Il tasso di consumo di ossigeno (OCR) è un proxy comune per la funzione mitocondriale e può essere utilizzato per studiare diversi modelli di malattia. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo utilizzando un analizzatore Seahorse XF per misurare direttamente l'OCR in fette striatal acute di topi adulti che è più fisiologicamente rilevante rispetto ad altri metodi.
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Articolo metodologico
Misurazione del tasso di consumo di ossigeno nelle fette striatali acute di topi adulti
In questo articolo
Sommario
Abstract
I mitocondri svolgono un ruolo importante nella produzione cellulare di ATP, nella regolazione delle specie reattive dell'ossigeno e nel controllo della concentrazionedi Ca 2 +. La disfunzione mitocondriale è stata implicata nella patogenesi di più malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson (PD), la malattia di Huntington e il morbo di Alzheimer. Per studiare il ruolo dei mitocondri nei modelli di queste malattie, possiamo misurare la respirazione mitocondriale attraverso il tasso di consumo di ossigeno (OCR) come proxy per la funzione mitocondriale. L'OCR è già stato misurato con successo in colture cellulari e mitocondri isolati. Tuttavia, queste tecniche sono meno fisiologicamente rilevanti rispetto alla misurazione dell'OCR in fette di cervello acute. Per superare questa limitazione, gli autori hanno sviluppato un nuovo metodo utilizzando un analizzatore Seahorse XF per misurare direttamente l'OCR in fette striatali acute di topi adulti. La tecnica è ottimizzata con particolare attenzione allo striato, un'area del cervello coinvolta nel PD e nella malattia di Huntington. L'analizzatore esegue un test di cellule vive utilizzando una piastra a 24 pozzetti, che consente la misurazione cinetica simultanea di 24 campioni. Il metodo utilizza pezzi circolari di fette di cervello striatale come campioni. Dimostriamo l'efficacia di questa tecnica identificando un OCR basale inferiore in fette striatali di un modello murino di PD. Questo metodo sarà di ampio interesse per i ricercatori che lavorano nel campo del PD e della Malattia di Huntington.
Introduzione
La disfunzione mitocondriale è stata implicata in diverse malattie neurologiche, tra cui il morbo di Parkinson (PD), la malattia di Huntington e il morbo di Alzheimer 1,2,3. I modelli PD come i topi e i ratti PINK1 knockout (KO) mostrano una funzione mitocondriale compromessa 4,5,6,7,8,9,10,11. I mitocondri isol....
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Protocollo
Tutte le procedure, compreso il lavoro sugli animali, sono state condotte secondo le linee guida nazionali e internazionali e sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Thomas Jefferson University. Sono stati utilizzati topi FVB/NTac maschi all'età di 3-14 mesi. I seguenti passaggi sono stati eseguiti in un ambiente non sterile, ma è necessario prestare attenzione per mantenere tutto il più pulito possibile.
NOTA: Il metodo qui presentato è stato stabilito e utilizzato nella ricerca riportata da Zhi et al.24. Gli esperimenti qui descritti hanno utilizzato un analizzatore di flusso extra....
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Risultati
Il primo passo di questo studio è stato quello di ottimizzare lo spessore della fetta e la dimensione del punzone utilizzati per asportare una sezione dello striato dalla fetta (Figura 3A). Una fetta di spessore di 150 μm e una dimensione del punzone di 1,5 mm hanno dato i migliori risultati determinati dall'efficienza di accoppiamento (Figura 3B-C). Come mostrato nella Figura 3B, l'OCR è relativame.......
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Discussione
Il metodo che abbiamo sviluppato ha permesso di utilizzare un analizzatore XF per misurare l'OCR in fette striatali di topi adulti in un arco di tempo di 4 ore. Questo metodo fornisce un nuovo modo per misurare la bioenergetica cellulare in pugni asportati da strutture cerebrali anatomicamente definite. Poiché i campioni di tessuto analizzati sono piuttosto piccoli, è possibile studiare i parametri metabolici di specifiche aree cerebrali coinvolte in una malattia. Inoltre, l'uso di fette acute imita più da vicino l'ambie.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Wangchen Tsering e Pamela Walter per la lettura critica e l'editing di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773 a C.J. L. e NS098393 a H.Z.) e dal Dipartimento di Neuroscienze della Thomas Jefferson University (Startup Funds to H.Z.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Accumet AB150 Misuratore di pH da banco | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | Per misurare il pH |
| dell'antimicina A da streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | Per inibire il complesso III dei mitocondri |
| Albumina sierica bovina (BSA) | SIGMA | A6003 | Per produrre liquido cerebrospinale artificiale modificato (BSA-ACSF) |
| Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi) fenilidrazone (FCCP) | SIGMA | C2920 | Per disaccoppiare la respirazione mitocondriale |
| D-glucosio | SIGMA | G8270 | Per produrre liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | Per dissovle composti |
| HEPES | SIGMA | H3375 | Per produrre liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) |
| Incubatore umidificato senza CO2 | Fisher Scientific | 11-683-230D | Per idratare le piastre a 37 ° C |
| Oligomicina da Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | Per inibire l'ATP sintasi mitocondriale |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | film sigillante | |
| Rotenone | Tocris | 3616 | Per inibire il complesso I dei mitocondri |
| Seahorse XF Soluzione calibrante 500 mL | Seahorse Bioscience | 103681-100 | Soluzione per la calibrazione del cavalluccio marino |
| Analizzatore di flusso extracellulare Seahorse XF | Seahorse Bioscience | Apparecchiatura utilizzata per analizzare il tasso di consumo di ossigeno, | |
| analizzatore di flusso extracellulare Seahorse XFe24 | Seahorse Bioscience | Apparecchiatura utilizzata per analizzare il tasso di consumo di ossigeno, | |
| cavalluccio marino di nuova generazione XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Pacchetto di cartucce per sensori analizzatori di flusso, piastre per colture tissutali, schermi di acquisizione, soluzione calibrante e piastre di calibrazione; kit di analisi. |
| Piruvato di sodio | SIGMA | P2256 | Per evitare qualsiasi vincolo limitante l'alimentazione del substrato |
| Punzoni per biopsia in acciaio inossidabile Miltex | Dispositivo utilizzato per perforare le fette | ||
| Piatto sterile per colture cellulari, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Utilizzato per il punzone a fette |
| Vibratomo | Leica | VT1200 | Per affettare il tessuto cerebrale |
| Bagno | d'acquaThermo Scientific Precision | 282-115 | Per riscaldare tampone e soluzioni |
Riferimenti
- Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondria....
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Ristampe e permessi
