtubuli stabili, mentre il surnatante risultante è stato sottoposto a una seconda fase di ultracentrifugazione (500.000 × g) per frazionare i microtubuli labili e i dimeri solubili della tubulina. Questo metodo ha determinato le proporzioni di tubulina che costituiscono microtubuli stabili o labili nel cervello del topo. Inoltre, sono state osservate distinte variazioni tissutali nella stabilità dei microtubuli correlate con la capacità proliferativa delle cellule costituenti. Questi risultati evidenziano il potenziale significativo di questo nuovo metodo per l'analisi della stabilità dei microtubuli in condizioni fisiologiche e patologiche.

Introduzione

I microtubuli (MT) sono strutture tubolari allungate costituite da protofilamenti costituiti da subunità eterodimeriche di α/β-tubulina. Svolgono ruoli essenziali in vari processi cellulari come la divisione cellulare, la motilità, il mantenimento della forma e il trasporto intracellulare, rendendoli componenti integrali del citoscheletro eucariotico¹. L'estremità negativa delle MT, in cui è esposta la subunità α-tubulina, è relativamente stabile, mentre l'estremità negativa, in cui è esposta la subunità β-tubulina, subisce depolimerizzazione dinamica e polimerizzazione². Questo ciclo continuo di aggiunta e dissociazione....